Страйер Л. Биохимия. Том 3

Подождите немного. Документ загружается.

кажущийся (при низкой разрешающей спо-

собности метода) рост одной из дочерних

цепей в направлении 3'—>5'?

Проблема была решена Рейдзи Оказаки

(Reiji Okazaki), который обнаружил, что зна-

чительная часть новосинтезированной

ДНК существует в виде коротких фрагмен-

тов. Такие фрагменты длиной около 1000

нуклеотидов (они называются фрагментами

Оказаки) существуют в течение непродол-

жительного времени в непосредственной

близости от репликационной вилки. По ме-

ре прохождения репликации эти фрагменты

соединяются друг с другом ковалентно под

действием ДНК-лигазы и образуют одну из

дочерних цепей (рис. 24.40). Другая новая

цепь синтезируется непрерывно или почти

непрерывно. Та цепь, которая образуется из

фрагментов Оказаки, называется отстаю-

щей цепью, а та, что синтезируется без раз-

рывов или почти без разрывов,- ведущей

цепью. И фрагменты Оказаки, и ведущая

цепь синтезируются в направлении 5'—>3'.

Прерывистая сборка отстающей цепи позво-

ляет путем полимеризации в направлении

5'—>3' на атомном уровне получать общий

рост цепи в направлении 3'—>5'.

24.20. Затравкой синтеза ДНК служит

РНК

Как начинается синтез ДНК? Напомним,

что всем ДНК-полимеразам для иницииро-

вания синтеза ДНК необходима затравка со

свободной 3'-ОН-группой. Что служит за-

травкой при синтезе ведущей цепи и фраг-

ментов Оказаки? Важным толчком к реше-

нию этого вопроса послужило наблюдение,

что для инициации синтеза ДНК необходим

синтез РНК. На основе этого открытия бы-

ло высказано предположение, что РНК, оче-

видно, служит затравкой в синтезе ДНК, так

как уже было известно, что РНК-полиме-

разы способны начинать синтез цепей de

novo. Затем было показано, что новообра-

зующаяся ДНК ковалентно связана с ко-

ротким фрагментом РНК, который и слу-

жит затравкой. Итак, РНК-затравка

в синтезе ДНК.

По всей вероятности, репликация ДНК

в клетке E.coli происходит, как показано на

рис. 24.41.

1. Особая РНК-полимераза (ее называют

праймаза) синтезирует короткую цепь РНК

(примерно 10 нуклеотидов), комплементар-

ную одной из цепей ДНК-матрицы. В отли-

чие от ДНК-полимеразы праймаза не ну-

Рис. 24.40. Схематическое изображение

репликационной вилки. Обе це-

пи ДНК синтезируются в на-

правлении 5'—>3'. Ведущая

цепь синтезируется непрерыв-

но, а отстающая - в виде корот-

ких фрагментов (фрагменты

Оказаки).

Рис. 24.41. Инициация синтеза ДНК.

А - праймаза синтезирует ко-

роткую комплементарную

цепь РНК; Б - эта РНК служит

затравкой для синтеза новой

ДНК; В - РНК, входящая в со-

став новообразованной цепи,

гидролизуется, при этом обра-

зуется брешь, которая впослед-

ствии заполняется.

24. ДНК: генетическая роль,

структура и репликация

Рис. 24.42. Электронная микрофотогра-

фия хромосомы Е. coli, прикре-

пленной к двум фрагментам

клеточной мембраны. На ри-

сунке изображена одна интакт-

ная суперспирализованная мо-

лекула ДНК. [Delius H.,

Worcel A., J. Mol. Biol., 82, 108

(1974).]

ждается в затравке для синтеза полинуклео-

тида.

2. 3'-гидроксильная группа концевого ри-

бонуклеотида этой цепи РНК служит за-

травкой для синтеза ДНК под действием го-

лофермента ДНК-полимеразы III. Большая

часть новообразованной ДНК синтезирует-

ся этим мультисубъединичным комплексом.

3. РНК-компонент этого РНК-ДНК-ги-

брида гидролизуется под действием ДНК-

полимеразы I.

4. После удаления РНК из новообразо-

ванных цепей между фрагментами ДНК

остаются довольно обширные бреши. ДНК-

полимераза I, которая хорошо приспособле-

Часть IV.

Информация

на для синтеза ДНК на одноцепочечной ма-

трице, заполняет эти бреши.

Последние исследования показали, что

действию праймазы предшествует образо-

вание предзатравочного промежуточного

комплекса, состоящего как минимум из пяти

белков. Один из них - белок dnaB - может

передвигаться вдоль ДНК, используя энер-

гию гидролиза АТР. Белок dnaB может слу-

жить сигналом для активации праймазы.

Специфичность инициации очередного ци-

кла репликации может обеспечиваться бел-

ками, доставляющими белок dnaB точно

в область гена ilv, где находится точка нача-

ла репликации хромосомы E.coli. Время на-

чала репликации ДНК имеет критическое

значение, поскольку оно должно быть

скоординировано с делением клетки. И дей-

ствительно, бактериальная хромосома ассо-

циирована с впячиванием клеточной мем-

браны (рис. 24.42).

24.21. Энергия гидролиза АТР используется

для расплетания родительской ДНК

в области репликационной вилки

под действием белка rep

В 1953 г. Уотсон и Крик отмечали, что «рас-

крутить спираль - задача труднопреодоли-

мая». Исследования, проведенные в послед-

нее время, показали, что в клетке E.coli

Рис. 24.43. Каталитические активности

ДНК-гиразы.

в области репликационной вилки происхо-

дит активное расплетание родительской

двойной спирали под действием фермента —

белка rep. Поскольку энергия для расплета-

ния родительской ДНК высвобождается

при гидролизе АТР, белок гер называют хе-

ликазой. На разделение каждой пары осно-

ваний затрачиваются примерно две моле-

кулы АТР. Затем каждая из разделенных

цепей родительской ДНК взаимодействует

с несколькими молекулами белка, связываю-

щегося с одноцепочечной ДНК (ОЦ-связы-

вающий белок). Роль ОЦ-связывающего

белка - стабилизировать одноцепочечные

участки ДНК, образовавшиеся под дей-

ствием хеликазы, чтобы расплетенная

область могла функционировать в качестве

матрицы. ОЦ-связывающие белки назы-

вают также белками, дестабилизирующими

спираль (белки ДС), или плавящими белка-

ми.

24.22. ДНК-гираза вводит отрицательные

супервитки в родительскую ДНК, чтобы

облегчить ее расплетание

При расплетании ковалентно замкнутой

кольцевой молекулы ДНК возникают топо-

логические проблемы, так как расплетание

двойной спирали вызывает образование по-

ложительных супервитков в замкнутой мо-

лекуле. В области репликационной вилки

родительская ДНК вращается со скоростью

100 об/с - более чем в 100 раз быстрее, чем

обычная долгоиграющая пластинка. Чтобы

процесс расплетания продолжался, необхо-

димо снять эти положительные супервитки,

образовавшиеся в результате вращения.

Другими словами, необходимо наличие ка-

кого-то молекулярного шарнира. Недавно

Мартин Геллерт (Martin Gellert) установил,

что эту функцию выполняет ДНК-гираза.

Эта топоизомераза удаляет положи-

тельные супервитки, внося одноцепочечные

разрывы и затем заделывая фосфодиэфирные

связи в остове ДНК. АТР не требуется для

такой термодинамически выгодной релакса-

ции третичной структуры ДНК. Более того,

ДНК-гираза может активно вводить отри-

цательные супервитки в ковалентно замкну-

тую кольцевую ДНК за счет энергии гидро-

лиза АТР (рис. 24.43). Эти отрицательные

супервитки способствуют расхождению це-

пей родительской ДНК в области реплика-

ционной вилки

24.23. Сложность аппарата репликации,

по-видимому, необходима для обеспечения

очень высокой надежности

Существующие представления о молекуляр-

ном механизме репликации ДНК у E.coli

В этой главе автор называет ДНК-гиразой

два совершенно различных фермента. Один из

них - ДНК-гираза, способная вводить в ДНК

термодинамически невыгодные отрицательные

супервитки за счет энергии гидролиза АТР; дру-

гой - независимая от АТР ДНК-топоизомераза,

приводящая кольцевую молекулу ДНК в тер-

модинамически равновесное (релаксированное)

состояние. Это два совершенно различных бел-

ка: у них различные ингибиторы, потребности

в ионных условиях среды, механизм действия.

В репликации в качестве молекулярного шарни-

ра участвует ДНК-гираза.- Прим. перев.

24. ДНК: генетическая роль,

структура к репликация

Рис. 24.44. Схематическое изображение

ферментативных процессов

в области репликационной вил-

ки Е. coli. Фрагменты, отме-

ченные синим цветом, катали-

зируют инициацию, элонгацию

и сшивание (с помощью ДНК-

лигазы) цепей ДНК. (Коrn-

berg A., DNA replication,

W.H. Freeman and Co., 1980.)

представлены на рис. 24.44 и в табл. 24.2.

Поражает сложность взаимодействий мно-

жества белков, участвующих в этом процес-

се. Генетический анализ показывает, что

в репликации ДНК непосредственно уча-

ствует не менее 15 белков. Почему механизм

репликации ДНК столь сложен? В частно-

сти, почему синтез ДНК начинается с РНК-

затравки, которая затем удаляется? Если бы

ДНК-полимеразы могли начинать синтез

цепей de novo, в РНК-затравке не было бы

надобности. Однако такая способность бы-

ла бы несовместима с чрезвычайно высокой

точностью ДНК-полимераз. Напомним, что

ДНК-полимеразы, прежде чем образовать

новую фосфодиэфирную связь, проверяют

правильность предшествующей пары осно-

ваний. Эта функция редактирования суще-

ственно снижает частоту ошибок. РНК-по-

лимеразы, напротив, могут начинать синтез

цепей de novo, так как они не проверяют

Часть IV.

Информация

предыдущую пару оснований. Частота оши-

бок для них на несколько порядков вели-

чины выше, чем для ДНК-полимераз. Было

найдено остроумное решение этой про-

блемы: начинать синтез ДНК с полинуклео-

тида, синтезируемого с низкой надеж-

ностью, но отмечать его «временный»

характер, включив в его состав рибонуклео-

Таблица 24.2. Белки репликации Е. coli

Белок

dna В

Праймаза

rер

ДНК-связы-

вающий

ДНК-гираза

Голофермент

ДНК-полиме-

разы III

ДНК-полиме-

раза I

ДНК-лигаза

Функция

Дает возможность

праймазе иницииро-

вать синтез РНК

Синтезирует РНК-за-

травки

Расплетает двойную

спираль

Стабилизирует одно-

цепочечные участки

Вводит суперспираль-

ные витки

Синтезирует ДНК

Удаляет затравку и

заполняет бреши

Соединяет концы

ДНК

Масса,

кДа

~250

400

>300

109

Число

моле-

кул в

клетке

100

300

тиды. Затем ДНК-полимераза I вырезает

эти короткие последовательности РНК-за-

травок и замещает их последовательностью

ДНК, синтезированной с высокой надеж-

ностью. Создается впечатление, что многие

детали, усложняющие механизм реплика-

ции ДНК, предназначены для обеспечения

чрезвычайно высокой точности. Генетиче-

ский анализ показывает, что частота оши-

бок

составляет

одну

на

-10

считанных

пар оснований.

24.24. Повреждения ДНК постоянно

репарируются

Поскольку множество химических и физиче-

ских агентов вызывает в ДНК повреждения,

во всех клетках имеются специальные меха-

низмы для исправления этих повреждений.

Основания в ДНК могут изменяться и те-

ряться, фосфодиэфирные связи остова мо-

гут разрываться, а две цепи могут попереч-

но сшиваться друг с другом. Эти поврежде-

ния образуются под действием ионизирую-

щей радиации, ультрафиолетового облуче-

ния и различных химических веществ.

Многие повреждения в ДНК поддаются ис-

правлению, так как генетическая информа-

ция записана в обеих цепях двойной спира-

ли. Благодаря этому информацию, утрачен-

ную одной из цепей, можно извлечь из

другой цепи.

Один из наиболее хорошо изученных ме-

ханизмов репарации - вырезание пиримиди-

нового димера (рис. 24.45), который обра-

зуется при действии на ДНК ультрафиоле-

тового света. Соседние пиримидиновые

остатки в одной цепи ДНК могут в этих ус-

ловиях образовать ковалентную сшивку.

Такой пиримидиновый димер не уклады-

вается в двойную спираль, так что реплика-

ция и экспрессия генов оказываются блоки-

рованными до тех пор, пока повреждение не

будет удалено.

В осуществлении этого процесса важную

роль играют четыре ферментативные актив-

ности (рис. 24.46). Первая из них - УФ-специ-

фичная эндонуклеаза - находит место повре-

Рис. 24.45. Модель димера урацила, обра-

зованного под действием уль-

трафиолетового облучения.

Тиминовый димер имеет при-

мерно такую же структуру.

ждения и вносит одноцепочечный разрыв

вблизи от димера, обычно с 5'-стороны.

Участок, содержащий димер, выпячивается

из двойной спирали, что позволяет ДНК-по-

лимеразе I (или другой подобной полимера-

зе) провести репарационный синтез в напра-

влении 5'—>3'. Затравкой при этом служит

3'-конец разорванной цепи, а матрицей - ин-

тактная комплементарная цепь. Затем

область, где расположен пиримидиновый

димер, вырезается под действием 5'—>

—>3'-нуклеазной активности ДНК-полиме-

разы. Наконец, новосинтезированная цепь

и остаток той же цепи ДНК соединяются

ДНК-лигазой. Другой путь репарации-фо-

тохимическое расщепление пиримидиново-

го димера. Почти все клетки содержат фо-

тореактивирующий фермент, который уз-

нает димер и расщепляет его на исходные

основания, используя энергию поглощенно-

го синего света.

24.25. Рак кожи при золотистой ксеродерме

обусловлен нарушением нормальной

репарации ДНК

Золотистая ксеродерма (Xeroderma

pigmentosum) - редкое заболевание кожи

у людей. Оно наследуется как аутосомный

рецессивный признак. У гомозиготных

больных кожа крайне чувствительна к сол-

нечному и ультрафиолетовому свету. Серь-

езные поражения кожи наблюдаются уже

в детстве, а с возрастом они принимают все

более тяжелый характер. Кожа становится

сухой, и дерма в значительной степени атро-

24. ДНК: генетическая роль,

структура и репликация

Ксеродерма -

от греч. слов, означающих «сухая кожа». Этот термин был впервые использован

F. Hebra и М. Kaposi в 1874 г. для описания «пергаментной кожи» и аномаль-

ной пигментации, наблюдавшихся у одного из больных.

фируется. Появляются кератозы, веки по-

крываются рубцами, поражается роговица.

Обычно во многих местах возникает рак ко-

жи. Многие больные погибают, не достиг-

нув 30 лет, от метастазов этих злокаче-

ственных опухолей кожи.

В ДНК человека, как и у E.coli, под дей-

ствием ультрафиолетового света образуют-

ся пиримидиновые димеры. Более того, ме-

ханизмы репарации у человека и у E.coli,

по-видимому, сходны. Изучение фибробла-

стов кожи больных золотистой ксеродер-

мой показало, что одна из форм этой болез-

ни сопровождается биохимическим наруше-

нием. В нормальных фибробластах поло-

вина пиримидиновых димеров, образовав-

шихся под действием ультрафиолетового

облучения, вырезается менее чем за сутки.

В фибробластах же, полученных от больных

золотистой ксеродермой, за тот же проме-

жуток времени вырезания димеров почти не

наблюдается. Какой этап репарации нару-

шен? Ответ был получен путем определения

молекулярной массы цепей ДНК из фибро-

бластов, облученных ультрафиолетовым

светом. В нормальных клетках в течение не-

скольких часов после облучения происходит

заметное снижение молекулярной массы

одноцепочечной ДНК. Это снижение моле-

кулярной массы обусловлено первой реак-

цией процесса репарации, а именно расще-

плением цепи ДНК рядом с пиримиди-

новым димером. После УФ-облучения кле-

ток золотистой ксеродермы, наоборот, сни-

жения молекулярной массы не происходит.

Следовательно, это кожное заболевание,

возможно, вызвано инактивацией эндону-

клеазы, которая гидролизует остов ДНК ря-

дом с пиримидиновым димером. Тяжелые

клинические последствия этого фермента-

тивного нарушения свидетельствуют об ис-

ключительной важности процессов репара-

ции

ДНК.

24.26. ДНК содержит тимин вместо урацила,

что делает возможной репарацию

дезаминированного цитозина

Цитозин в ДНК спонтанно дезаминируется

с измеримой скоростью, образуя урацил.

Часть IV.

Информация

Дезаминирование цитозина является потен-

циально мутагенным, так как образующий-

ся урацил спаривается с аденином, и, следо-

вательно, одна из дочерних цепей будет

содержать AU-пару оснований вместо ис-

ходной GC-пары:

Эта мутация исправляется под действием

репарационной системы, узнающей чуже-

родный урацил в молекуле ДНК

(рис. 24.47). Прежде всего урацил-

ДНК—гликозидаза гидролизует гликозид-

ную связь остатка урацила с дезоксирибо-

зой. На этом этапе остов ДНК остается

интактным, но одно основание отсутствует.

Затем специфическая эндонуклеаза узнает

этот дефект и расщепляет остов рядом с от-

сутствующим основанием. ДНК-полимера-

за I вырезает оставшийся дезоксирибозо-

фосфат и вставляет цитозин, комплемен-

тарный гуанину в неповрежденной цепи.

Наконец, репарированная цепь заделывает-

ся ДНК-лигазой.

В течение многих лет оставалось загад-

кой, почему в ДНК присутствует тимин, а не

урацил, ведь оба основания спариваются

с аденином. Единственное различие между

ними - метильная группа тимина на месте

атома водорода при С-5 в урациле. Почему

это метилированное основание использует-

ся в ДНК, но не в РНК? Напомним, что на

метилирование дезоксиуридилата с образо-

ванием дезокситимидилата расходуется

много энергии (разд. 22.16). Открытие срав-

нительно недавно активной системы, репа-

рируюшей дезаминирование цитозина, слу-

жит убедительным ответом на эту загадку.

Урацил-ДНК—гликозидаза не удаляет

тимина из ДНК. Таким образом, метильная

группа тимина служит меткой, позволяю-

щей отличать его от дезаминированного ци-

тозина. Если бы этой метки не было, ура-

цил, стоящий на правильном месте, было бы

невозможно отличить от урацила, образо-

Рис. 24.46. Репарация участка ДНК, со-

держащего тиминовый димер,

в результате последовательно-

го действия специфической эн-

донуклеазы, ДНК-полимеразы

и ДНК-лигазы. Тиминовый ди-

мер показан синим цветом,

а новосинтезированный уча-

сток ДНК - красным. [На-

nawalt P.C, Endeavor, 31, 83

(1972).]

вавшегося в результате дезаминирования.

Дефект остался бы незамеченным, и в одной

из дочерних молекул ДНК неизбежно про-

изошло бы мутационное замещение одной

GC-пары на AU-пapy. Система репарации,

которая выискивает урацилы и оставляет

тимины, подавляет такие мутации. По всей

вероятности, тимин используется в ДНК

вместо урацила для увеличения надежности

генетической информации. В противопо-

ложность этому РНК не репарируется, и

в ней используется урацил, так как он пред-

ставляет собой менее дорогой строи-

тельный блок.

24.27. Рестриктирующие эндонуклеазы

совершили переворот в анализе ДНК

Ферменты рестрикции - эндонуклеазы, спо-

собные узнавать определенные последова-

тельности оснований в двухспиральной

ДНК и расщеплять обе цепи. Эти исключи-

тельно тонкие скальпели - великолепный

подарок природы биохимикам. Существо-

вание ферментов рестрикции позволило

проводить эксперименты, о которых нельзя

было даже и мечтать всего лишь несколько

лет назад. Они представляют собой незаме-

нимые инструменты для исследования

Рис. 24.47. Остатки уранила в ДНК выре-

заются и замещаются цитози-

ном - исходным основанием.

24. ДНК: генетическая роль,

структура и репликация

Палиндром (перевертыш) -

слово, предложение или стих, которые читаются одинаково слева направо

и справа налево.

Примеры:

Радар

То не ясли ломал, а молился енот.

А роза упала на лапу Азора.

Нажал кабан на баклажан.

Roma tibi subito motibus ibit amor.

Происходит от греческого слова palindromos - бегу назад.

структуры хромосомы, определения после-

довательности нуклеотидов в очень

длинных молекулах ДНК, выделения генов

и получения новых молекул ДНК для кло-

нирования. Разработку всех этих методов

начали Вернер Арбер, Гамилтон Смит и Дэ-

ниел Натанс (Werner Arber, Hamilton Smith,

Daniel Nathans).

Рестриктирующие эндонуклеазы обнару-

живаются у самых различных прокариот.

Биологическая роль этих ферментов со-

стоит в том, чтобы расщеплять чужеродные

молекулы ДНК. Собственная клеточная

ДНК при этом не расщепляется, так как

участки, узнаваемые своими ферментами

рестрикции, у нее метилированы. Взаимос-

вязь между ресткрикцией и модификацией

рассматривается в гл. 30 (разд. 30.9). Важ-

ное значение имеет тот факт, что многие

ферменты рестрикции узнают специфиче-

ские последовательности ДНК длиной от

четырех до шести пар оснований и гидроли-

зуют фосфодиэфирные связи в обеих цепях

в этой области. Удивительная особенность

таких участков расщепления - их симметрия

относительно оси вращения второго поряд-

ка. Другими словами, узнаваемая последо-

вательность пар оснований представляет со-

бой палиндром.

Расщепляемые участки расположены сим-

метрично относительно оси второго поряд-

ка. Например, фермент рестрикции из

Streptomyces achromogenes узнает последова-

тельность

Часть IV.

Информация

В каждой цепи эта эндонуклеаза рвет фос-

фодиэфирную связь между G и С, дисталь-

ную по отношению к оси симметрии. К на-

стоящему времени очищено и охарактеризо-

вано более 80 ферментов рестрикции. Их

названия состоят из сокращенного до трех

букв названия микроорганизма (например,

Есо от E.coli, Hin от Haemophilus influenzae,

Нае от H.aeguptins), обозначения штамма

и римской цифры. Специфичность неко-

торых ферментов показана на рис. 24.48.

Обратите внимание, что производимые в

двух цепях разрывы могут быть распо-

ложены либо со сдвигом относительно

друг друга, либо строго против друг

друга.

Ферменты рестрикции используются для

расщепления молекул ДНК на опреде-

ленные фрагменты, которые более удобны

для анализа и манипулирования, чем ис-

ходная молекула. Например, EcoRI расще-

пляет кольцевую двухцепочечную ДНК ви-

руса SV-40 длиной 5,1 kb только в одном

месте, Нра - в четырех местах и Hind - в 11

местах. Кусок ДНК, образованный одним

ферментом рестрикции, можно специфиче-

ски расщепить на более мелкие фрагменты

с помощью другого фермента. Используя

несколько ферментов рестрикции, можно

картировать хромосомы (разд. 31.8). Более

того, набор фрагментов, полученных с по-

мощью ферментов рестрикции, может слу-

жить своего рода «отпечатком пальца»

для соответствующей молекулы ДНК. Не-

большие различия между сходными моле-

кулами ДНК можно легко выявить с по-

мощью электрофоретического разделения

их рестрикционных фрагментов. Для каж-

дого данного геля электрофоретическая

подвижность фрагмента ДНК обратно

пропорциональна логарифму числа пар ос-

нований (до определенного предела длины

фрагментов). Для разделения фрагментов

ДНК длиной до 1000 пар оснований ис-

пользуют полиакриламидный гель, а для

Рис. 24.48. Специфичность некоторых эн-

донуклеаз рестрикции. После-

довательности пар оснований,

узнаваемые этими фермента-

ми, имеют ось симметрии вто-

рого порядка. Две цепи ДНК

в этой области симметричны

относительно оси, обозначен-

ной зеленым овалом. (Одна

цепь сдвинута относительно

другой на 180°.) Места расще-

пления показаны красными

стрелками. Сокращенные на-

звания каждого фермента ре-

стрикции приведены справа от

последовательности, которую

он узнает.

разделения более длинных молекул более

пористый агарозный гель. Если ДНК со-

держит радиоактивную метку, полосы

можно выявить методом радиоавтографии.

В другом случае гель можно покрасить

бромистым этидием, который при связыва-

нии с двухспиральной ДНК флуоресцирует

ярким оранжевым светом. При использо-

вании этого способа можно легко увидеть

полосу, содержащую 50 нг ДНК

(рис. 24.49). Помимо чувствительности,

важное достоинство таких гелей - их высо-

кая разрешающая способность.

24.28. Последовательность нуклеотидов

в ДНК можно быстро определить

с помощью специфического химического

расщепления

Появление надежных методов определения

последовательности нуклеотидов в моле-

кулы ДНК облегчило также изучение

структуры ДНК и ее связи с экспрессией

гена. Метод химического расщепления, раз-

работанный Алланом Максамом и Уолте-

ром Гилбертом (Allan Maxam, Walter

Gilbert), основан на использовании ДНК,

меченной

Р по одному из концов одной

из цепей. Для введения

Р в 5'-гидро-

ксильный конец обычно используют поли-

нуклеотидкиназу. Меченую ДНК расщеп-

ляют предпочтительно по одному из четы-

рех нуклеотидов. Условия реакции подби-

рают таким образом, чтобы на каждую

цепь приходился в среднем один разрыв.

Рис. 24.49. Электрофоретическое разделе-

ние фрагментов, образующих-

ся при расщеплении ДНК

SV-40 тремя различными фер-

ментами рестрикции. Эти

фрагменты флуоресцируют

благодаря тому, что гель окра-

шен бромистым этидием. (Пе-

чатается с любезного разреше-

ния д-ра Jeffrey Sklar.)

24. ДНК: генетическая роль,

структура и репликация

Частичное расщепление по каждому осно-

ванию дает набор радиоактивных фраг-

ментов, начинающихся

Р-меткой и кон-

чающихся одним из положений этого

основания. Например, если исследуемая

ДНК имеет последовательность

5'-

P-GCTACGTA-3'

то в результате специфического расщепле-

ния с 5'-стороны каждого из четырех осно-

ваний получатся следующие радиоак-

тивные фрагменты:

Затем эти фрагменты разделяют методом

электрофореза в полиакриламидном геле,

который дает возможность разделять мо-

лекулы ДНК, различающиеся по длине

всего лишь на один нуклеотид. Следую-

щий этап - радиоавтография этого геля.

Как показано на рис. 24.50, самая нижняя

полоса расположена на дорожке, соответ-

ствующей расщеплению по С, следую-

щая - на дорожке Т, затем еще одна - на

дорожке А. Следовательно, последователь-

ность первых трех нуклеотидов имеет вид

5'-СТА-3'. Если прочитать все семь полос

снизу вверх, получится последовательность

5'-CTACGTA-3'. Итак, радиоавтограф геля,

полученного после четырех различных реак-

ций химического расщепления, дает набор

полос, по которым можно непосредственно

прочитать нужную последовательность.

Как достигается специфическое расще-

пление ДНК? Для этого используют со-

единения, которые способны модифициро-

вать основание и затем отщеплять его от

остатка сахара (рис. 24.51). Пурины моди-

фицируют диметилсульфатом, метилирую-

щим гуанин по N-7 и аденин по N-3. Рас-

щепление гликозидной связи метилирован-

ного пурина легко достигается нагрева-

нием при нейтральном значении рН.

Часть IV.

Информация

В результате основание отделяется от со-

ответствующего остатка сахара. Затем

смесь нагревают в щелочи, что вызывает

расщепление сахарофосфатного остова

ДНК и удаление остатка сахара. В резуль-

тате образуются фрагменты, несущие на

конце метку. Эти фрагменты разделяют

в полиакриламидном геле и на радиоавто-

графе получают картину полосы различ-

ной интенсивности. Темные полосы со-

ответствуют фрагментам, образовавшимся

при расщеплении по гуанину, так как гуа-

нин метилируется гораздо быстрее, чем

аденин. В то же время гликозидная связь

в метилированном аденозине менее ста-

бильна, чем в метилированном гуанозине.

Поэтому при обработке разбавленной кис-

лотой после метилирования происходит

предпочтительное выщепление аденина

(получается дорожка А + G). Сравнение до-

рожки А + G с параллельной дорожкой

G на том же геле показывает, происходит

ли расщепление по А или по G (рис. 24.52).

Расщепление по цитозину и тимину прово-

дят гидразином. Остов затем расщепляют

Рис. 24.50. Схематическое изображение

геля, на котором показаны ра-

диоактивные фрагменты, обра-

зовавшиеся при специфиче-

ском расщеплении последова-

тельности 5'-

P-GCTACGTA-

3' по каждому из четырех осно-

ваний (дорожки A, G, С и Т).

Слева указано число нуклеоти-

дов (n) в каждом фрагменте.

Последовательность основа-

ний читается непосредственно

с геля снизу вверх.