Страйер Л. Биохимия. Том 3

Подождите немного. Документ загружается.

ная», «суперспиральная», «суперскручен-

ная» и «сверхспиральная» - синонимы.

Кольцевую ДНК, совершенно лишенную

суперспиральных витков, называют релак-

сированной. Для того чтобы превратить ре-

лаксированную ДНК в суперспирализован-

ную, необходимо затратить определенную

энергию. Например, энергия, затрачивае-

мая на образование 15 суперспиральных

витков в одной молекуле ДНК вируса

SV-40 (ее контурная длина 1,7 мкм), соста-

вляет около 100 ккал/моль. Энергия напря-

жения суперспирализованной ДНК (энер-

гия суперспирализации) примерно пропор-

циональна квадрату числа суперспи-

ральных витков.

Суперспирализация, по-видимому, вы-

полняет две биологические функции. Во-

первых, суперспирализованная ДНК имеет

более компактную форму, чем релаксиро-

ванная ДНК такой же длины (рис. 24.23).

Суперспирализация может играть опреде-

ленную роль в упаковке ДНК. Во-вторых,

Суперспирализация может влиять на сте-

пень расплетания двойной спирали и, сле-

довательно, на ее взаимодействия с други-

ми молекулами. Точнее, отрицательная

суперспирализация может приводить к рас-

кручиванию двойной спирали. Интересно от-

метить, что почти все кольцевые молекулы

ДНК, встречающиеся в природе, отрица-

тельно суперспирализованы.

Важная характеристика замкнутой коль-

цевой ДНК - ее порядок зацепления L (от

англ. linking). Число L указывает, сколько

раз одна цепь пересекает другую цепь, если

их спроецировать на плоскость. Число

L должно быть целым. Кручение Т (от

англ. twisting) и величина суперспирализа-

ции W (от англ. writhe) связаны между со-

бой уравнением

L = W + Т,

т.е. находятся в обратной зависимости.

Порядок зацепления - топологическая ха-

рактеристика; она может изменяться, лишь

когда в одну или в обе цепи кольцевой

ДНК вносятся разрывы. Действительно,

были выделены ферменты, которые ката-

литически изменяют величину L. Катали-

тическую активность таких топоизомераз

легко выявить с помощью гель-электрофо-

реза, так как суперспирализованная ДНК

более компактна и поэтому имеет боль-

шую подвижность, чем релаксированная

ДНК (рис. 24.24).

Рис. 24.23. Электронные микрофотогра-

фии митохондриальной ДНК:

А - релаксированная кольцевая

форма; Б - суперспирализован-

ная кольцевая форма. (Печа-

тается с любезного разрешения

д-ра David Clayton.)

24.12. Открытие ДНК-полимеразы

Перейдем теперь к молекулярному меха-

низму репликации ДНК. Артур Корнберг

(Arthur Kornberg) и его коллеги в 1955 г.

начали поиск фермента, синтезирующего

ДНК. Вскоре этот поиск увенчался успе-

хом, главным образом потому, что при

планировании экспериментов были при-

няты три правильных решения, т.е. был

сделан правильный выбор между несколь-

кими возможностями.

1. Что представляют собой активиро-

ванные предшественники ДНК? Корнберг

и его коллеги сделали правильное предпо-

ложение, что активированные промежу-

точные продукты синтеза ДНК - дезоксири-

бонуклеозид-5'-трифосфаты. В основе это-

24. ДНК: генетическая роль,

структура и репликация

Рис. 24.24. Фотографии гелей, на которых

видна релаксация суперспира-

лизованной ДНК вируса SV-40.

Дорожка А - суперспирализо-

ванная ДНК с большим чис-

лом отрицательных витков.

При инкубации ДНК с топои-

зомеразой в течение 5 мин (Б)

и 30 мин (В) образуется ряд по-

лос с более низкой степенью су-

перспирализации. [Keller W.,

Proc. Nat. Acad. Sci., 72, 2553

(1975).]

го предположения лежали два соображе-

ния. Во-первых, пути биосинтеза пуринов

и пиримидинов приводят к образованию

нуклеозид-5'-фосфатов (а не нуклеозид-3'-

фосфатов). Во-вторых, активированным

промежуточным продуктом синтеза пиро-

фосфатной связи в таких коферментах, как

NAD

, FAD и СоА, является АТР.

2. Что может служить критерием синте-

за ДНК? Предполагалось, что абсолютное

количество ДНК, синтезированной в пер-

воначальных экспериментах, должно быть

весьма невелико, главным образом из-за

обилия нуклеаз. Поэтому нужен был ка-

кой-то чувствительный тест. Был разрабо-

тан такой тест с использованием радиоак-

тивных нуклеотидов-предшественников.

Включение этих предшественников в ДНК

обнаруживали путем измерения радиоак-

Часть IV.

Информация

тивности в осадке, полученном после обра-

ботки инкубационной смеси кислотой. В ос-

нове этого метода лежит тот факт, что

ДНК осаждается кислотами, например

трихлоруксусной кислотой, а нуклеотиды-

предшественники остаются в растворе.

3. Какие клетки следует выбрать для ис-

следования? После того как первона-

чальные эксперименты с экстрактами жи-

вотных клеток дали отрицательные резуль-

таты, выбор пал на бактерии Е. coli,

поскольку деление этих клеток происходит

всего лишь за 20 мин (время генерации), и,

следовательно, их можно выращивать

в больших количествах. Как и предполага-

лось, эта бактерия исключительно богата

ферментами, участвующими в синтезе

ДНК.

Экстракт Е. coli инкубировали с радиоак-

тивным дезокситимидин-5'-трифосфатом.

Радиоактивность этого

С-меченного

предшественника составляла 1•10

имп./

мин. Радиоактивность осадка, полученного

добавлением к инкубационной смеси кис-

лоты, составляла всего 50 имп./мин. Было

синтезировано лишь несколько пикомолей

ДНК, но этим было положено начало.

Корнберг писал: «Хотя количество нуклео-

тида, включившегося в состав нуклеиновой

кислоты, было ничтожным, оно было су-

щественно выше уровня фона. Мы попро-

бовали забить клин в эту узенькую щелку.

Рис. 24.25. Электронная микрофотогра-

фия молекул ДНК-полиме-

разы (сферические структуры),

связанных с молекулой ДНК

(тонкая нить). (Печатается

с любезного разрешения д-ра

Jack Griffith.)

Рис. 24.26. Реакция элонгации цепи, ката-

лизируемая ДНК-полимера-

зой.

Молотком нам служила очистка фермен-

та - метод, отработанный при изучении

спиртового брожения».

Этот новый фермент был назван ДНК-

полимеразой (рис. 24.25). Теперь его назы-

вают ДНК-полимеразои I, так как с тех

пор были выделены другие ДНК-полиме-

разы. После десяти лет напряженной ра-

боты в лаборатории Корнберга ДНК-по-

лимераза I была очищена до гомогенного

состояния и детально охарактеризована.

Насколько велики были масштабы проде-

ланной работы, говорит тот факт, что для

получения 500 мг чистого фермента необ-

ходимо было взять 100 кг клеток E.coli.

ДНК-полимераза I - это единая полипеп-

тидная цепь с массой 109 кДа. Она катали-

зирует последовательное присоединение де-

зоксирибонуклеиновых звеньев к цепи ДНК:

(ДНК)

остатков

+ dNTP (ДНК)

n+1

+ РР

Для синтеза цепи ДНК ДНК-полимеразе

I необходимы следующие компоненты:

1. В среде должны присутствовать все

четыре дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфа-

та: dATP, dGTP, dTTP и dCTP. В дальней-

шем мы будем обозначать эти дезоксири-

бонуклеозидтрифосфаты общим символом

dNTP. Кроме того, необходимы ионы

Мg

2. ДНК-полимераза I присоединяет де-

зоксирибонуклеотиды к 3'-гидроксильному

концу предсуществующей цепи ДНК (или

РНК). Другими словами, необходима за-

травочная цепь, или затравка, со свобод-

ной 3'-гидроксильной группой.

3. Необходима матричная ДНК. Матри-

цей может служить как одно- так и двухце-

почечная ДНК. Двухцепочечная ДНК слу-

жит эффективной матрицей лишь в том

случае, если ее сахарофосфатный остов

разорван в одном или нескольких местах.

Реакция элонгации (удлинения) цепи, ка-

тализируемая ДНК-полимеразой, происхо-

дит путем нуклеофильной атаки 3'-ОН-кон-

цом матрицы ближайшего к рибозе атома

фосфора очередного дезоксирибонуклеозид-

трифосфата. В результате образуется фос-

фодиэфирный мостик и одновременно выс-

вобождается пирофосфат (рис. 24.26). По-

следующий гидролиз пирофосфата обеспе-

чивает дальнейшую полимеризацию. Такое

смещение общего состояния равновесия

было бы невозможно, если бы активиро-

ванными промежуточными продуктами

служили нуклеозиддифосфаты. Именно

в этом мы усматриваем убедительную

причину преобладания нуклеозидтрифос-

фатов по сравнению с дифосфатами в каче-

стве активированных предшественников

в биосинтетических реакциях. Элонгация

цепи ДНК происходит в направлении 5'—>

—>3' (рис. 24.27). За секунду одна молекула

ДНК-полимеразы I присоединяет пример-

но 10 нуклеотидов. Полимеризация процес-

24. ДНК: генетическая роль,

структура и репликация

Рис. 24.27. ДНК-полимеразы катализи-

руют рост цепей ДНК в напра-

влении 5'—>3'.

сивна, т. е. фермент присоединяет много ну-

клеотидов, оставаясь связанным с одной

матрицей.

24.13. ДНК-полимераза получает

инструкции от матрицы

ДНК-лолимераза катализирует образова-

ние фосфодиэфирной связи только в том

случае, если основание очередного нуклео-

тида комплементарно соответствующему

основанию матричной цепи. Если же осно-

вание очередного нуклеотида не образует

уотсон-криковской пары с соответствую-

щим основанием матричной цепи, вероят-

ность образования ковалентной связи

очень низка. Следовательно, ДНК-полиме-

раза - фермент, направляемый матрицей.

Она была открыта первой из ферментов

такого типа.

Ряд экспериментов доказывает, что ДНК-

полимераза получает инструкции от ма-

трицы.

1. Первым доводом в пользу этого утвер-

ждения послужил тот факт, что значи-

тельный синтез ДНК идет только в при-

сутствии всех четырех дезоксирибонуклео-

зидтрифосфатов и матричной ДНК,

2. ДНК-полимераза может включать

в ДНК некоторые аналоги оснований. На-

пример, урацил или 5-бромурацил может

замещать тимин. Гипоксантин может заме-

щать гуанин. Способность аналогов заме-

щать основания высоко специфична. Со-

гласно правилу замещения, тот или иной

аналог может включаться лишь при усло-

вии, что он способен образовать уотсон-

криковскую пару с основанием, комплемен-

тарным замещаемому основанию. Так, ги-

поксантин может замещать G (но не А, Т

Часть IV.

Информация

и С), поскольку он образует подходящую

пару оснований с цитозином.

3. Нуклеотидный состав новосинтезиро-

ванной ДНК зависит от характера ма-

трицы, а не от относительного количества

четырех нуклеотидов-предшественников.

Образующаяся ДНК имеет тот же нуклео-

тидный состав, что и двухспиральная ма-

тричная ДНК. Из этого следует, что под

действием ДНК-полимеразы реплицируют-

ся обе цепи матричной ДНК.

4. Наиболее убедительным доводом слу-

жат данные о том, что ДНК фага φХ174,

реплицированная in vitro ДНК-полимера-

зой I, полностью инфекционна. Следова-

тельно, частота, с которой этот фермент

делает ошибки, очень низка.

24.14. ДНК-полимераза I исправляет

ошибки в ДНК

ДНК-полимераза обладает еще одним ви-

дом ферментативной активности: в опреде-

ленных условиях она способна расщеплять

цепи ДНК. ДНК-полимераза постепенно

гидролизует цепь ДНК с 3'-гидроксильно-

го конца. При этом отщепляются монону-

клеотиды. Таким образом, ДНК-полимера-

за I является также 3'—>5'-экзонуклеазой

(рис. 24.28). Удаляемый нуклеотид должен

иметь свободный 3'-ОН-конец и не должен

находиться в составе двойной спирали.

Является ли такая экзонуклеазная актив-

ность фермента нежелательным побочным

эффектом, или она каким-то образом уча-

ствует в биологическом действии ДНК-по-

лимеразы? Эксперименты с использова-

нием химически синтезированных полину-

клеотидов с некомплементарным остатком

на конце затравки показали, что 3'—>

—>5'-экзонуклеазная активность выпол-

няет в процессе полимеризации функцию ре-

дактирования. Рассмотрим полимер, пока-

занный на рис. 24.28, в котором последова-

тельность остатков dT образует двойную

спираль с более длинным полимером dA.

На 3'-конце этой poly(dT)-последователь-

ности имеется один остаток dC, который

не образует водородных связей, так как он

не комплементарен dA. При добавлении

ДНК-полимеразы и dTTP этот некомпле-

ментарный остаток dC отщепляется рань-

ше, чем начинается присоединение остат-

ков dT. Эксперименты с использованием

множества различных синтетических поли-

меров показали, что ДНК-полимераза

I всегда удаляет некомплементарные

остатки на конце затравки, прежде чем

продолжать полимеризацию. Если на конце

находится комплементарное основание и

в среде присутствуют активированные

предшественники, гидролиза практически

не происходит. Полимеризация предотвра-

щает гидролиз с 3'-конца.

По всей вероятности, репликация ДНК

идет с высокой точностью, так как спарива-

ние оснований проверяется дважды. В тех

случаях, когда пара оснований не вмещает-

ся в двойной спирали, полимеризация обы-

чно не идет. Однако, если на этом этапе

все-таки произойдет ошибка, она может

быть исправлена раньше, чем будет при-

соединен следующий нуклеотид. Таким

образом, ДНК-полимераза I проверяет ре-

зультат каждого проведенного акта поли-

меризации, прежде чем перейти к следую-

щему.

Кроме того, ДНК-полимераза I может

гидролизовать ДНК, начиная с 5'-конца це-

пи. Эта 5'—>3'-нуклеазная активность

(рис. 24.29) существенно отличается от об-

суждавшейся выше 3'—>5'-экзонуклеазной

активности. Во-первых, расщепляемая

связь должна находиться в двухспираль-

ном участке. Во-вторых, может происхо-

дить расщепление как концевой фосфодиэ-

фирной связи, так и связи, расположенной

на расстоянии нескольких нуклеотидов от

5'-конца (который может иметь свободную

или фосфорилированную гидроксильную

группу). В-третьих, 5'—>3'-нуклеазная ак-

тивность увеличивается, если одновремен-

но идет синтез ДНК. В-четвертых, ак-

тивный участок 5'—>3'-нуклеазной актив-

ности четко отделен от активных участков

полимеризации и 3'—>5'-гидролиза. ДНК-

полимеразу I можно расщепить протеоли-

тическими ферментами на фрагмент с мас-

сой 36 кДа, содержащий всю 5'—>

—>3'-нуклеазную активность, и фрагмент

с массой 75 кДа, содержащий всю полиме-

разную и всю 3'—>5'-экзонуклеазную ак-

тивности. Таким образом, ДНК-полимера-

за I содержит по меньшей мере два

Рис. 24.28. 3'—>5'-экзонуклеазная актив-

ность ДНК-полимеразы I.

Рис. 24.29. 5'—>3'-нуклеазная активность

ДНК-полимеразы I.

различных фермента в одной полипептид-

ной цепи. 5'—>3'-нуклеаза дополняет 3'—>

—>5'-экзонуклеазную активность, исправляя

ошибки другого рода. Например, 5'—>

—>3'-нуклеаза участвует в вырезании пири-

24. ДНК: генетическая роль,

структура и репликация

Рис. 24.30. ДНК-лигаза катализирует со-

единение двух цепей ДНК, вхо-

дящих в состав одной двухспи-

ральной молекулы.

Рис. 24.31. Ковалентный промежуточный

комплекс фермент—AMP.

мидиновых димеров, образующихся при

облучении ДНК ультрафиолетом (разд.

24.24). Более того, 5'—>3'-нуклеазная ак-

тивность играет ключевую роль в самой

репликации ДНК (разд. 24.19).

24.15. ДНК-лигаза соединяет

фрагменты ДНК

ДНК-полимераза I может присоединять

дезоксирибонуклеотиды к затравочной це-

пи, но она не способна катализировать со-

единение двух цепей ДНК или замыкание

одной цепи ДНК. Обнаружение кольцевой

ДНК указывало, что такой фермент дол-

жен существовать. В 1967 г. в нескольких

лабораториях одновременно была открыта

ДНК-лигаза - фермент, катализирующий

образование фосфодиэфирной связи между

двумя цепями ДНК (рис. 24.30). Фермент

этот активен при наличии свободной

ОН-группы на 3'-конце одной цепи ДНК и

Часть IV.

Информация

фосфатной группы на 5'-конце другой. Об-

разование фосфодиэфирной связи между

этими группами - эндергоническая реакция.

Следовательно, для реакции соединения це-

пей требуется источник энергии. У Е. coli

и других бактерий эту роль выполняет

NAD

, тогда как в клетках животных и за-

раженных бактериофагом клетках данная

реакция осуществляется за счет энергии

АТР.

Заслуживает внимания и еще один ас-

пект работы ДНК-лигазы: ДНК-лигаза не

может соединить две молекулы одноцепо-

чечной ДНК. Цепи ДНК, соединяемые

ДНК-лигазой, должны быть частью двух-

цепочечной молекулы ДНК. Исследования

модельных систем дают основание думать,

что ДНК-лигаза образует фосфодиэфир-

ную связь только в том случае, если вбли-

зи от места разрыва имеется хотя бы не-

сколько пар оснований. В действительно-

сти ДНК-лигаза заделывает одноцепо-

чечные разрывы в остове двухспиральной

ДНК. Этот процесс необходим для нор-

мального синтеза ДНК, для репарации по-

врежденной ДНК и для сращивания

(сплайсинга) цепей ДНК при генетической

рекомбинации.

Рассмотрим механизм этой реакции,

установленный Робертом Леманом (Robert

Lehman). ATP или NAD

вступают в реак-

цию с ДНК-лигазой и образуют ковалент-

ный комплекс фермент-AMP, в котором

AMP связан с ε-аминогруппой лизинового

остатка фермента фосфоамидной связью

(рис. 24.31). Остаток AMP активирует фос-

фатную группу на 5'-конце ДНК. Послед-

няя стадия - нуклеофильная атака активи-

рованного атома фосфора 3'-ОН-группой.

В результате образуется фосфодиэфирная

связь и освобождается AMP. Движущая

сила этой последовательности реакций - ги-

дролиз пирофосфата, отщепляющегося при

образовании комплекса фермент—адени-

лат. Таким образом, на образование фосфо-

диэфирной связи в остове ДНК расходуют-

Рис. 24.32. Механизм реакции, катализи-

руемой ДНК-лигазой.

ся две богатые энергией фосфатные связи.

если источником энергии служит АТР.

24.16. Открытие ДНК-полимераз II и III

Мы видели, что ДНК-полимераза I может

синтезировать и репарировать ДНК in vitro.

Выполняет

ли она эти

функции

vivo?

Во-

прос вполне правомерный, так как фермент

не всегда способен осуществлять in vivo ту

реакцию, которую он катализирует in vitro.

Условия, существующие в клетке, могут от-

личаться от условий, используемых при по-

становке опытов in vitro, и, кроме того,

в клетке могут присутствовать другие фер-

менты. Действительно, в клетке E.coli

имеются по меньшей мере две другие ДНК-

полимеразы, названные полимеразами II

и III, которые были обнаружены примерно

через 15 лет после открытия ДНК-полиме-

разы I. Чем же объясняется такое запазды-

вание? Дело в том, что активность ДНК-по-

лимераз II и III маскировалась высокой

активностью полимеразы I.

Ситуация изменилась в 1969 г., когда Пау-

ла Де Лусия и Джон Кэрнс (Paula DeLucia,

John Cairns) выделили мутантную форму

E.coli, в экстракте которого обнаруживалось

от 0,5 до 1% нормальной полимеразной ак-

тивности ДНК-полимеразы I по сравнению

с обычными клетками. Этот мутант (обо-

значенный polA 1) размножался с такой же

скоростью, как и родительский штамм.

Кроме того, многие фаги размножались

в клетках polA 1 так же хорошо, как и в ро-

дительских клетках. Однако этот мутант го-

раздо быстрее погибал под действием уль-

трафиолетового облучения. К тому же

мутант polA 1 был более чувствителен к ле-

тальному действию химического мутагена

метилметансульфоната. Де Лусия и Кэрнс

сделали вывод, что репликация ДНК в клет-

ках полученного ими мутанта polA 1 идет

нормально, но репарация ДНК существенно

нарушена. Они предположили, что для син-

теза ДНК нужна какая-то другая полимера-

за, отличная от ДНК-полимеразы I.

Низкий фон активности полимеразы I

у мутанта polA 1 облегчил поиск новых

ДНК-полимераз. Вскоре в нескольких лабо-

раториях были выделены и охарактеризо-

ваны два таких фермента. ДНК-полимеразы

II и III подобны полимеразе I в следующих

отношениях:

1. Они катализируют направляемый ма-

трицей синтез ДНК из предшественников

дезоксирибонуклеозидтрифосфатов.

2. Для проявления их активности необхо-

дима затравка со свободной 3'-ОН-группой,

3. Синтез идет в направлении 5'—>3'.

4. Они обладают 3'—>5'-экзонуклеазной

активностью. ДНК-полимераза III (но не II)

является также 5'—>3'-нуклеазой.

Эти полимеразы различаются по характе-

ру предпочитаемых ими матриц. Для поли-

мераз II и III оптимальными матрицами

служат двухцепочечные ДНК, имеющие ко-

роткие одноцепочечные пробелы. Полиме-

раза I, наоборот, предпочитает протя-

женные одноцепочечные участки, сосед-

ствующие с двухспиральными участками.

Максимальные скорости катализа in vitro

для этих ферментов также различаются: по-

лимераза I присоединяет 10 нуклеотидов

в секунду, а полимераза II - 0,5 и полимераза

III - 150 нуклеотидов в секунду. В физиоло-

гически активном состоянии ДНК-полиме-

раза III ассоциирована с некоторыми други-

ми белками. Этот мультисубъединичный

комплекс называют голоферментом ДНК-

полимеразы III.

Какова роль этих полимераз in vivo?

Вскоре мы расскажем о том, что мультифер-

ментный комплекс, содержащий ДНК-поли-

меразу III, синтезирует большую часть но-

вообразующейся ДНК, а ДНК-полимераза

I удаляет затравку и заполняет пробелы.

Роль ДНК-полимеразы II пока не устано-

влена. Проведенные в последнее время био-

24. ДНК: генетическая роль,

структура и репликация

Рис. 24.33. Положение структурных генов

трех ДНК-полимераз Е. coli.

Ген ДНК-полимеразы I распо-

ложен в локусе polA, ген ДНК-

полимеразы II - в локусе polB

и ген ДНК-полимеразы III - в

локусе dnaE.

химические и генетические исследования по-

казали, что, кроме ДНК-полимераз I и II

и ДНК-лигазы, для репликации ДНК в клет-

ке E.coli необходимо более 10 белков. Пре-

жде чем рассмотреть взаимодействие этих

белков с ДНК, познакомимся в общих чер-

тах с репликацией на уровне целой хромо-

сомы.

24.17. Расплетание родительской ДНК

и синтез новой ДНК происходят

в репликационной вилке

Изображения ДНК во время репликации

были получены с помощью радиоавтогра-

фии и электронной микроскопии. При ра-

диоавтографии изображение образуется

в результате распада подходящего изотопа,

например трития. Испускаемые электроны

взаимодействуют с гранулами серебра фо-

тографической эмульсии. После проявления

пленки возникают черные точки. Метод ра-

диоавтографии имеет довольно низкую раз-

решающую способность - порядка несколь-

ких сотен ангстрем. Однако у этого метода

есть определенное преимущество: он позво-

ляет видеть лишь те молекулы, которые со-

держат метку. Для того чтобы сделать ДНК

видимой при радиоавтографии, в нее вклю-

чают тимин или тимидин, меченный три-

тием.

Часть IV.

Информация

Рис. 24.34. Радиоавтограф реплицирую-

щейся ДНК Е. coli. (Печатается

с любезного разрешения д-ра

John Gairns.)

На радиоавтографах и электронных ми-

крофотографиях видно, что реплицирую-

щаяся ДНК E.coli имеет форму замкнутого

кольца с внутренней петлей (рис. 24.34). Мо-

лекулы такой формы называют тета-струк-

турами, так как они напоминают греческую

букву θ (рис. 24.35). Тета-структуры показы-

вают, что молекулы ДНК сохраняют во вре-

мя репликации кольцевую форму. Разреше-

ние этого метода недостаточно велико,

чтобы различить свободные концы. Однако

очевидно, что длинных нитей одноцепочеч-

ной ДНК в молекуле нет. Таким образом,

эти изображения позволяют отвергнуть ме-

ханизм репликации, согласно которому це-

пи родительской ДНК сначала полностью

раскручиваются, и только затем исполь-

зуются в качестве матриц при синтезе новой

ДНК. Напротив, синтез новой ДНК сопря-

жен с одновременным раскручиванием роди-

тельской ДНК. Участок, где происходит

одновременное расплетание и синтез, назы-

вается репликационной вилкой.

24.18. Репликация ДНК начинается в строго

определенном месте и продолжается

последовательно в обоих направлениях

Начинается ли репликация ДНК E.coli

в произвольном месте хромосомы, или же

в хромосоме имеется определенный участок

инициации? Репликация ДНК - строго регу-

лируемый процесс, поэтому a priori кажет-

ся гораздо более вероятным, что она на-

чинается в определенном месте. Действи-

тельно, как показали работы по определе-

нию относительного числа различных генов

в условиях быстрого синтеза ДНК, реплика-

ция в клетках E.coli начинается в одном

определенном месте хромосомы. Рассмо-

трим два гена - а и b. Предположим, что ген

а расположен вблизи от точки начала репли-

кации, а ген b - вблизи от конца. Тогда ген

а будет реплицироваться намного раньше,

чем ген b. В быстро растущей культуре на

один ген b будет приходиться примерно два

гена а. Если же, наоборот, репликация ДНК

начинается в случайной точке, количество

генов а и b будет одинаковым. Относитель-

ное число генов было определено с по-

мощью метода гибридизации, который рас-

сматривается ниже (разд. 25.5). Результаты

этих экспериментов ясно показали, что от-

носительное число генов действительно за-

висит от их положения на карте (рис. 24.36).

Эти данные позволили сделать следующие

выводы.

1. Репликация начинается в строго опре-

деленном уникальном участке - вблизи гена

ilv, локализованного на 74' на стандартной

генетической карте E.coli.

2. Репликация идет одновременно в обо-

их направлениях с примерно одинаковой

Рис. 24.35. Схематическое изображение

кольцевой хромосомы Е. coli во

время репликации. Синими

линиями в этой тета-структуре

показана родительская ДНК,

красными - новообразованная

ДНК.

Рис. 24.36. Относительные количества

различных генов в условиях

быстрого синтеза ДНК у Е. coli

в зависимости от их положения

на генетической карте.

24. ДНК: генетическая роль,

структура и репликация

скоростью. Другими словами, существуют

две репликационные вилки: одна движется по

часовой стрелке, другая - против часовой

стрелки.

3. Две репликационные вилки встречают-

ся вблизи маркера trp (25' на генетической

карте) - в точке, почти диаметрально проти-

воположной началу репликации.

Еще одно доказательство двунаправлен-

ности репликации ДНК у E.coli было полу-

чено методом радиоавтографии. Для этого

вначале репликацию проводили в среде, со-

державшей тимин, меченный тритием до

умеренной удельной радиоактивности. Че-

рез несколько минут инкубации бактерии

перенесли в среду, содержавшую высокоме-

ченный тритием радиоактивный тимин.

Пробы с двумя различными уровнями ра-

диоактивности использовались для того,

чтобы получить на радиоавтографах два ти-

па цепочек зерен серебра: цепочки с низкой

плотностью зерен, соответствующие ДНК,

синтезированной вначале, и цепочки с высо-

кой плотностью, соответствующие ДНК,

синтезированной позже. Если бы реплика-

ция шла в одном направлении, были бы

видны цепочки с высокой плотностью зерен

на одном конце и низкой плотностью на

другом. Если же репликация идет в двух на-

правлениях, середина каждого отпечатка

ДНК должна была бы иметь низкую плот-

ность зерна, а концы - высокую (рис. 24.37).

Радиоавтографы дали наглядный ответ

(рис. 24.38). Цепочки зерен серебра (отпечат-

ки ДНК) во всех случаях имели более высо-

кую плотность зерен на обоих концах, чем

посередине, указывая тем самым, что репли-

кация хромосомы E.coli идет в двух напра-

влениях.

24.19. Одна цепь ДНК синтезируется

прерывисто

Вернемся к взаимодействию молекул при

репликации. В области репликационной

вилки обе цепи родительской ДНК служат

матрицами для синтеза новой ДНК. Напом-

ним, что цепи родительской ДНК антипа-

раллельны. Следовательно, общее направле-

ние синтеза ДНК должно быть 5'—>3' для

одной из дочерних цепей и 3'—>5' для другой

(рис. 24.39). Однако все известные ДНК-по-

лимеразы синтезируют ДНК в направлении

5'—>3', а не 3'—>5'. Как же тогда происходит

Часть IV.

Информация

Рис. 24.37. Предполагаемые результаты

радиоавтографии в случае

одно- и двунаправленной ре-

пликации, если бактерий пере-

носят со среды, содержащей ти-

мин с умеренной радиоактив-

ностью, на среду с высокора-

диоактивным тимином.

Рис. 24.38. Радиоавтограф ДНК Е. coli во

время репликации (условия

опыта указаны в подписи

к рис. 24.37). Наблюдаемое

распределение зерен серебра

показывает, что репликация

идет в двух направлениях.

[Prescott D. M., Kuempel P.L.,

Proc. Nat. Acad. Sci, 69, 2842

(1972).]

Рис. 24.39. При низком разрешении кажу-

щееся направление репликации

ДНК будет 5'—>3' для одной

дочерней цепи и 3'—>5' для

другой. На самом деле обе цепи

синтезируются в направлении

5'—>3', как показано на

рис. 24.40.