Страйер Л. Биохимия. Том 3

Подождите немного. Документ загружается.

ковые пробирки с образцами протыкали

снизу и собирали фракции по каплям для

дальнейшего анализа.

В результате были обнаружены три по-

лосы (рис. 25.6). Полоса с наибольшей

плотностью соответствовала одноцепочеч-

ной РНК. Вторая полоса соответствовала

двухспиральной ДНК. Третья располага-

лась вблизи от полосы ДНК и состояла из

двухцепочечных гибридных молекул

ДНК—РНК. Итак, Т2-мРНК образовыва-

ла гибрид с Т2-ДНК. В отличие от этого

Т2-РНК не гибридизовалась с ДНК мно-

гих бактерий и неродственных вирусов, да-

же если их нуклеотидный состав был подо-

бен Т2-ДНК. Последующие эксперименты

показали, что фракция мРНК из незара-

женных клеток гибридизуется с ДНК

именно того организма, из которого она

была выделена, но не с ДНК нерод-

ственных организмов. Эти убедительные

эксперименты продемонстрировали, что

последовательность оснований мРНК ком-

плементарна последовательности ДНК-ма-

трицы. К тому же был разработан

мощный метод, с помощью которого мож-

но было исследовать поток генетической

информации в клетках и выяснять, сходны

ли две молекулы нуклеиновой кислоты.

25.6. Рибосомные РНК и транспортные

РНК также синтезируются на

ДНК-матрице

Метод гибридизации был использован за-

тем, чтобы выяснить, синтезируются ли

рРНК и тРНК также на ДНК-матрицах.

Образование гибридов РНК—ДНК выяв-

ляли с помощью фильтров, а не центрифу-

гированием в градиенте плотности, так как

этот метод проще, чувствительнее и тре-

бует меньше времени. Одноцепочечные

РНК проходят через нитроцеллюлозный

фильтр, а двухспиральные ДНК и гибриды

РНК—ДНК задерживаются на фильтре.

РНК Е. coli пометили изотопом

Р и сме-

шали с немеченой ДНК Е. coli. Эту смесь

нагревали, медленно охлаждали и затем

отфильтровывали через нитроцеллюлозу.

Радиоактивность, задержанную на филь-

тре, просчитывали. Результаты экспери-

ментов не вызывали сомнений: гибриды

РНК—ДНК образовывались со всеми

рРНК (5S, 16S и 23S) и тРНК. Отсюда сле-

довало, что в геноме Е. coli имеются после-

довательности, комплементарные этим мо-

лекулам РНК.

Рис. 25.6. РНК, образовавшаяся после

заражения E. coli фагом Т2,

комплементарна вирусной

ДНК. В этих экспериментах по

гибридизации РНК метили

Р, а ДНК фага Т2 -

Н. Рас-

пределение радиоактивности

в градиенте плотности хлори-

стого цезия показывает, что

большая часть РНК, синтези-

рованной после заражения, по-

падает в одну полосу с ДНК

фага Т2. (Spiegelman S., Hybrid

nucleic acids, Sci. Amer., 1964.)

Рис. 25.7. Электронная микрофотогра-

фия РНК-полимеразы E. coli.

(Печатается с любезного разре-

шения д-ра Robley Williams

и д-ра Michael Chemberlin.)

25. Информационная РНК

и транскрипция

Рис. 25.8. Механизм реакции элонгации

цепи, катализируемой РНК-по-

лимеразой.

25.7. Все клеточные РНК синтезирует

РНК-полимеразa

Концепция мРНК стимулировала поиски

фермента, который синтезирует РНК в со-

ответствии с последовательностью ДНК-

матрицы. Стратегия эксперимента была

такой же, как и при поиске ДНК-полиме-

разы I. В 1960г. Джерард Хёрвиц и Сэ-

мюэл Вейсс (Jerard Hurwitz, Samuel Weiss)

независимо открыли такой фермент. Они

назвали его РНК-полимеразой. Ферменту

из клеток Е. соli (рис. 25.7) нужны были

для синтеза РНК следующие компоненты.

1. Матрица. Предпочтительная матри-

ца - двухцепочечная ДНК. Одноцепочечная

ДНК также может служить матрицей. Ни

РНК (как одноцепочечная, так и двухцепо-

чечная), ни гибриды РНК—ДНК не могут

служить эффективными матрицами.

2. Активированные предшественники. Не-

обходимы все четыре рибонуклеозидтри-

фосфата - ATР, GTP, UTP и СТР.

3. Двухвалентные ионы металлов. Фер-

мент активен в присутствии Mg

или

. In vivo эту потребность фермента

удовлетворяет Mg

РНК-полимераза катализирует инициа-

цию и элонгацию цепей РНК. Фермент ка-

тализирует следующую реакцию:

(РНК)

остатков

Рибонуклеозидтрифос-

фат

(РНК)

+ 1

остаток

Часть IV.

Информация

Синтез РНК во многих отношениях

подобен синтезу ДНК (рис. 25.8). Во-

первых, как будет вскоре показано более

подробно, синтез идет в направлении 5'—>

—>3'. Во-вторых, по-видимому, механизм

элонгации сходен. Происходит нуклео-

фильная атака внутреннего фосфата оче-

редного нуклеозидтрифосфата 3'-ОН-груп-

пой на конце растущей цепи. В-третьих,

движущая сила синтеза - гидролиз пиро-

фосфата.

Однако по некоторым важным особен-

ностям синтез РНК отличается от синтеза

ДНК. Во-первых, РНК-полимеразе не нуж-

на затравка. Во-вторых, ДНК-матрица при

синтезе РНК полностью сохраняется, тог-

да как при синтезе ДНК она сохраняется

лишь наполовину. В-третьих, РНК-полиме-

раза, насколько известно, не обладает ни-

какими нуклеазными активностями.

Все три типа клеточной РНК Е.

coli - мРНК, тРНК и рРНК - синтезируют-

ся одной РНК-полимеразой в соответствии

с инструкциями, заданными ДНК-матри-

цей. В клетках млекопитающих имеет ме-

сто разделение труда между несколькими

видами РНК-полимераз. Кроме того, необ-

ходимо отметить, что некоторые вирусы

кодируют РНК-синтезирующие ферменты,

совершенно отличные от ферментов клет-

ки-хозяина. Таковы, например, РНК-поли-

мераза, кодируемая ДНК-содержащим фа-

гом Т7, и РНК-репликаза, кодируемая

РНК-содержащим фагом Qβ. Репликаза

фага Qβ является РНК-зависимой РНК-

полимеразой, так как она синтезирует

РНК не по ДНК-матрице, а по РНК

(гл. 30). Клеточные же ферменты, синтези-

5'-GCGGCGACGCGCAGUUAAUCCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-3' мРНК

3'-CGCCGCTGCGCGTCAATTAGGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAA-5'

ДНК

5'-GCGGCGACGCGCAGTTAATCCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTT-3'

Рис. 25.9. Последовательность основа-

ний мРНК комплементарна

последовательности матрич-

ной ДНК. Показана часть по-

следовательности триптофано-

вого оперона.

рующие РНК, наоборот, представляют со-

бой ДНК-зависимые РНК-полимеразы.

25.8. РНК-полимераза получает инструкции

от ДНК-матрицы

Подобно ДНК-полимеразам, описанным

в предыдущей главе, РНК-полимераза ис-

пользует информацию, содержащуюся

в ДНК-матрице. Первым доводом в поль-

зу этого утверждения послужили данные

о том, что нуклеотидный состав новосин-

тезированной РНК комплементарен соста-

ву матричной цепи ДНК. Если в качестве

матрицы использовать синтетический по-

лидезоксирибонуклеотид poly(dT), содержа-

щий только остатки тимидиловой кислоты,

то в синтезируемую полирибонуклеотид-

ную цепь включается только один рибону-

клеозидтрифосфат - АТР. Продукт реак-

ции - полирибоаденилат [сокращенное обо-

значение poly(rA)]. Если в качестве ма-

трицы для РНК-полимеразы используется

сополимер с чередующимися основаниями

poly(dA-dT), то включаются UTP и АТР,

а в качестве продукта реакции образуется

poly(rA-rU). Нуклеотидный состав РНК,

синтезированной с использованием в каче-

стве матрицы одноцепочечной ДНК фага

φХ174, также свидетельствует о наличии

комплементарности между РНК-продук-

том и ДНК-матрицей (табл. 25.2). Экспери-

менты по гибридизации показывают, что

РНК, синтезированная РНК-полимеразой,

Таблица 25.2. Нуклеотидный состав РНК, синтезиро-

ванной на вирусной ДНК в качестве матрицы

ДНК-матрица (плюс-цепь фага

φХ174)

0.25

0,33

0,24

0,18

РНК-продукт

0,25

0,32

0,23

0,20

комплементарна матричной ДНК. Наибо-

лее убедительный довод в пользу надежно-

сти копирования ДНК при транскрипции

получен при изучении последовательности

оснований; оказалось, что последователь-

ность мРНК в точности комплементарна

последовательности матричной ДНК

(рис. 25.9).

25.9. Обычно в данном участке генома

транскрибируется только одна цепь ДНК

Транскрибируются ли обе цепи двухспи-

ральной матричной ДНК, или только од-

на? А priori кажется маловероятным, что

в одном и том же участке ДНК обе цепи

кодируют функциональные белки. Один из

первых ответов на этот вопрос был полу-

чен при использовании метода гибридиза-

ции в опытах с Е. coli, зараженной фагом

φХ174. Частицы фага φХ174 содержат

одноцепочечную ДНК, которую называют

Рис. 25.10. Как показывает этот гибриди-

зационный эксперимент, толь-

ко одна цепь РФ-ДНК фага

φХ174 используется в качестве

матрицы при транскрипции.

25. Информационная РНК

и транскрипция

Рис. 25.11. Электронная микрофотогра-

фия, на которой виден процесс

транскрипции. [Miller О. L.,

Hamkalo В. A., Visualization of

RNA synthesis on chromosomes,

Int. Rev. Cytol., 33, 1 (1972).]

плюс-цепью. После того как плюс-цепь

проникает в бактерию, синтезируется ком-

плементарная минус-цепь, и в результате

образуется кольцевая двухцепочечная мо-

лекула ДНК, называемая репликативной

формой (РФ). Эта РФ-ДНК направляет

синтез мРНК, которая в свою очередь де-

терминирует фаговые белки. Вскоре после

заряжения E. coli фагом φХ174 в среду до-

бавляли

Р-фосфат; так получили ра-

диоактивную фаговую РНК. Ее выделили.

Кроме того, РФ-ДНК разделили на соста-

вляющие плюс- и минус-цепи, что нетруд-

но сделать, поскольку они различаются по

нуклеотидному составу и, следовательно,

по плавучей плотности. Затем осуществили

гибридизацию, с тем чтобы выяснить, ком-

плементарна ли новосинтезированная

мРНК плюс-цепи, или минус-цепи, или же

обеим цепям. Был получен однозначный

результат: только минус-цепь РФ-ДНК

образовывала гибрид с меченой мРНК.

Итак, только одна цепь РФ-ДНК фага

Часть IV.

Информация

φХ174 служит in vivo матрицей для тран-

скрипции.

Точно так же только одна цепь таких ви-

русов, как Т7, SP8 и α, транскрибируется in

vivo. В случае таких вирусов, как фаги Т4

или λ, ситуация сложнее. В одних участках

генома матрицей служит одна цепь, в дру-

гих - другая. Такая же транскрипция с пере-

меной матрицы в различных группах генов

происходит и в клетках Е. coli.

25.10. РНК-полимераза Е. coli состоит из

субъединиц

РНК-полимераза Е. coli - очень большой

и сложный фермент. Масса целого фермен-

та равна примерно 500 кДа. РНК-полиме-

раза состоит из отдельных субъединиц

(табл. 25.3); это можно доказать, вызвав

диссоциацию фермента в концентрирован-

ном растворе мочевины. Субъединичный

состав целого фермента, называемого го-

лоферментом,- α

ββ'σ. Как это видно из

Таблица 25.3. Субъединицы РНК-полимеразы E.coli

Обозначение

субъединицы

β'

Число

субъединиц

Масса, кДа .

155

165

Рис. 25.12. Электронная микрофотогра-

фия РНК-полимеразы-голо-

фермента, связанного со мно-

гими промоторными участка-

ми фрагмента ДНК фага Т7.

[Williams R.C., Ргос. Nat. Acad.

Sci., 74, 2313 (1977).]

последующего текста, после того как ини-

циация синтеза РНК произошла, σ-субъе-

диница отделяется от фермента. РНК-по-

лимераза без σ-субъединицы называется

минимальным ферментом или кор-фермен-

том (α

ββ'). Каталитический участок РНК-

полимеразы находится в кор-ферменте.

Установлено, что β'-субъединица участвует

в связывании с ДНК-матрицей, а β-субъе-

диница - в связывании субстратов - рибону-

клеозидтрифосфатов. σ-Субъединица голо-

фермента участвует в выборе участка

инициации транскрипции.

Синтез РНК РНК-полимеразой Е. coli

происходит в три этапа, называемых

1) инициация, 2) элонгация и 3) термина-

ция. С этими процессами мы познакомим-

ся несколько ниже.

25.11. Транскрипция инициируется на промо-

торных участках матричной ДНК

Транскрипция начинается в определенных

участках матричной ДНК, называемых

промоторами. Как РНК-полимераза нахо-

дит эти участки? Один из подходов к ре-

шению этой проблемы состоит в том,

чтобы выделить те фрагменты, которые

голофермент РНК-полимеразы защищает

от расщепления панкреатической дезокси-

рибонуклеазой, и определить в этих фраг-

ментах последовательность нуклеотидов.

Другой подход сводится к тому, чтобы ис-

следовать ряд мутантов с повышенной или

пониженной интенсивностью транскрипции

определенных генов. В результате таких

исследований было установлено, что про-

моторные участки состоят примерно из со-

рока пар оснований, что соответствует

фрагменту ДНК длиной примерно 140 А.

Как показал анализ различных промото-

ров Е. coli и фагов, функцию сигнала узна-

вания в основном выполняет последова-

тельность семи пар оснований, середина

которой находится на расстоянии пример-

но 10 нуклеотидов перед точкой, с которой

начинается кодирование мРНК (рис. 25.13).

Второй участок узнавания расположен на

расстоянии около 35 нуклеотидов перед

точкой начала мРНК; он также участвует

в первоначальном связывании РНК-поли-

меразы.

25.12. σ-Субъединица обеспечивает

узнавание промоторных участков РНК-

полимеразой

Кор-фермент (α

ββ') РНК-полимеразы не

может начинать транскрипцию в промо-

торных участках. Для специфической ини-

циации необходим голофермент α

ββ'σ

Роль сигма-субъединицы была открыта

следующим образом. Если РНК-полимера-

зу очищали хроматографией на колонке

с фосфоцеллюлозой, то она была практи-

Рис. 25.13. Промоторные последователь-

ности лактозного (А), галактоз-

ного (Б) и триптофанового (В)

оперонов E.coli, фагов λ (Г)

и φХ174 (Д) и вируса SV-40 (Е).

Предполагаемая область го-

мологии, так называемая по-

следовательность Прибнова

(Pribnow), показана зеленым.

25. Информационная РНК

и транскрипция

Рис. 25.14. Разделение РНК-полимеразы

на σ-субъединицу и кор-фер-

мент (минимальный фермент;

ββ')

на

колонке

фосфоцел-

люлозой.

чески лишена активности при использова-

нии в качестве матрицы ДНК фага Т4, но

сохраняла активность в опытах с ДНК из

тимуса теленка. Наряду с этим та же РНК-

полимераза, очищенная центрифугирова-

нием в градиенте концентрации глицерола,

была, напротив, весьма активна на обеих

матрицах. Из этого наблюдения можно

было сделать вывод, что в препарате РНК-

полимеразы, очищенной на фосфоцеллю-

лозе, не хватает какого-то фактора. Так оно

и было (рис. 25.14). Активность фермента,

очищенного на фосфоцеллюлозе, значи-

тельно увеличивается при добавлении дру-

гой фракции, элюирующейся с колонки.

Этот стимулирующий фактор сам по себе

не обладает каталитической активностью.

Он был назван сигма (σ)-фактором. После-

дующие эксперименты показали, что фер-

мент, очищенный на фосфоцеллюлозе,

лишен σ-субъединицы, тогда как фермент,

очищенный в глицероле, содержит ее. Та-

ким образом, препарат, проявлявший мак-

симальную активность при использовании

в качестве матрицы ДНК фага Т4, предста-

влял собой голофермент α

ββ'σ а кор-фер-

мент α

ββ' был не в состоянии транскриби-

ровать эту ДНК. Добавление σ-субъеди-

ницы к кор-ферменту приводило к рекон-

струкции вполне активного голофермента.

Кор-фермент обладал способностью тран-

скрибировать ДНК тимуса теленка, так

как эта матрица содержит много одноце-

почечных разрывов. РНК, синтезированная

кор-полимеразой in vitro, не соответствует

транскриптам, образующимся in vivo.

В частности, кор-фермент транскрибирует

Часть IV.

Информация

обе цепи фаговых ДНК-матриц, тогда как

голофермент транскрибирует асимметрич-

но одну цепь, как он это делает in vivo.

Сигма-субъединица обеспечивает специ-

фическую инициацию, снижая в 10

раз

сродство РНК-полимеразы к ДНК, не

содержащей промоторов. Кроме того, сиг-

ма-субъединица активирует узнавание про-

моторных последовательностей РНК-поли-

меразой. Наконец, сигма-субъединица уча-

ствует в раскрывании двойной спирали

ДНК, так чтобы одна из цепей могла слу-

жить матрицей. При связывании голофер-

мента РНК-полимеразы расплетается при-

мерно один виток спирали ДНК. Так

происходит подготовка фермента к обра-

зованию первой фосфодиэфирной связи но-

вой цепи РНК.

После того как начинается синтез новой

цепи РНК, сигма-субъединица отделяется

от голофермента. Кор-фермент продол-

жает транскрибировать матрицу ДНК. Та-

ким образом, функция голофермента —

поиск промотора и инициация, а функция

кор-фермента - элонгация. Отделившаяся

сигма-субъединица присоединяется к дру-

гой молекуле кор-полимеразы, чтобы уча-

ствовать в инициации нового цикла тран-

скрипции.

Инициация новых цепей РНК регули-

руется многими способами. Некоторые

промоторные последовательности обеспе-

чивают высокую эффективность инициа-

ции, другие менее эффективны. Кроме то-

го, эффективность инициации регулируется

белками, которые связываются с самим

промоторным участком или рядом с ним.

Репрессоры блокируют транскрипцию,

препятствуя связыванию РНК-полимеразы,

а факторы положительной регуляции спо-

собствуют инициации, облегчая связывание

РНК-полимеразы. Эти важные регуля-

торные механизмы мы рассмотрим под-

робнее в гл. 28.

25.13. Цепи РНК начинаются с pppG или

рррА

Большинство новосинтезированных цепей

РНК содержат своего рода ярлычок, ко-

торый показывает, с чего начался их син-

тез. Новые цепи РНК имеют строго опре-

деленную структуру 5'-конца: молекула

начинается либо с рррА, либо с pppG. В от-

личие от синтеза ДНК затравка в этом

случае не нужна. Цепи РНК могут обра-

зовываться de novo.

Этот ярлычок на 5'-конце был открыт

двумя способами. Было обнаружено, что

цепи РНК включают

Р, если инкуба-

ционная смесь содержит меченный по

γ-атому

Р-АТР. Очевидно, что включен-

ная метка должна быть локализована на

конце, так как только α-атом фосфора ну-

клеозидтрифосфата может участвовать

в образовании внутренних фосфодиэ-

фирных мостиков РНК. Кроме того, при

щелочном гидролизе новосинтезированной

РНК образуются продукты трех типов: ну-

клеозиды, нуклеозид-2'-монофосфаты (или

нуклеозид-3'-монофосфаты) и нуклеозид-

тетрафосфаты (рис. 25.15). Если в ка-

честве субстрата использовали γ-

Р-АТР,

образовывался аденозин-3'-фосфат-5'-три-

фосфат. γ-Атом фосфора этого нуклео-

зидтетрафосфата содержал метку. Анало-

гичный результат был получен с γ-

P-GTP.

Однако, если взять γ-меченный СТР или

UTP, радиоактивность не включается.

Следовательно, новообразованная цепь

РНК имеет трифосфатную группу на

5'-конце и свободную ОН-группу на 3'-конце.

25.14. Цепи РНК синтезируются

в направлении 5'—>3'

В каком направлении синтезируется РНК?

В направлении 5'—>3' или 3'—>5'? Два

противоположных механизма роста цепи

проиллюстрированы на рис. 25.16. При ро-

сте в направлении 5'—>3' трифосфатный

конец образуется в начале роста цепи,

а при росте 3'—>5' трифосфатный конец

появляется с последним включенным

остатком. Кинетика включения радиоак-

тивности в РНК, синтезированную из

γ-

P-GTP (или АТР), указывает, какая из

этих возможностей имеет место. Если в ка-

честве субстрата использовать γ-

P-GTP,

то отношение включения

Р к общему

включению нуклеотидов в продукт дости-

гает максимума очень быстро после сме-

шивания компонентов, а затем постепенно

снижается во времени. При этом общая ра-

диоактивность уже помеченной РНК не

снижается при последующем добавлении

большого избытка нерадиоактивного GTP

в инкубационную смесь. Таким образом,

Р включается в молекулу РНК в начале

синтеза, а не в конце. Следовательно, рост

цепи РНК идет в направлении 5'—>3', как

при синтезе ДНК.

Кор РНК-полимеразы движется вдоль

цепи матричной ДНК в направлении 3'—>

—>5', так как матричная цепь антипарал-

лельна новосинтезированной цепи ДНК.

Одна и та же молекула РНК-полимеразы

синтезирует весь транскрипт - иными сло-

вами, транскрипция процессивна. По мере

того как расплетается очередной участок

ДНК, транскрибированный участок восста-

навливает свою двухспиральную конфор-

мацию. Максимальная скорость элонгации

составляет примерно 50 нуклеотидов

в секунду.

Необходимо подчеркнуть, что РНК-по-

лимераза не обладает нуклеазной актив-

Рис. 25.15. Продукты щелочного гидроли-

за цепи РНК, меченной с по-

мощью γ-

Р-АТР.

25. Информационная РНК

и транскрипция

Рис. 25.16. Предполагаемое положение

Р-метки в случае роста в на-

правлении 5'—>3' и 3'—>5'. На-

блюдаемое в действительности

положение метки показывает,

что РНК синтезируется в на-

правлении 5'—>3'.

ностью. В отличие от ДНК-полимеразы

РНК-полимераза не проверяет правильно-

сти новообразованной полинуклеотидной

цепи. В связи с этим надежность тран-

скрипции значительно ниже, чем надеж-

ность репликации. Частота ошибок при

синтезе РНК составляет примерно одну

ошибку на 10

—10

нуклеотидов, что в 10

раз выше, чем при синтезе ДНК. Гораздо

более низкую надежность синтеза РНК

клетка обходит тем, что с одного гена син-

тезируется много копий РНК-транскрип-

тов.

25.15. Матричная ДНК содержит стоп-сиг-

налы для транскрипции

Терминирование транскрипции регулирует-

ся так же тонко, как и инициирование.

В матричной ДНК имеются стоп-сигналы,

которые были расшифрованы путем срав-

нения различных последовательностей ос-

нований в этих участках. Все они имеют

одну общую особенность: вслед за GC-бо-

гатой областью перед участком термина-

ции располагается АТ-богатая последова-

тельность. Отличительная особенность

терминирующих последовательностей —

симметрия второго порядка этой GC-бога-

Часть IV.

Информация

той области (рис. 25.17). Следовательно,

РНК-транскрипт этой области самоком-

плементарен, а это значит, что он способен

к спариванию оснований, приводящему

к образованию структуры шпильки

(рис. 25.18). Кроме того, новообразованные

цепи РНК кончаются несколькими остат-

ками U, которые кодируются серией осно-

ваний А в АТ-богатой области ДНК-ма-

трицы. Одна или несколько подобных

структурных особенностей заставляют

РНК-полимеразу задержаться, сделать

паузу, когда она сталкивается с таким сиг-

налом. В некоторых участках терминации

новообразованные цепи РНК высвобо-

ждаются без участия дополнительных бел-

ков. В других местах для терминации цепи

необходимо участие белка ρ (ро).

25.16. Белок ρ участвует в терминировании

транскрипции

Тот факт, что терминирование транскрип-

ции в некоторых участках происходит

с участием белка ρ, подтверждается сле-

дующими данными: молекулы РНК, син-

тезированные in vitro в присутствии белка

ρ, короче молекул, полученных в его отсут-

ствие. Например, РНК, синтезированная на

ДНК фага fd в присутствии белка ρ, имеет

коэффициент седиментации 10S, тогда как

РНК, синтезированная в отсутствие бел-

ка ρ,- 23S. Дополнительные сведения о дей-

ствии белка ρ были получены при добавле-

нии этого фактора терминации в инкуба-

ционную смесь через различные промежут-

ки времени после начала синтеза РНК.

Если белок ρ добавляли через несколько

секунд, через 2 и 10 мин после инициации,

получали РНК с коэффициентами седимен-

тации 13, 17 и 23S соответственно. Этот ре-

Рис. 25.17. Последовательность ДНК,

соответствующая 3'-концу

trp-мРНК E.coli. Последова-

тельности оснований, пока-

занные желтым цветом, обла-

дают симметрией второго по-

рядка относительно оси, обо-

значенной зеленым цветом.

зультат свидетельствует о том, что матри-

ца содержит но крайней мере три участка

терминации, чувствительных к белку ρ (они

дают 10S-, 13S- и 17S-PHK), и один участок

терминации, не требующий белка ρ (дает

23S-PHK). Следовательно, специфическая

терминация может происходить и в отсут-

ствие белка ρ. Однако белок ρ выявляет

дополнительные сигналы терминации, ко-

торые сама по себе РНК-полимераза узна-

вать не может.

Каким образом белок ρ вызывает терми-

нацию синтеза РНК по достижении опре-

деленных сигналов терминации? Одна из

возможностей состоит в том, что этот бе-

лок-тетрамер с массой 200 кДа - садится

на РНК и движется по направлению к мо-

лекуле РНК-полимеразы, останавливая ее

на участке терминации. Согласно этой мо-

дели, белок ρ вытесняет РНК-полимеразу

с 3'-конца РНК, что приводит к высвобож-

дению РНК-транскрипта. Интересно отме-

тить, что при терминировании транскрип-

ции белок ρ гидролизует АТР.

Как можно было предвидеть, термини-

рование транскрипции некоторых генов

контролируется. В ходе дальнейшего изло-

жения мы увидим, что бактериофаг λ син-

тезирует белки-антитерминаторы, обеспе-

чивающие возможность транскрипции

и экспрессии некоторых генов (разд. 28.11),

У Е. coli действует система регуляции с ис-

пользованием специализированных терми-

нирующих сигналов, называемых атте-

нюаторами, для обеспечения пищевых по-

требностей клетки (разд. 28.9).

Рис. 25.18. Последовательность основа-

ний 3'-конца мРНК, транскри-

бированной с триптофанового

оперона E.coli. Возможно обра-

зование стабильной структуры

шпильки.

25. Информационная РНК

и транскрипция

Рис. 25.19. Влияние фактора ρ на размер

транскрибируемых РНК.

25.17. Многие молекулы РНК

после транскрипции расщепляются

и химически модифицируются

Образование функционально активных мо-

лекул РНК (процессинг) продолжается пос-

ле завершения транскрипции. У прокариот

молекулы транспортных и рибосомных

РНК образуются путем расщепления и хи-

мической модификации определенных ново-

синтезированных цепей РНК. Например,

у E.coli три вида молекул рибосомных

РНК и одна молекула транспортной РНК

вырезаются из первичного РНК-тран-

скрипта, который, кроме того, содержит

спейсерные (разграничивающие) участки

(рис. 25.20). Другие транскрипты содержат

по несколько различных видов тРНК или

несколько копий одной и той же тРНК.

Нуклеазы, которые расщепляют и укорачи-

вают эти предшественники рРНК и тPHK,

действуют с высокой точностью. Напри-

мер, рибонуклеаза Р образует правильные

5'-концы всех молекул тРНК в клетке Е.

coli. Рибонуклеаза III вырезает предше-

ственники 5S-, 16S- и 23S-pPHK из первич-

ного транскрипта, расщепляя опреде-

ленные связи в двухспиральных шпи-

лечных областях. Молекулы мРНК у про-

кариот, наоборот, практически не претер-

певают модификации. Более того, многие

из них транслируются еще до того, как за-

канчивается их транскрипция. В то же вре-

мя некоторые вирусные мРНК (например,

мРНК фага Т7) расщепляются рибонуклеа-

зой III раньше, чем начинается трансляция.

Часть IV.

Информация

Второй тип процессинга - присоединение

нуклеотидов к концам некоторых РНК.

Например, последовательность ССА при-

соединяется к 3'-концам молекул тРНК.

которые еще не обладают этой конце-

вой последовательностью. У эукариот к

3'-концу большинства молекул мРНК

присоединяется длинная последователь-

ность poly(A), а метилированный нуклео-

тид G (так называемый «колпачок», или

«кеп») - к 5'-концу (разд. 29.22).

Модификации оснований и рибозных

остатков представляют собой третий тип

процессинга. У эукариот одна 2'-гидрок-

сильная группа примерно на сто рибозных

остатков в рРНК ферментативно метили-

руется за счет S-аденозилметионина.

У бактерий в рРНК метилируются не

остатки рибозы, а основания. Особенно ин-

тересны необычные основания, которые

встречаются во всех молекулах тРНК

(разд. 27.3). Они образуются путем фер-

ментативной модификации обычных рибо-

нуклеотидов, входящих в состав предше-

ственника тРНК. Например, псевдоуриди-

лат и риботимидилат образуются путем

модификации уридиловых остатков после

транскрипции.