Страйер Л. Биохимия. Том 3

Подождите немного. Документ загружается.

концентрации UDP. Сополимеры двух ри-

бонуклеотидов, например U и А, со слу-

чайной последовательностью готовили,

также инкубируя UDP и АТР с этим

ферментом.

Различные синтетические рибонуклео-

тиды вводили в бесклеточную систему син-

теза белка и измеряли включение меченно-

го

С L-фенилаланина. Результаты оказа-

лись поразительными:

Добавленный

полинуклеотид

Контроль

Poly(A)

Poly(С)

Poly(U)

С, имп./мин

39800

Тот же эксперимент был проделан

с различными

С-аминокислотами в ка-

ждой инкубационной смеси. Оказалось, что

poly(А) вызывает синтез полилизина,

a poly(С) - синтез полипролина. Так было

расшифровано три кодовых слова:

Кодовое слово

UUU

ААА

ССС

Аминокислота

Фенилаланин

Лизин

Пролин

Кодовое слово GGG невозможно было

расшифровать таким же образом, потому

что poly (G) не работает в качестве ма-

трицы. Возможно, это объясняется тем,

что он образует трехцепочечную спираль-

ную структуру. Полирибонуклеотиды,

образующие протяженные участки с упоря-

доченной структурой, не эффективны в ка-

честве матриц для синтеза белка.

26.4. Состав кодонов многих аминокислот

был определен с помощью сополимеров

в качестве матриц

Для дальнейшего изучения генетического

кода были использованы в качестве ма-

триц полирибонуклеотиды, состоящие из

оснований двух типов. Например, слу-

чайный сополимер U и G содержит восемь

Таблица 26.1. Ожидаемая встречаемость триплетов

в случайном сополимере U (0,76) и G (0,24)

Триплет

UUU

UUG

UGU

GUU

UGG

GUG

GGU

GGG

Вероятность

0,76•0,76•0,76=0,439

0,75•0,24•0,24 = 0,139

0,76•0,24•0,76 = 0,139

0,24•0,76•0,76 = 0,139

0,76•0,24•0,24 = 0,0438

0,24•0,76•0,24 = 0,0438

0,24•0,24•0,76 = 0,0438

0,24•0,24•0,24 = 0,0138

Относи-

тельная

встречае-

мость, %

100

31,6

10,0

3,1

различных триплетов: UUU, UUG, UGU,

GUU, UGG, GUG, GGU и GGG. Относи-

тельную частоту этих триплетов можно

легко вычислить, исходя из молярного со-

отношения U и G в сополимере. Оно со-

ставляло 0,76:0,24 (табл. 26.1). Относи-

тельное включение различных аминокис-

лот в присутствии этой матрицы приведе-

но в табл. 26.2. В наибольшей степени

включался, как и можно было предпола-

гать, фенилаланин, так как триплет UUU

встречался чаще всего. Затем шли валин,

лейцин и цистеин. Уровень их включения

составлял чуть больше трети от включения

фенилаланина, что соответствует вычис-

ленной частоте встречаемости триплетов,

содержащих два U и одно G. Включение

других аминокислот было очень низким.

Отсюда был сделан вывод, что валин, лей-

цин и цистеин кодируются кодонами, содер-

Таблица 26.2. Включение аминокислот в присутствии

случайного сополимера U (0,76) и G (0,24)

Аминокислота

Фенилаланин

Валин

Лейцин

Цистеин

Триптофан

Глицин

Относитель-

ное включе-

ние,

100

Состав соот-

ветствующего

кодона

UUU

2U, 1G

1U, 2G

26. Генетический код.

Зависимость гены-белки

жащими 2U и 1G, а триптофан и глицин

кодируются кодонами, которые содержат

1U и 2G.

Эксперименты того же типа проводили

и с другими случайными сополимерами,

а именно с UA, UC, АС и AG, а также

с UGC, AGC, UAC и UAG. Таким образом

в лабораториях Ниренберга и Очоа был

определен состав кодонов, соответствую-

щих каждой из 20 аминокислот.

26.5. Тринуклеотиды способствуют

связыванию определенных молекул тРНК

с рибосомами

При использовании смешанных сополиме-

ров в качестве матриц удалось установить

состав кодонов, соответствующих опреде-

ленным аминокислотам, но не их последо-

вательность (кроме UUU, ААА и ССС).

Как уже говорилось, валин кодируется

триплетом из 2U и 1G. Какой же это три-

плет: UUG, UGU или GUU? Ответ на

этот вопрос был получен с помощью двух

совершенно различных экспериментальных

подходов: во-первых, с использованием

синтетических полирибонуклеотидов с упо-

рядоченной последовательностью и, во-

вторых, с помощью зависимого от кодона

специфического связывания молекул тРНК

с рибосомами.

В 1964 г. Ниренберг установил, что три-

нуклеотиды способствуют связыванию

определенных молекул тРНК с рибосомами

в отсутствие синтеза белка. Например, до-

бавление pUpUpU вызывает связывание

фенилаланиновой тРНК, а рАрАрА значи-

тельно увеличивает связывание лизиновой

тРНК, как и рСрСрС - связывание проли-

новой тРНК. Динуклеотиды не стимули-

руют связывания тРНК с рибосомами. Эти

работы показали, что тринуклеотид (как

и триплет в мРНК) специфически связы-

вается с определенной молекулой тРНК,

для которой он является кодовым словом.

Был разработан простой и быстрый тест

на связывание: связанные с рибосомами

молекулы тРНК задерживаются на нитро-

целлюлозном фильтре, а несвязанные мо-

лекулы тРНК проходят через фильтр. Для

того чтобы определить, какие именно мо-

лекулы тРНК садятся на фильтр, исполь-

зовали молекулы тРНК, несущие опреде-

ленную аминокислоту, меченную

С.

С помощью методов органической хи-

мии и биохимии были синтезированы все

64 тринулеотида. Для каждого тринуклео-

тида было проверено связывание молекул

тРНК, соответствующих всем 20 амино-

кислотам. Например, было показано, что

pUpUpG стимулирует связывание только

лейциновой тРНК, pUpGpU - только ци-

стеиновой тРНК, a pGpUpU - связывание

только валиновой тРНК. Отсюда был сде-

лан вывод, что кодоны UUG, UGU

и GUU соответствуют лейцину, цистеину

и валину соответственно. С несколькими

кодонами не было получено избирательно-

го связывания какой-либо тРНК, тогда как

с несколькими другими связывалось более

одной тРНК. Для большинства кодонов

были получены вполне четкие результаты.

В общем этот простой и элегантный под-

ход позволил расшифровать около 50 ко-

донов.

26.6. Еще один инструмент расшифровки

кода - сополимеры с определенной

последовательностью

Примерно в то же время Гобинду Коране

(Gobind Khorana) удалось синтезировать

полирибонуклеотиды с определенной по-

вторяющейся последовательностью. Соче-

тая методы органической химии и фермен-

тативные методы, он синтезировал ряд

сополимеров с повторяющейся последова-

тельностью из двух, трех и четырех осно-

ваний. Рассмотрим, к примеру, стратегию

синтеза poly(GUA). Этот упорядоченный

сополимер имеет последовательность

GUAGUAGUAGUAGUAGUAGUAGUA...

Прежде всего Корана синтезировал с по-

мощью методов органической химии два

комплементарных дезоксирибонуклеотида

по девять нуклеотидов длиной: d(TAC)

d(GTA)

. Затем эти два олигонуклеотида

были использованы в качестве матрицы

для синтеза длинных цепей ДНК из четы-

рех дезоксинуклеозидтрифосфатов под дей-

ствием ДНК-полимеразы I. Ни один оли-

гонуклеотид в отдельности не был эффек-

тивной матрицей. Если же присутствовали

оба олигонуклеотида, то d(TAC)

служил

матрицей для синтеза poly(dGTA), a

d(GTA)

- для синтеза poly(dTAC). Эти

длинные комплементарные ДНК обра-

зовывали двухспиральные молекулы. Сле-

дующим шагом было получение длинных

Рис. 26.4. Цепь этой двухспиральной ма-

тричной ДНК, которая должна

транскрибироваться, опреде-

ляется набором рибонуклео-

зидтрифосфатов в инкубацион-

ной смеси.

полирибонуклеотидных цепей с последова-

тельностью, соответствующей poly (dTAC)

и poly(dGTA). Для этого дуплекс

poly(dTAC): poly(dGTA) использовали

в качестве матрицы для РНК-полимеразы.

Цепь ДНК для транскрипции можно вы-

брать, добавляя три подходящих рибону-

клеозидтрифосфата. Если в инкубацион-

ную смесь добавить GTP, UTP и АТР, го

на матричной цепи poly(dTAC) синтези-

руется полирибонуклеотидный продукт

poly(GUA). Другая цепь не транскриби-

руется, так как не хватает одного из необ-

ходимых субстратов - СТР. Если же доба-

вить СТР, UTP и АТР, то на другой

матричной цепи синтезируется poly(UAC).

Итак, органический синтез и вслед за ним

матричный синтез с помощью ДНК-поли-

меразы и РНК-полимеразы позволили син-

тезировать два длинных полирибонуклеоти-

да со строго определенной повторяющейся

последовательностью оснований (рис. 26.4).

Эти регулярные сополимеры были ис-

пользованы в качестве матриц в бесклеточ-

ной системе синтеза белка. Рассмотрим не-

которые результаты такого эксперимента.

Сополимер, состоящий из чередующейся

последовательности двух оснований - А

и Б:

АБА | БАБ | АБА | БАБ | АБА

. .

содержит кодоны двух видов - АБА и БАБ.

Поэтому полипептидный продукт должен

представлять собой чередующуюся после-

довательность из двух аминокислот (сокра-

щенно обозначенных ак

и ак

Стоит ли на N-конце полипептидного про-

дукта aк

или ак

, зависит от того, на-

чинается ли рамка считывания с А или с Б.

Если в качестве матрицы использовали

poly(UG), то синтезировался полипептид

из чередующихся валина (Val) и цистеина

(Суs):

UGU|GUG|UGU|GUG|UGU|GUG

Этот результат однозначно доказывал три-

плетность кода и показывал, что один из

триплетов - UGU или GUG - кодирует ци-

стеин, а другой - валин. В сочетании

с данными по связыванию тРНК было

очевидно, что UGU кодирует цистеин,

a GUG - валин. В присутствии некоторых

чередующихся сополимеров из двух осно-

ваний происходил синтез следующих поли-

пептидов:

Матрица

Poly(UC)

Poly(AG)

Poly(AC)

Продукт

Poly(Ser-Leu)

Poly(Arg-Gln)

Poly(Thr-His)

Смысл кодонов

Рассмотрим теперь матрицу, состоящую

из повторяющейся последовательности

трех оснований, поли(АБВ). Если рамка

считывания начинается с А, образующийся

полипептид должен содержать аминокис-

лоту только одного вида, кодируемую три-

плетом АБВ:

26. Генетический код.

Зависимость гены-белки

Если рамка считывания начинается с Б,

синтезирующийся полипептид должен со-

держать другую аминокислоту, кодируе-

мую триплетом БВА:

Если же рамка считывания начинается с В,

должен образовываться полипептид треть-

его типа, содержащий аминокислоту, коди-

руемую триплетом ВАБ:

Таким образом, предполагаемые про-

дукты - три различных гомополипептида.

Действительно, именно такой результат

получался в случае большинства матриц,

состоящий из повторяющейся последова-

тельности трех нуклеотидов. Например, на

poly(UUC) синтезировались полифенилала-

нин, полисерин и полилейцин. Этот резуль-

тат в сочетании с результатами других экс-

периментов показывал, что UUC кодирует

фенилаланин, UCU-серин и CUU-лейцин.

Полипептиды, которые синтезировались на

других матрицах этого типа, приведены

в табл. 26.3. Обратите внимание, что

в присутствии poly(GUA) и poly(GAU)

происходил синтез двух, а не трех гомопо-

Таблица 26.3. Гомополнпептнды, синтезирующиеся на

матрицах, которые состоят нз повторяющихся последова-

тельностей тринуклеотидов

Матрица

Poly(UUC)

Poly(AAG)

Poly(UUG)

PoIy(CCA)

Poly(GUA)

Poly(UAC)

Poly(AUС)

Poly(GAU)

Синтезирующиеся полипептиды

Phe; Ser;

Leu

Lys; Glu;

Arg

Cys; Leu;

Val

Gln; Thr;

Asn

Val;

Ser

Tyr; Thr;

Leu

Ile; Ser;

His

Met;

Asp

Часть IV.

Информация

липептидов. Причина этого явления станет

ясна чуть ниже.

Корана синтезировал также ряд сополи-

меров, состоящих из повторяющегося те-

трануклеотида, например poly(UAUC). На

этой матрице шел синтез полипептида

с повторяющейся последовательностью

Tyr-Leu-Ser-Ile независимо от рамки

считывания:

UAU|CUA|UCU|AUC|UAU|CUA|UCU|AUC

Туr—Leu—Ser—Ilе—Туr—Leu—Ser—Ilе

Отсюда можно было сделать вывод

о смысле четырех кодонов.

Совершенно иной результат был полу-

чен при использовании в качестве матрицы

poly(GUAA). Единственными продуктами

были ди- и трипептиды. Почему не было

более длинных цепей? Объясняется это

тем, что один из триплетов, встречающих-

ся в этом сополимере, а именно UAA, ко-

дирует не аминокислоту, а терминацию

синтеза белка:

GUA | AGU | AAG | UAA | GUA|A. . .

Val—Ser —Lys— Стоп

На матрице poly(AUAG) также получались

только ди- и трипептиды, так как UAG-

второй сигнал терминации цепи:

AUA|GAU|AGA|UAG|AUA|G. . .

Ile — Asp—Arg—Стоп

Посмотрим теперь снова на табл. 26.3. На

матрице poly(GUA) синтезировались два,

а не три гомополипептида по той причине,

что третья рамка считывания соответ-

ствует последовательности

G | UAG | UAG |

UAG-

- -

Стоп — Стоп — Стоп

т. е. представляет собой повторяющуюся

последовательность сигнала терминации.

Как же обстоит дело с poly(GAU)? На

этой матрице синтезировались только два

гомополипептида, потому что третья рам-

ка считывания соответствует еще одному

сигналу терминации - UGA:

GA | UGA | UGA | UGA | U. . .

Стоп — Стоп — Стоп

Таблица 26.4. Генетический код

Первое

положение

(5'-конец)

Второе положение

Phe

Leu

lle

Met

Val

Ser

Pro

Thr

Ala

Туr

Стоп

His

Gln

Asn

Lys

Asp

Glu

Cys

Стоп

Trp

Arg

Ser

Arg

Gly

Третье

положение

(3'-конец)

Зная положение оснований в кодоне, можно найти соответствующую

аминокислоту. Например, кодон 5'-AUG-3' в мРНК детерминирует

метионин, тогда как CAU детерминирует гистидин. Кодоны UAA, UAG

и UGA - сигналы терминации (стоп-кодоны). AUG является частью сиг-

нала инициации помимо того, что он кодирует внутренние остатки ме-

тионина.

В действительности оказалось, что только

три кодона не кодируют никакой аминокис-

лоты: UAG, UAA и UGA.

Синтез полинуклеотидов с определенной

последовательностью в лаборатории Ко-

раны был выдающимся достижением. Ис-

пользование этих полимеров в качестве ма-

триц для синтеза белка в сочетании

с работами Ниренберга по связыванию

тРНК с рибосомами в присутствии трину-

клеотидов привели к полной расшифровке

генетического кода к 1966 г. Еще за шесть

лет до этого такое событие казалось несбы-

точной мечтой. Благодаря разработке со-

вершенных методов синтеза в лаборатории

Кораны стало возможным и еще одно до-

стижение: полный синтез молекулы ДНК,

соответствующей последовательности мо-

лекулы транспортной РНК.

26.7. Основные свойства генетического кода

Были расшифрованы все 64 кодона

(табл. 26.4). 61 триплет соответствует опре-

деленным аминокислотам, а три кодируют

терминацию. Поскольку существует 20 ами-

нокислот и 61 триплет для их кодирования,

очевидно, что код в высокой степени выро-

жден. Иными словами, многие аминокис-

лоты детерминируются более чем одним

триплетом. Только триптофан и метионин

кодируются всего одним триплетом.

Остальные 18 аминокислот кодируются

двумя и более триплетами. Так, в частности,

лейцин, аргинин и серин кодируются

шестью кодонами каждый. В нормальных

физиологических условиях код однозначен:

каждый кодон обозначает только одну

аминокислоту.

26. Генетический код.

Зависимость гены-белки

Кодоны, соответствующие одной амино-

кислоте, называют синонимами. Например.

CAU и САС - синонимы для гистидина.

Обратите внимание, что синонимы не раз-

бросаны случайным образом по таблице ге-

нетического кода (табл. 26.4). Аминокисло-

та, кодируемая двумя или более синонима-

ми, занимает одну клетку в таблице (за

исключением тех случаев, когда для данной

аминокислоты существует более четырех

синонимов). Аминокислоты, располо-

женные в одной клетке, кодируются кодона-

ми, у которых два первых основания одина-

ковые, а третье различается, например

GUU, GUC, GUA и GUG. Большинство си-

нонимов различается только последним ос-

нованием триплета. Рассмотрение кода по-

казывает, что XYC и XYU всегда кодируют

одну и ту же аминокислоту, a XYG и XYA

чаще (но не всегда) кодируют одну и ту же

аминокислоту. Структурные основы такой

эквивалентности кодонов станут понятны

после обсуждения природы антикодонов

в молекулах тРНК (разд. 27.6).

Каков биологический смысл сильной вы-

рожденности генетического кода? Один из

возможных ответов состоит в том, что выро-

жденность сводит к минимуму пагубное

действие мутаций. Если бы код не был вы-

рожден, 20 кодонов кодировали бы амино-

кислоты, а 44 вызывали бы терминацию

цепи.

Таким образом, вероятность превраще-

ния кодона в сигнал терминации была бы

гораздо выше в случае невырожденного ко-

да, чем в существующем коде. Важно учесть,

что мутации, приводящие к образованию

сигнала терминации цепи, обычно приводят

к синтезу неактивных белков, тогда как за-

мещение одной аминокислоты другой обыч-

но относительно безвредно. Кроме того, вы-

рожденность кода может иметь определен-

ное значение постольку, поскольку она

позволяет нуклеотидному составу ДНК ме-

няться в широких пределах, не влияя на ами-

нокислотную последовательность белков, ко-

дируемых этой ДНК, ([G] +

+ [С])-содержание бактериальных ДНК ко-

леблется от 30% до более 70%. Молекулы

ДНК с сильно различающимся содержа-

нием [G] + [С] могут кодировать одни и те

же белки благодаря систематическому ис-

пользованию различных синонимов.

Часть IV.

Информация

26.8. Сигналы инициации и терминации

синтеза белка

Как мы уже упоминали, UAA, UAG и UGA

(стоп-кодоны) обозначают терминацию це-

пи. Эти кодоны считываются не молекулами

тРНК, а особыми белками - факторами

терминации. Сигнал начала (инициации)

синтеза белка более сложен. Полипеп-

тидные цепи у бактерий начинаются с моди-

фицированной аминокислоты формилме-

тионина (fMet).

Существует особая тРНК, которая пере-

носит fMet. Эта fMet-тРНК узнает кодон

AUG (или реже GUG). Однако AUG являет-

ся также кодоном для метионина, располо-

женного внутри полипептида, а GUG-ко-

дон внутреннего валина. Это значит, что

сигнал для первой аминокислоты полипеп-

тидной цепи должен быть сложнее, чем для

всех последующих аминокислот. AUG (или

GUG) представляет собой часть сигнала

инициации. Существует другой сигнал, пред-

шествующий AUG (или GUG), который

определяет, будет ли кодон считан как сиг-

нал инициации цепи или как кодон для вну-

треннего остатка метионина (или валина).

Механизмы инициации и терминации синте-

за белка мы рассмотрим в следующей главе

(разд. 27.13).

26.9. Генетический код универсален

Как мы уже сказали, генетический код был

расшифрован в результате исследований по-

ведения тринуклеотидов и синтетических

матричных РНК в бесклеточных системах,

полученных из бактерий. Возникают два во-

проса. Одинаков ли генетический код in vivo

и in vitro? Одинаков ли генетический код

у всех организмов? Убедительный ответ на

эти вопросы был получен при анализе мута-

ций у вирусов, бактерий и высших организ-

мов. Известно множество аминокислотных

замен, возникающих в результате мутаций

в генах гемоглобина человека, белка обо-

лочки вируса табачной мозаики (ВТМ)

и α-цепи триптофан-синтазы E.coli. Почти

все эти аминокислотные замены объясняют-

ся заменами всего лишь одного основания

(табл. 26.5). Это - надежная проверка пра-

вильности всего генетического кода и его

универсальности.

Почему код не изменился за миллионы

лет эволюции? Обсудим действие мутации,

изменяющей считывание мРНК. Такая му-

тация изменит последовательность амино-

кислот в большинстве, если не во всех бел-

ках, синтезируемых в клетках мутантного

организма. Многие их этих изменений, бе-

зусловно, окажутся губительными, и, следо-

вательно, должно существовать сильное да-

вление отбора против таких мутаций.

26.10. Последовательность оснований гена

и последовательность аминокислот

соответствующего полипептида коллинеарны

Обратимся теперь к взаимоотношениям ме-

жду генами и белками. Как показала работа

Сеймура Бензера (Seymour Benzer) по гене-

тическому картированию высокого разре-

шения, гены - неразветвленные структуры.

Этот важный результат согласовывался

с установленным фактом, что ДНК предста-

вляет собой линейную последовательность

пар оснований. Полипептидные цепи также

имеют неразветвленную структуру. Поэто-

му в начале 60-х годов возник следующий

вопрос: существует ли линейное соответ-

ствие между геном и его полипептидным

продуктом?

Подход Чарлза Янофски (Charles

Yanofsky) к этой проблеме состоял в исполь-

зовании мутантов E.coli, у которых обра-

зуется измененная молекула фермента. Бы-

ло выделено много мутантов по α-цепи

триптофан-синтазы и определена локализа-

ция мутаций на генетической карте α-цепи

с помощью рекомбинационных эксперимен-

тов с трансдуцирующим фагом. Некоторые

из этих мутаций были локализованы близко

друг к другу на генетической карте, тогда

как другие были сильно удалены в пределах

одного гена. Следующей важной задачей

было определить положение аминокислот-

ной замены для каждого из этих десяти му-

тантов. Прежде всего была определена по-

следовательность 168 аминокислот α-цепи

дикого типа. Затем с помощью метода «от-

печатков пальцев» были установлены место

и природа аминокислотной замены в ка-

ждом случае. Порядок расположения мута-

ций на генетической карте был таким же,

как порядок соответствующих замен в по-

следовательности аминокислот полипептид-

ного продукта (рис. 26.5). Другими словами,

ген, кодирующий α-цепь, и его полипеп-

тидный продукт коллинеарны.

26.11. Некоторые последовательности

вирусных ДНК кодируют более одного белка

Открытие того факта, что ДНК фага φХ174

кодирует больше белков, чем позволяет

имеющееся в ней количество нуклеотидов,

было совершенно загадочным. Как этот ви-

рус может кодировать более 2000 аминокис-

лотных остатков, если он содержит всего

лишь 5375 нуклеотидов? Ответ был получен

из полной последовательности оснований

(разд. 24.29), когда обнаружилось, что

в ДНК фага φХ174 некоторые гены перекры-

ваются. Определенные участки соответству-

ющих транскриптов транслируются в раз-

личных рамках считывания, что приводит к

образованию белков с различными последо-

вательностями аминокислот (рис. 26.6).

Например, одни и те же 300 нуклеотидов

кодируют белок гена Е и большую часть

белка гена D. Еще более поразительный

Таблица 26.5. Мутации в гемоглобине человека, трипто-

фан-синтазе E.coli и белке оболочки вируса табачной мо-

заики (ВТМ)

Белок

Гемоглобин

Триптофан-синтаза

Белок оболочки

ВТМ

Белок оболочки

ВТМ

Белок оболочки

ВТМ

Замена

аминокислоты

Glu—>Val

Glu—>Lys

Glu

—>Gly

Gly

—>Arg

Gly—>Glu

Glu

—>Ala

Leu —>Phe

Glu

—>Gly

Pro —>Ser

Предполагае-

мое изменение

кодона

GAA—>GUA

GAA —>AAA

GAA —>GGA

GGA —>AGA

GGA —>GAA

GAA —>GCA

CUU—>UUU

GAA —>GGA

CCC

—>UCC

Замена Glu—>Val и Glu—>Lys происходит в положе-

нии 6 в β-цепи гемоглобинов S и С человека соответ-

ственно.

26. Генетический код.

Зависимость гены-белки

Рис. 26.5. Коллинеарность гена и амино-

кислотной последовательно-

сти α-цепи триптофан-синтазы.

Положение мутаций в ДНК

(желтая линия) было определе-

но методами генетического

картирования. Аминокис-

лотные замены в последова-

тельности аминокислот (синяя

линия) расположены в том же

порядке, что и соответствую-

щие мутации. (Yanofsky С.,

Gene Structure and Protein

Structure, Sci. Amer., 1967.)

пример представляет родственный бакте-

риофаг G4, в ДНК которого некоторые ко-

роткие участки кодируют три различных

белка. Эти вирусы используют перекрываю-

щиеся гены, чтобы ввести больше информа-

ции в маленькие молекулы ДНК. Однако за

эту генетическую экономию приходится

платить: на последовательности аминокис-

лот, кодируемые перекрывающимися гена-

ми, накладываются строгие ограничения.

Поэтому перекрывающиеся гены, по-види-

мому, широко используются лишь в тех слу-

чаях, когда количество ДНК строго лимити-

ровано, как в случае вирусов с белковой

оболочкой строго определенных размеров.

Часть IV.

Информация

26.12. Гены эукариот представляют собой

мозаику из транслируемых и нетрансли-

руемых последовательностей ДНК

У бактерий полипептидные цепи кодируют-

ся непрерывной последовательностью три-

плетных кодонов. В течение многих лет счи-

талось, что гены высших организмов также

непрерывны. Эта точка зрения была неожи-

данно опровергнута в 1977 г., когда в не-

скольких лабораториях было открыто, что

некоторые гены имеют прерывистое строе-

ние. Например, ген β-цепи гемоглобина пре-

рывается в области, кодирующей аминокис-

лотную последовательность, длинной неко-

дирующей вставочной последовательностью

из 550 пар оснований и короткой последова-

тельностью из 120 пар оснований. Таким

образом, ген β-глобина разделен на три ко-

дирующие последовательности:

Эта удивительная структура была открыта

с помощью электронно-микроскопических

исследований гибридов между β-глобино-

вой мРНК и фаргментом ДНК мыши, со-

держащим ген β-глобина (рис. 26.7). Двухце-

почечная ДНК частично денатурируется,

что позволяет мРНК гибридизоваться

с комплементарной цепью ДНК. Затем

одноцепочечный участок ДНК образует

петлю и на электронных микрофотографиях

выглядит как тонкая линия в отличие от

двухцепочечной ДНК или ДНК-РНК-ги-

бридных участков, которые выглядят значи-

тельно толще. Если бы ген β-глобина был

Рис. 26.6. Перекрывающиеся гены

в ДНК фага φХ174. Рядом с

последовательностью основа-

ний показаны две последова-

тельности аминокислот, детер-

минируемые различными рам-

ками считывания.

непрерывен, была бы видна одна петля. Од-

нако на электронных микрофотографиях та-

ких гибридов (рис. 26.8) отчетливо видны

три петли. Это показывает, что ген преры-

вается по крайней мере одним участком

ДНК, которого нет в соответствующей

мРНК. Дополнительные данные о вста-

вочных последовательностях были полу-

чены при картировании рестрикционных

фрагментов гена β-глобина и продукта

обратной транскрипции мРНК. Большие

различия между этими картами показали,

что геномная ДНК содержит нетрансли-

руемые последовательности между коди-

рующими последовательностями. Рестрик-

ционные карты позволили уточнить локали-

зацию таких вставочных последовательно-

стей.

На каком этапе экспрессии гена удаляют-

ся вставочные последовательности? Ново-

синтезированные РНК, выделенные из ядра,

значительно длиннее молекул мРНК, ко-

торые из них получаются. В частности, пер-

вичный транскрипт гена β-глобина содер-

жит две нетранслируемые области. Эти

вставочные последовательности в первич-

ном 15S-транскрипте вырезаются, а коди-

рующие последовательности одновременно

соединяются под действием фермента

сплайсинга. Этот фермент обладает высо-

кой точностью. Так, образуется зрелая

9S-мРНК (рис. 26.9). Кодирующие последо-

вательности прерывистых («разорванных»)

генов называются экзонами, а вставочные

последовательности - интронами (от англ.

слов expressed regions - экспрессирующиеся

участки и intervening sequence - прерываю-

щая последовательность).

Еще один прерывистый эукариотический

ген - ген овальбумина куриного яйца, ко-

торый состоит из восьми экзонов, разде-

ленных семью длинными интронами

(рис. 26.10). Еще более удивителен ген ко-

нальбумина: он содержит не менее 17 экзо-

нов. Общее свойство экспрессии этих ге-

нов - то, что их экзоны располагаются

в мРНК и в ДНК в одной и той же последо-

вательности. Таким образом, прерывистые

гены, подобно непрерывным генам, колли-

неарны своим полипептидным продуктам.

Все картированные до настоящего време-

ни гены птиц и млекопитающих, кроме генов

гистонов (разд. 29.13), содержат интроны.

Почему практически все гены высших эука-

риот содержат вставочные последователь-

ности? Один из возможных ответов состоит

в том, что прерывистые гены отражают про-

цесс эволюции. Экзоны могут соответство-

вать крупным структурным или функцио-

нальным элементам (доменам), которые

соединились и образовали белки с новыми

свойствами. Другая возможность состоит

в том, что вырезание вставочных последова-

тельностей регулирует поток мРНК из ядра

в цитозоль. В соответствии с этой гипотезой

сплайсинг (сращивание) первичного тран-

скрипта играет ключевую роль: он опреде-

ляет, какие белки синтезирует клетка. От-

крытие прерывистых генов у высших орга-

низмов ввело нас в увлекательную область

26. Генетический код.

Зависимость гены-белки

Рис. 26.7. Выявление вставочных после-

довательностей с помощью

электронной микроскопии.

Молекула мРНК (красная ли-

ния) гибридизуется с геномной

ДНК, содержащей соответ-

ствующий ген. А - если ген не-

прерывен, видна одна петля

одноцепочечной ДНК (показа-

но синим цветом); Б - если ген

содержит вставочную последо-

вательность, видны две петли

одноцепочечной ДНК (показа-

но синим цветом) и одна петля

двухцепочечной ДНК (синий

и желтый цвет).

познания, которая, по-видимому, имеет

большое значение для понимания роста

и дифференцировки клеток.

26.13. Мутации возникают в результате

изменений последовательности оснований

ДНК

Существуют мутации нескольких типов:

1) замена одной пары оснований (или не-

скольких пар) другой парой; 2) делеция

одной или более пар оснований; 3) вставка

(включение, инсерция) одной или более пар

оснований (рис. 26.11). Наиболее распро-

страненный тип мутаций - замена одной

пары оснований другой парой. Частота спон-

танных мутаций у бактериофага Т4 была

оценена в 1,7•10

-8

на одну пару оснований

Часть IV.

Информация

за один цикл репликации. Для E.coli

и Drosophila melanogaster эти величины со-

ставляют 4•10

-10

и 7•10

-1

соответствен-

но.

Существует два типа одиночных замен

пары оснований. Транзиция - замещение

одного пурина другим пурином или одного

пиримидина другим пиримидином. Транс-

версией, наоборот, называется замещение

Рис. 26.8. Электронная микрофотогра-

фия гибрида β-глобиновой

мРНК и фрагмента геномной

ДНК, содержащего ген β-гло-

бина. Толстые петли двухспи-

ральной ДНК - вставочные по-

следовательности в ДНК, ко-

торых нет в мРНК (как на

рис. 26.7, Б). Верхняя стрелка

указывает на большую вста-

вочную последовательность,

нижняя стрелка - на малень-

кую. (Печатается с любезного

разрешения д-ра Philip Leder.)