Страйер Л. Биохимия. Том 3

Подождите немного. Документ загружается.

У эукариот все транскрипты подвер-

гаются интенсивному процессингу.

Расщепление и модификация предшествен-

ников рРНК и тРНК напоминают соответ-

ствующие процессы у прокариот. Удиви-

тельное отличие состоит в том, что мРНК

эукариот образуется путем расщепления

большого транскрипта и последующего сра-

щивания (сплайсинга) получающихся при

этом фрагментов. Это явление мы рассмо-

трим в одной из следующих глав

(разд. 29.21). У эукариот транскрипция

и трансляция происходят в различных ком-

партментах клетки. По всей вероятности,

процессинг РНК играет ключевую роль

в регуляции транспорта мРНК, рРНК

и тРНК из ядра в цитозолъ.

25.18. Антибиотики - ингибиторы транскрип-

ции: рифамицин и актиномицин

Антибиотики - очень интересные молекулы,

так как многие из них представляют собой

весьма специфические ингибиторы биоло-

гических процессов. Актиномицин и рифа-

мицин - два антибиотика, ингибирующих

Рис. 25.20. При расщеплении этого пер-

вичного транскрипта обра-

зуются молекулы 5S, 16S и 23S

рРНК и одна молекула тРНК.

Спейсерные участки закра-

шены желтым цветом.

транскрипцию совершенно различным пу-

тем. Рифамицин, образуемый бактериями

Streptomyces, и его полусинтетическое про-

изводное рифампицин специфически инги-

бируют инициацию синтеза РНК. Эти ан-

тибиотики не предотвращают связывания

РНК-полимеразы с ДНК-матрицей. Ри-

фампицин препятствует образованию пер-

вой фосфодиэфирной связи в цепи РНК.

При этом антибиотик практически не

влияет на элонгацию цепи. Столь высокая

избирательность ингибирующего действия

делает рифампицин ценным инструментом

в молекулярно-биологических исследова-

ниях. Например, его можно использовать

для подавления инициации новых цепей

РНК, не затрагивая транскрипции тех це-

пей, синтез которых уже начался. Ми-

шенью для рифампицина, видимо, служит

β-субъединица РНК-полимеразы. Были вы-

делены мутанты Е. coli, устойчивые к ри-

фампицину (так называемые rif-r-му-

танты). В некоторых из них электрофоре-

тическая подвижность β-субъединицы из-

менена.

Механизм действия актиномицина D (со-

держащего полипептиды антибиотика, про-

дуцируемого микроорганизмом Streptomy-

ces) совершенно отличен от механизма дей-

ствия рифампицина. Актиномицин D проч-

но связывается с двухспиральной ДНК и

за счет этого подавляет ее активность

в качестве матрицы для синтеза РНК.

Он состоит из двух идентичных цикли-

ческих пептидов, соединенных феноксазо-

новой системой колец (рис. 25.22). Состав

этих циклических пептидов необычен: они

содержат саркозин, метилвалин и D-валин.

Кроме того, в их молекуле имеется эфир-

25. Информационная РНК

и транскрипция

Рис. 25.21. Пространственная модель

структуры актиномицина D.

Феноксазоновое кольцо обо-

значено красным цветом, ци-

клические пептиды - желтым.

(По рисунку, любезно пред-

оставленному д-ром Henry

Sobell.)

ная связь между гидроксильной группой

треонина и карбоксильной группой метил-

валина.

Актиномицин D прочно связывается

с двухспиральной ДНК, но не с одноцепо-

чечными ДНК или РНК, двухспиральной

РНК или РНК-ДНК-гибридами. Кроме

того, связывание актиномицина с ДНК за-

метно усиливается с увеличением содержа-

ния остатков гуанина. Спектроскопические

и гидродинамические исследования ком-

плексов актиномицина D с ДНК свиде-

тельствуют о том, что феноксазоновое

кольцо актиномицина проникает в ДНК

между двумя соседними парами основа-

ний. Такой способ связывания называется

интеркаляцией (рис. 25.23). При низких

концентрациях актиномицин D ингибирует

транскрипцию, не оказывая сколько-нибудь

существенного влияния на репликацию

ДНК. На синтез белка непосредственно ак-

тиномицин также не влияет. Благодаря

этому актиномицин D широко использо-

вался в качестве специфического ингибито-

Часть IV,

Информация

ра образования новых РНК как в прока-

риотических, так и в эукариотических клет-

ках.

Недавно структура кристаллического

комплекса одной молекулы актиномицина

с двумя молекулами дезоксигуанозина бы-

ла изучена на уровне атомного разрешения

(рис. 25.23). В этом комплексе феноксазо-

новое кольцо актиномицина зажато между

двумя гуаниновыми кольцами. Один из

циклических пептидов расположен над фе-

ноксазоновым кольцом, другой - под ним.

Каждый из этих пептидов образует

сильные водородные связи с 2-аминогруп-

пой гуанинового остатка. Между антибио-

тиком и нуклеозидами осуществляется

много энергетически выгодных вандер-

ваальсовых взаимодействий. Важная осо-

бенность этого комплекса состоит в том,

что он почти симметричен. Ось симметрии

второго порядка проходит вдоль линии,

соединяющей средние атомы О и N фенок-

сазонового кольца. Конформация всего

комплекса показывает, что актиномицин

узнает в ДНК последовательность основа-

ний GpC. Обратите внимание, что если

в одной цепи ДНК имеется последователь-

ность 5'GpC3', то в комплементарной цепи

последовательность будет 3'CpG5'. По-ви-

димому, актиномицин интеркалирует

в ДНК между двумя GC-парами основа-

ний и взаимодействует с остатками G в ос-

новном таким же образом, как и в ком-

плексе с динуклеотидом. Согласно этой

модели, циклические пептидные остатки

локализованы в малой бороздке спирали

ДНК. Главная особенность этой модели

состоит в том, что симметрия молекулы

актиномицина соответствует симметрии

определенной последовательности в ДНК

25.19. Разработаны совершенные методы

определения последовательности

нуклеотидов в РНК

Высокая разрешающая способность мето-

да гель-электрофореза дает возможность

быстро определять последовательности ну-

клеотидов как в молекулах РНК, так и

Изложенная точка зрения на структуру ком-

плекса актиномицина D с ДНК не является об-

щепризнанной. Существует и другая гипотеза,

согласно которой актиномицин не интеркали-

рует в ДНК, а связывается в малой бороздке,

причем структура комплекса актиномицина D

с динуклеотидом GpC не отражает структуры

его комплексов с протяженными молекулами

ДНК. - Прим. перев.

Рис. 25.22. Структура актиномицина D.

в молекулах ДНК. Для этого 3'- или 5'-ко-

нец цепи РНК метят радиоактивной груп-

пой. Затем меченую цепь частично расще-

пляют по одному из четырех оснований,

чтобы получить набор фрагментов. Специ-

фическое (или избирательное) расщепление

можно провести с помощью ферментов,

специфичных к определенному основанию

эндонуклеаз (табл. 25.4). Например, рибо-

нуклеаза Т

гидролизует РНК с 3'-стороны

остатков G. Кроме того, РНК можно спе-

цифически расщепить с помощью химиче-

ской модификации одного из четырех осно-

ваний. Затем остов расщепляют в месте,

где расположено модифицированное осно-

вание. После этого четыре набора фраг-

ментов разделяют гель-электрофорезом

и последовательность оснований РНК чи-

тают непосредственно с радиоавтографа

(рис. 25.24), как и в случае ДНК

(разд. 24.28). Эти подходы позволяют лег-

ко определять в молекулах РНК последо-

вательность 100-200 нуклеотидов.

Другая стратегия сводится к тому,

чтобы определять последовательность ну-

клеотидов не в самой РНК, а в комплемен-

тарной ДНК. Но как получить комплемен-

тарные фрагменты ДНК? Один из мето-

дов состоит в следующем. С помощью

рестрикционных эндонуклеаз фрагменти-

руют большие молекулы ДНК. Затем ме-

тодом гибридизации идентифицируют ре-

стрикционные фрагменты, содержащие по-

следовательность, комплементарную ис-

следуемой РНК. В другом случае компле-

ментарную ДНК синтезируют фермента-

тивно по РНК-матрице с помощью обрат-

ной транскриптазы из опухолеродных ви-

русов (разд. 30.19). Именно так была рас-

шифрована полная последовательность 576

нуклеотидов мРНК, колирующей β-цепь

гемоглобина человека.

Заключение

Поток генетической информации в нор-

мальных клетках происходит в направле-

нии: ДНК —> РНК —> белок. Синтез РНК

по ДНК-матрице называется транскрип-

цией, а синтез белка по РНК-матрице -

трансляцией. Существует три типа моле-

25. Информационная РНК

и транскрипция

Таблица 25.4. Ферменты, используемые при определении последовательности нуклеотндов в РНК

Фермент

Рибонухлеаза T

Панкреатическая рибонукле-

аза

Рибонуклеаза U

Рибонуклеаза I

(из P. polycephalum)

Щелочная

фосфатаза

(из Е.

соli)

Фосфодиэстepaзa из селезен-

ки крупного рогатого скота

Фосфодиэстераза змеиного

яда

Полинуклеотидкиназа

Тип активности

Эндо- и экзонуклеаза

Эндо- и экзонуклеаэа

Эндо- и экзонуклеаза

N = A, G, U, но не С

Фосфатаза

Экзонуклеаза

Киназа

Субстрат

Продукты

В эту таблицу необходимо внести еще один фермент - РНК-лигазу. С его помощью осуществляется

включение метки в 3'-концы РНК: —XpY + pCp —> XpYpCp (pCp содержит

Р-метку).- Прим. перев.

Рис. 25.23. Предполагаемая структура

комплекса актиномицина D

с ДНК. Феноксазоновое коль-

цо актиномицина (показано

красным цветом) интеркали-

рует между двумя GС-парами

ДНК (показаны синим цветом).

Циклические пептиды актино-

мицина D (желтые) связывают-

Часть IV.

Информация

ся с малой бороздкой спирали

ДНК. Между актиномицином

D и соседними гуанинами воз-

никает несколько водородных

связей. Ось симметрии субъе-

диниц актиномицина D совпа-

дает с осью симметрии сахаро-

фосфатного остова и последо-

вательности оснований ДНК.

(По рисунку, любезно пред-

оставленному д-ром Henry

Sobell.)

Рис. 25.24. Радиоавтограф фрагмента

5S-PHK дрожжей. 3'-конец по-

мечен радиоактивной меткой.

Четыре дорожки соответ-

ствуют расщеплению по остат-

кам G, А, С и U. На геле можно

прочитать последовательность

5'-CGAAACUCAGGUGCUG-

CAAUC-3'. [Peattie D. А., Ргос.

Nat. Acad. Sci., 76, 1762 (1979).]

кул РНК: информационная РНК (мРНК),

транспортная РНК (тРНК) и рибосомная

РНК (рРНК). Все эти РНК одноцепо-

чечные. Транспортная РНК и рибосомная

РНК содержат протяженные двухспи-

ральные участки, которые образуются при

складывании цепи в шпильки. Самыми ма-

ленькими молекулами РНК являются

тРНК; они содержат около 75 нуклеоти-

дов. Самые длинные молекулы РНК встре-

чаются среди мРНК; они могут содержать

более 5000 нуклеотидов. Последователь-

ность нуклеотидов в длинных цепях РНК

можно определить, расщепляя их и разде-

ляя фрагменты гель-электрофорезом.

Все клеточные РНК синтезирует РНК-

полимераза в соответствии с последова-

тельностью ДНК-матрицы. Активиро-

ванными промежуточными продуктами

служат рибонуклеозидтрифосфаты. Синтез

РНК, как и синтез ДНК, происходит в на-

правлении 5'—>3'. РНК-полимераза отли-

чается от ДНК-полимеразы тем, что не

нуждается в затравке и не обладает нук-

леазными активностями. Еще одно отли-

чие состоит в том, что ДНК-матрица при

синтезе РНК полностью сохраняется, тог-

да как при синтезе ДНК она сохраняется

наполовину. РНК-полимераза Е. coli имеет

субъединичную структуру α

ββ'σ и массу,

достигающую 500 кДа. Кор-фермент имеет

состав α

ββ'. Сигма-субъединица увеличи-

вает скорость и специфичность транскрип-

ции, так как она обеспечивает узнавание

РНК-полимеразой сигналов начала тран-

скрипции в матричной ДНК. Связывание

РНК-полимеразы с такими промоторными

участками вызывает локальное расплета-

ние матрицы, что создает условия для

образования первой фосфодиэфирной свя-

зи. Цепи РНК начинаются с pppG или

рррА. После инициации синтеза новой це-

пи сигма-субъединица отделяется от голо-

фермента. Терминация транскрипции так

же тонко регулируется, как и инициация.

Матричная ДНК содержит стоп-сигналы

транскрипции. Некоторые из этих сигналов

узнает белок ρ. Некоторые специфические

ингибиторы могут блокировать транскрип-

цию. Например, антибиотик рифампицин

ингибирует инициацию синтеза РНК, а ак-

тиномицин D блокирует элонгацию РНК.

Многие молекулы РНК подвергаются по-

сле транскрипции расщеплению и химиче-

ской модификации (например, метили-

руются). У прокариот молекулы тРНК

и рРНК подвергаются интенсивному про-

цессингу, а молекулы мРНК почти не пре-

терпевают модификаций. У эукариот все

транскрипты сильно модифицируются.

25. Информационная РНК

и транскрипция

РЕКОМЕНДУЕМАЯ

ЛИТЕРАТУРА

С чего начать

Miller О. 1973. The visualization of

genes in action, Sci. Amer, 228(3),

34-42.

Spiegelman S., 1964. Hydrid nucleic

acids, Sci. Amer., 210(5), 48-56.

Chamberlin M.J., 1976. RNA

polymerase: an overview. In: Losick R.

and Chamberlin M. (eds.), RNA

Polymerase, pp. 17-67, Cold Spring

Harbor Laboratory.

Открытие информационной РНК

Jacob F., Monod J., 1961. Genetic

regulatory mechanisms in the synthesis

of proteins, J.Mol.Biol., 3, 318-356.

Brenner S., Jacob F., Meselson M.,

1961. An unstable intermediate

carrying information from genes to

ribosomes for protein synthesis,

Nature, 190, 576-581.

Hall B.D., Spiegelman S., 1961.

Sequence complementarity of T2-DNA

and T2-specific RNA, Proc. Nat. Acad.

Sci., 47, 137-146.

РНК-полимераза

Losick R., Chamberlin M. (eds.), 1976.

RNA Polymerase, Cold Spring Harbor

Laboratory. (Книга содержит ряд

превосходных статей.)

Chamberlin M.J., 1974. The selectivity

of transcription, Ann. Rev. Biochem.,

43, 721-776.

Travers A., 1976. RNA polymerase

specificity and the control of growth,

Nature, 263, 641-646.

Инициирование транскрипции

Hayashi M., Hayashi M.N.,

Spiegelman S., 1963. Restriction of in

vivo genetic transcription to one of the

complementary strands of DNA, Proc.

Nat. Acad Sci., 50, 664-672.

Taylor K., Hradecna Z., Szybalski W.,

1967. Asymmetric distribution of the

transcribing regions on the com-

plementary strands of coliphage

λ DNA, Proc. Nat. Acad. Sci.,

57, 1618-1625.

Burgess R.R., Travers A.A., Dunn J.J.,

Bautz E.K.F., 1969. Factor stimulating

transcription by RNA polymerase,

Nature, 221, 43-46. (Открытие сигма-

фактора.)

Gilbert W., 1976. Starting and stopping

sequences for the RNA polymerase. In:

Losick R. and Chamberlin M. (eds.),

RNA Polymerase, pp. 193-205, Cold

Spring Harbor Laboratory.

Reznikoff W.S., Abelson J.N., 1978.

The lac promoter. In: Miller J. H. and

Reznikoff W. S. (eds.), The Operon,

pp. 221-243, Cold Spring Harbor

Laboratory. (Сопоставляются 29 про-

моторных последовательностей.)

Терминирование транскрипции

Adhya S., Gottesman M., 1978. Control

of transcription termination, Ann. Rev.

Biochem., 47, 967-996.

Das A., Merril C., Adhya S., 1978.

Interaction of RNA polymerase and

rho in transcription termination:

coupled ATPase, Proc. Nat. Acad. Sci.,

75, 4828-4832.

Wu A.M., Platt T., 1978. Transcription

termination: nucleotide sequence at 3'

end of tryptophan operon in

Escherichia coli, Proc. Nat. Acad. Sci.,

75, 5442-5446.

Антибиотики - ингибиторы синтеза

РНК

Goldberg J.H., Friedman P.A., 1971.

Antibiotics and nucleic acids, Ann.

Rev. Biochem., 40, 775-810.

Sobell H.M., 1974. How actinomycin

binds to DNA. Sci. Amer., 231(2),

82-91.

Процессинг РНК

Perry R.P., 1976. Processing of RNA,

Ann. Rev. Biochem., 45, 605-630.

Steitz J.A., Young R.A., 1978.

Complementary sequences 1700

nucleotides apart from a ribonuclease

III cleavage site in Escherichia coli

ribosomal precursor RNA, Proc. Nat.

Acad. Sci., 75, 3593-3597.

Altman S., 1978. Biosynthesis of tRNA.

In: Atlman S. (ed.), Transfer RNA,

pp. 48-77, MIT Press.

Определение последовательности ос-

нований в РНК

Peattie D.A., 1979. Direct chemical

method for sequencing RNA, Proc.

Nat. Acad. Sci., 76, 1760-1764.

Simoncsits A., Brownlee G.G.,

Brown R.S., Rubin J.R., Guilley H.,

1977. New rapid gel sequencing meth-

od for RNA, Nature, 269, 833-836.

Вопросы и задачи

1. Сравните ДНК-полимеразу I

и РНК-полимеразу Е. coli по

каждому из следующих свойств.

а) Субъединичная структура.

б) Активированные предшественники.

в) Направление элонгации цепи.

г) Нуклеазные активности.

д) Сохранение матрицы.

е) Потребность в затравке.

ж) Энергетика реакции элонгации.

2. Напишите последовательность

молекулы мРНК, синтезиро-

ванной на матричной цепи ДНК со сле-

дующей последовательностью:

5'-ATCGTACCGTTA-3'.

3. РНК легко гидролизируется

щелочью, а ДНК нет. Почему?

4. Каким образом кордицепин

(3'-дезоксиаденозин) блокирует

синтез РНК?

5. Какие продукты должны полу-

читься при частичном гидроли-

зе олигорибонуклеотида

5'-pGCAGUACUGUC-3'

следующими ферментами:

а) панкреатической рибонуклеазой,

б) рибонуклеазой Т1,

в) рибонуклеазой U

г) рибонуклеазой I из Physarum!

6. Исчерпывающий гидролиз оли-

горибонуклеотида панкреатиче-

ской рибонуклеазой дает следующие про-

дукты: Ср 2Up, AGCp и GAAUp. Гидролиз

того же олигонуклеотида рибонуклеазой

дает AAUp, UAGp и CCUGp. Какова

его последовательность?

Дополнительные вопросы см.: Wood W. В.,

Wilson J.H., Benbow R.M., Hood L.E.

Biochemistry: A Problem Approach, ens. 16,

17 Benjamin, 1974, chs. 16,17.

ГЛАВА 26

Генетический код и

зависимость между

генами и белками

В главе 25 была описана роль информа-

ционной РНК в качестве посредника ме-

жду геном и его полипептидным продук-

том. В настоящей главе мы рассмотрим

дальнейший поток информации от гена

к белку. В центре внимания находится ге-

нетический код, связывающий последова-

тельность оснований ДНК (или соответ-

ствующего транскрипта) с последователь-

ностью аминокислот в белке. Код универ-

сален для всех организмов. Он восхищает

своей простотой. Три основания, соста-

вляющие кодон, детерминируют одну ами-

нокислоту. Кодоны считываются последо-

вательно молекулами транспортных РНК

(тРНК), играющих при синтезе белка роль

адаптеров. Полная расшифровка генети-

ческого кода в 60-х годах - одно из вы-

дающихся достижений современной био-

логии.

26.1. Транспортная РНК - адапторная

молекула в синтезе белка

Мы уже видели, что мРНК служит матри-

цей для синтеза белка. Каким образом она

осуществляет соединение аминокислот

в правильном порядке? В 1958 г. Фрэнсис

Крик (Francis Crick) писал:

«Одно из первых предположений, до-

вольно наивных, состояло в том, что

РНК будет принимать конфигурацию,

способную образовать двадцать раз-

личных «полостей», по одной для боко-

вой цепи каждой из двадцати аминокис-

лот. Если бы это было так, можно было

бы попробовать проиграть эту задачу

в обратном направлении, т.е. найти не-

обходимую конфигурацию РНК, пы-

таясь воссоздать форму этих полостей.

Все подобные попытки закончились не-

удачей. Физико-химические соображения

также не дают никаких оснований счи-

тать это предположение правдопо-

добным.»

Крик отметил, что РНК не имеет вы-

пуклых гидрофобных поверхностей, позво-

ляющих отличить валин от лейцина и изо-

лейцина, и не содержит соответствующим

образом расположенных заряженных

групп, чтобы различать положительно

и отрицательно заряженные боковые цепи

аминокислот. Затем Крик предлагает прин-

ципиально иной механизм для узнавания

мРНК:

«РНК - это прежде всего последователь-

ность участков, способных образовывать

водородные связи. Поэтому независимо

от того, что именно связывается с мат-

рицей специфичным образом, связыва-

ние, очевидно, происходит путем образо-

вания водородных связей. Следователь-

но, естественно предположить, что ами-

нокислоты переносятся к матрице адап-

торными молекулами и что именно

адаптор соответствует РНК. В простей-

шем случае потребуется 20 адаптеров,

по одному на каждую аминокислоту».

Эта новаторская гипотеза вскоре стала

доказанным фактом. Роль адаптера в бел-

ковом синтезе играет тРНК. Структура

этих замечательных адапторных молекул

и реакции, в которых они участвуют, рас-

сматриваются подробно в следующей гла-

ве. Здесь же достаточно отметить, что

в тРНК имеются место прикрепления ами-

нокислот и участок узнавания матрицы

(рис. 26.1 и 26.2). Молекула тРНК перено-

сит определенную аминокислоту в активи-

рованной форме к месту синтеза белка.

Карбоксильная группа аминокислоты свя-

зана эфирной связью с 3'-гидроксильной

26. Генетический код.

Зависимость гены-белки

или 2'-гидроксильной) группой рибозного

остатка, расположенного на 3'-конце цепи

тРНК. Во время синтеза белка связанная

аминокислота может перемешаться с 2'- на

3'-гидроксильную группу и обратно. При-

соединение аминокислоты к тРНК с обра-

зованием аминоацил-тРНК катализируется

особым ферментом, называемым аминоа-

цил-тРНК—синтетазой (или активирую-

щим ферментом). Эта реакция этерифика-

ции идет за счет энергии АТР. Для каждой

из 20 аминокислот имеется по крайней ме-

ре одна специфическая синтетаза. Участок

узнавания матрицы в тРНК представляет

собой последовательность из трех основа-

ний, называемую антикодоном (рис. 26.2).

Антикодон тРНК узнает кодон, т. е. ком-

плементарную последовательность из трех

оснований в мРНК.

26.2. Аминокислоты кодируются группами

из трех оснований, начиная со строго

определенной точки

Генетический код связывает последова-

тельность оснований в ДНК (или в со-

ответствующих транскриптах) и последова-

тельность аминокислот в белках. К 1961 г.

благодаря экспериментам Фрэнсиса Крика,

Сиднея Бреннера (Francis Crick, Sydney

Brenner) и других исследователей были

установлены следующие свойства генетиче-

ского кода.

1. Чему равно кодирующее отношение?

Поскольку в ДНК имеется четыре вида ос-

нований, то при кодировании одной ами-

нокислоты одним основанием могло бы

кодироваться всего лишь четыре амино-

кислоты. При кодировании одной амино-

кислоты двумя основаниями кодировалось

бы 16 аминокислот (4•4=16), а при коди-

ровании тремя основаниями - 64 аминокис-

лоты (4•4•4 = 64). Белки состоят из двад-

цати аминокислот основного набора. Из

этого несложного подсчета было очевидно,

что для кодирования одной аминокислоты,

видимо, необходимы три или более осно-

ваний. Генетические эксперименты показа-

ли, что на самом деле одну аминокислоту

кодирует группа из трех оснований. Эта

группа оснований называется кодоном.

2. Является ли код перекрывающимся?

В случае непрерывающегося триплетного

кода каждая группа из трех оснований ко-

Часть IV.

Информация

Рис. 26.1. Присоединение аминокислоты

(показана красным цветом)

к молекуле тРНК. Аминокис-

лота связана эфирной связью

с 3'-гидроксильной группой

концевого аденозина РНК.

Молекула тРНК, несущая ко-

валентно привязанную амино-

кислоту, называется аминоа-

цил-тРНК или «нагруженная»

тРНК, а тРНК без аминокис-

лоты - «ненагруженная».

Рис. 26.2. Схематическое изображение

аминоацил-тРНК. Показаны

участок прикрепления амино-

кислоты и антикодон (участок

узнавания матрицы).

дирует только одну аминокислоту, тогда

как в случае полностью перекрывающегося

триплетного кода АБВ кодирует первую

аминокислоту, БВГ-вторую, ВГД-третью

т.д.

Эту дилемму удалось решить путем

определения последовательности амино-

кислот в мутантах. Предположим, что ос-

нование В мутировало в В'. Если код не

перекрывается, изменится только одна

аминокислота. При полностью перекры-

вающемся коде мутация В в В' приведет

к изменению аминокислот 1, 2 и 3. Изуче-

ние последовательности аминокислот бел-

ка оболочки мутантов вируса табачной мо-

заики показало, что у этих мутантов

измененной обычно оказывалась только

одна аминокислота. Напомним также, что

как уже говорилось при обсуждении ано-

мальных гемоглобинов в гл. 5, и в этом

случае у большинства мутантов происхо-

дило изменение только одной аминокис-

лоты. Отсюда был сделан вывод, что гене-

тический код не перекрывается:

3. Как происходит правильное считыва-

ние группы из трех оснований? A priori од-

на из возможностей состоит в том, что

одно из четырех оснований (оно обозначе-

но Q) служит «запятой» между группами

по три основания:

. . . QAБBQГДEQЖЗИQКЛMQ. . .

Оказалось, что это не так. Последователь-

ность оснований читается последователь-

но, начиная со строго определенной точки:

Запятых в коде нет. Предположим, что

в результате мутации произошла делеция

основания Ж:

Первые две аминокислоты в этой полипеп-

тидной цепи будут нормальными, но

остальная последовательность оснований

будет прочитана неправильно, так как в ре-

зультате делеции Ж произошел сдвиг рамки

считывания. Теперь предположим, что

между Е и Ж добавилось основание Ш:

Эта вставочная мутация также нарушает

рамку считывания, начиная с кодона ами-

нокислоты 3. В действительности генетиче-

ские исследования вставочных и деле-

ционных мутантов позволили выяснить

многие свойства генетического кода,

4. Как уже было сказано выше, суще-

ствует 64 возможных триплета оснований

и 20 аминокислот. Соответствует ли ка-

ждой из 20 аминокислот только один три-

плет, или некоторые аминокислоты коди-

руются более чем одним триплетом? Гене-

тические исследования показали, что боль-

шинство из 64 триплетов кодируют амино-

кислоты. В последующих биохимических

исследованиях было установлено, что 61

триплет из 64 кодирует определенные ами-

нокислоты. Таким образом, для большин-

ства аминокислот имеется более одного

кодового слова. Другими словами, генетиче-

ский код вырожден.

26.3. Расшифровка генетического кода:

синтетические РНК могут служить

информационными РНК

Каково соотношение между 64 видами ко-

довых слов и 20 аминокислотами? В прин-

ципе на этот вопрос можно получить пря-

мой ответ, если сравнить последователь-

ность аминокислот в каком-либо белке

с соответствующей последовательностью

оснований его гена или мРНК. Однако

в 1961 г. этот подход был совершенно не-

доступен, так как о последовательностях

оснований в генах и молекулах мРНК ни-

чего не было известно. Тогда казалось, что

проблема генетического кода не может

быть решена в близком будущем, но вне-

запно ситуация изменилась. Маршалл Ни-

26. Генетический код.

Зависимость гены-белки

ренберг (Marshall Nirenberg) обнаружил,

что добавление полиуридилата [poly(U)]

в бесклеточную систему синтеза белка при-

водит к синтезу полифенилаланина. Оче-

видно, poly(U) выполнил функцию инфор-

мационной РНК. Первое кодовое слово

было расшифровано: UUU кодирует фени-

лаланин Этот замечательный эксперимент

указал путь к полной расшифровке генети-

ческого кода.

Обсудим более подробно этот эпо-

хальный эксперимент. В качестве двух ос-

новных компонентов были использованы

бесклеточная система, активно синтезиро-

вавшая белок, и синтетический полирибо-

нуклеотид, сыгравший роль информацион-

ной РНК. Бесклеточная система синтеза

белка была получена из Е. coli следующим

образом. Бактериальные клетки осторожно

разрушали, перемалывая с тонко измель-

ченным порошком окиси алюминия, чтобы

получить клеточный сок. Затем обрывки

клеточной стенки и клеточной мембраны

удаляли центрифугированием. В результа-

те получали экстракт, содержащий ДНК,

мРНК, тРНК, рибосомы, ферменты и дру-

гие клеточные компоненты. При добавле-

нии ATP, GTP и аминокислот в этой бес-

клеточной системе синтезировался белок.

По крайней мере одна из добавленных

аминокислот была радиоактивной, что да-

вало возможность обнаружить ее включе-

ние в белок. Эту смесь инкубировали при

37°С примерно в течение 1 ч. Затем доба-

вляли трихлоруксусную кислоту, чтобы

остановить реакцию и осадить белки. При

этом свободные аминокислоты оставались

в надосадочной фракции. Осадок промыва-

ли и просчитывали его радиоактивность,

определяя таким образом сколько меченой

аминокислоты включилось в новосинтези-

рованный белок. Важная особенность этой

системы состоит в том, что синтез белка

можно остановить добавлением дезоксири-

бонуклеазы, разрушающей матрицы для

синтеза новых мРНК. Поскольку та

мРНК, которая уже имелась в смеси ко

времени добавления дезоксирибонуклеазы,

лабильна, синтез белка можно прекратить

в течение нескольких минут. Затем Нирен-

берг обнаружил, что синтез белка возобно-

вляется при добавлении неочищенной

фракции мРНК. Таким образом, в руках

Часть IV.

Информация

Ниренберга была бесклеточная система

синтеза белка, зависящая от добавления

мРНК.

Другим важнейшим компонентом в этом

эксперименте был синтетический полири-

бонуклеотид poly(U). Poly(U) синтезирова-

ли с помощью полинуклеотид-фосфори-

лазы - фермента, открытого в 1955 г. Ма-

рианной Грюнберг-Манаго и Северо Очоа

(Marianne Grunberg-Manago, Severo Ochoa).

Этот фермент катализирует синтез полири-

бонуклеотидов из рибонуклеозиддифосфа-

тов:

(РНК)

+ Рибонуклеозиддифосфат

(РНК)

n+1

+ P

Полинуклеотид-фосфорилаза и РНК-поли-

мераза катализируют совершенно раз-

личные реакции. В приведенной реакции

активированными предшественниками слу-

жат рибонуклеозиддифосфаты, а не три-

фосфаты. Продукт реакции - ортофосфат,

а не пирофосфат. Следовательно, равнове-

сие в реакции не может быть сдвинуто

вправо в результате гидролиза пирофосфа-

та. В самом деле, in vivo равновесие сдви-

нуто в сторону распада РНК, а не ее син-

теза. Принципиальное отличие состоит

в том, что полинуклеотид-фосфорилаза не

использует матрицы. Состав РНК, синте-

зированной этим ферментом, определяется

соотношением рибонуклеотидов в инкуба-

ционной смеси, а последовательность близ-

ка к случайной. Благодаря этому полину-

клеотид-фосфорилаза оказалась ценней-

шим инструментом в экспериментах по

расшифровке генетического кода. Напри-

мер, poly(U) синтезировали, инкубируя

в присутствии фермента раствор высокой

Рис. 26.3. Синтез белка в бесклеточной

системе останавливается через

несколько минут после доба-

вления дезоксирибонуклеазы

и возобновляется при добавле-

нии мРНК.