Страйер Л. Биохимия. Том 3

Подождите немного. Документ загружается.

Рис. 32.5. Синтез UDP-NAG.

Рис. 32.6. Синтез UDP-NAM.

единиц и потому высокогидрофобный в от-

личие от UDP. По-видимому, именно бла-

годаря гидробофному характеру этого

-липида новообразованное углевод-пеп-

тидное звено преодолевает барьер прони-

цаемости, которым служит клеточная мем-

брана.

Вспомним, что другой высокогидро-

фобный переносчик - долихолфосфат - уча-

ствует в синтезе олигосахаридов, соста-

вляющих сердцевину (олигосахаридного

«ядра») гликопротеинов у эукариот

(разд. 29.31).

32.5. Синтез дисахарид-пептидного звена,

прикрепленного к липидному переносчику

Следующий этап - присоединение NAG

к остатку NAM в углевод-пептидном звене,

прикрепленном к липидному переносчику.

Донор активированного углевода UDP-

NAG вступает в реакцию с С-4 остатка NAM

и между этими сахарами образуется β-1,4-

гликозидная связь (рис. 32.9). Далее в ходе

АТР-зависимой реакции NH

амидирует

свободную α-карбоксильную группу D-глу-

таминовой кислоты в пептиде. Вслед за этим

на ε-аминогруппе остатка лизина в пептиде

выстраивается пентаглициновый мостик.

32. Оболочки бактериальных

клеток

221

Рис. 32.7. Синтез пентапептида на

UDP-NAM.

Рис. 32.8. Структура липидного перено-

счика, участвующего в биосин-

тезе клеточных стенок.

Рис. 32.9. Синтез дисахарид-пептидного

звена на липидном переносчи-

ке.

Этот пентапептид синтезируется путем по-

следовательного присоединения глициновых

остатков, доставляемых глицил-тРНК. Это

единственный случай, когда тРНК служит

донором аминокислот в ходе внерибосом-

ного синтеза пептида. На этом завершается

образование основной структурной еди-

ницы клеточной стенки.

32.6. Перенос дисахарид-пептидного звена

на растущую полисахаридную цепь

Дисахарид-пептидное звено переносится ли-

пидным переносчиком на нередуцирующий

конец растущей полисахаридной цепи. Реак-

222

Часть V.

Молекулярная физиология

ция протекает таким ооразом. Атом углеро-

да С-1 остатка NAM находится в активиро-

ванном состоянии, поскольку он связан

с липидным переносчиком пирофосфатной

связью. Поэтому он вступает в реакцию

с С-4 концевого остатка NAG растущей по-

лисахаридной цепи, образуя в итоге β-1,4-

гликозидную связь (рис. 32.10).

Липидный переносчик высвобождается

в форме пирофосфата и далее гидролизует-

ся до монофосфата специфической фосфата-

зой. Этот этап дефосфорилирования пред-

ставляет собой, по существу, регенерирова-

ние переносчика, способного акцептировать

углевод-пептидное звено от UDP. Известен

пептидный антибиотик бацитрацин, ингиби-

рующий биосинтез клеточных стенок путем

торможения этого этапа:

Рис. 32.10. Перенос дисахарид-пептидно-

го звена на растущую полиса-

харидную цепь.

32.7. Поперечные мостики между

полисахаридными цепями образуются

в реакции транспептидирования

В результате реакции транспептидирования

между полисахаридными цепями образуют-

ся поперечные сшивки, что приводит к фор-

мированию одной огромной молекулы, на-

поминающей по виду мешок. В ходе

транспептидирования концевая аминогруппа

одного пентаглицинового мостика атакует

пептидную связь между остатками

D-Ala-D-Ala другой пептидной единицы

(рис. 32.11). При этом образуется пептидная

связь между глицином и одним из остатков

D-аланина, а второй остаток D-аланина выс-

вобождается. Фермент, катализирующий

эту реакцию,- гликопептид-транспептидаза.

Обратите внимание, что синтез этой попе-

речной связи не требует расхода АТР: реак-

ция идет за счет свободной энергии, уже со-

держащейся в связи D-Аlа-D-Аlа. Формиро-

вание пептидной связи таким необычным

способом определяется, очевидно, тем, что

реакция протекает вне клетки, т.е. в остсут-

ствие АТР. Вспомните, что путем трансами-

нирования без использования АТР обра-

зуются пептидные связи при поперечной

сшивке нитей фибрина (разд. 8.21).

32.8. У грам-положительных бактерий

пептидогликан покрыт тейхоевой кислотой

Поверхность грам-положительных бакте-

рий состоит из тейхоевой кислоты, которая

представляет собой полимер остатков гли-

церола (или другого углевода, например ри-

битола), соединенных фосфодиэфирными

мостиками (рис. 32.12). Свободные гидрок-

сильные группы этерифицируются с алани-

ном или сахарами, в частности с глюкозой.

Тейхоевая кислота присоединяется к скелету

пептидогликана - последовательности

остатков NAG-NAM - фосфодиэфирной

связью. Удлинение цепей тейхоевой кис-

лоты происходит путем переноса глицерол-

фосфата от CDP-глицерола на свободную

концевую ОН-группу цепи. Остатки глю-

козы присоединяются к гидроксильным

группам скелета тейхоевой кислоты в ходе

реакции с UDP-глюкозой.

Рис. 32.11. Аминогруппа пентаглициново-

го мостика атакует пептидную

связь между двумя остатками

D-Ala; в результате форми-

руется поперечная связь (сшив-

ка).

32. Оболочки бактериальных

клеток

223

Рис. 32.12. Строение тейхоевой кислоты.

32.9. Пенициллин вызывает гибель

растущих бактерий, ингибируя синтез

клеточных стенок

Пенициллин был открыт в 1928 г. Алексан-

дером Флемингом (Alexcander Fleming) до-

вольно случайно.

При работе с различными штаммами стафи-

лококка часть чашек с культурами откладыва-

ли в лабораторную коллекцию и время от

времени просматривали. Поскольку, когда

чашки просматривали, их приходилось откры-

вать, в чашки неизбежно попадали из воздуха

различные микроорганизмы. Обратили внима-

ние на то, что вокруг большой колонии пророс-

шей плесени колонии стафилококка стали про-

зрачными и явно подвергались лизису.

Плесень пересеяли и далее стали проводить

предварительное изучение того бактериологи-

ческого вещества, которое, очевидно, синтези-

ровалось плесенью и диффундировало в окру-

жающую среду. Оказалось, что бульон,

в котором на протяжении 1-2 недель при ком-

натной температуре культивировали плесень,

приобретал выраженные ннгибирующие, бак-

терицидные и бактериолитические свойства

в отношении многих распространенных пато-

генных бактерий.

Далее было обнаружено, что экстракт из

плесени Pinicillium при введении животным

не оказывал заметного токсического дей-

ствия. Это послужило стимулом для даль-

нейших исследований. Однако, когда Фле-

минг попытался сконцентрировать и очи-

224

Часть V.

Молекулярная физиология

стить активный антибиотик, по его словам,

оказалось, что «пенициллин легко разру-

шается, и, несмотря на все усилия, мы потер-

пели неудачу. Мы были бактериологи, а не

химики, и наши относительно простые при-

емы не принесли успеха».

Прошло 10 лет, прежде чем к пеницилли-

ну вернулись снова. Патолог Хоуард Флори

(Howard Florey) и биохимик Эрнст Чейн

(Ernst Chain) провели ряд глубоких исследо-

ваний, итогом которых явилось выделение,

химическая характеристика и клиническое

использование этого антибиотика. Пени-

циллин состоит из тиазолидинового кольца,

сочлененного с β-лактамным кольцом,

в одном из положений которого находится

тот или иной заместитель (R), присоеди-

ненный с помощью пептидной связи. В бен-

зилпенициллине, например, R является бен-

зильной группой (рис. 32.13 и 32.14). Эта

структура может подвергаться различным

трансформациям, что служит причиной ла-

бильности пенициллина, с которой впервые

столкнулся Флеминг. Особенно неустойчи-

во β-лактамное кольцо. Как будет показано

ниже, это свойство имеет прямое отношение

к антибиотической активности пеницил-

лина.

В 1957 г. Джошуа Ледерберг (Joshua

Lederberg) показал, что бактерии, в обычных

условиях чувствительные к пенициллину,

могут расти в присутствии этого антибиоти-

ка, если используется гипертоническая сре-

да. Выращенные таким образом микроорга-

низмы, так называемые протопласты, ли-

Рис. 32.13. Высокореакционноспособный

участок пенициллина - пептид-

ная связь β-лактамного кольца.

В положении R могут стоять

различные заместители (вариа-

бельная группа); в бензилпени-

циллине R - бензильная группа.

шены клеточных стенок и потому при

переносе в обычную среду подвергаются ли-

зису. Отсюда был сделан вывод, что пени-

циллин препятствует синтезу клеточных сте-

нок бактерий. В 1965 г. Джеймс Парк

и Джек Стромингер (James Park, Jack

Strominger) независимо друг от друга при-

шли к выводу, что пенициллин блокирует

последний этап биосинтеза, а именно обра-

зование поперечных сшивок.

32.10. Пенициллин блокирует синтез

клеточных стенок путем ингибирования

реакции транспептидирования

Пенициллин ингибирует транспептидазу,

поперечно сшивающую цепи протеоглика-

на:

При нормальном течении реакции транс-

пептидаза образует в качестве промежуточ-

ного продукта ацильное производное с остат-

ком D-аланина в предпоследнем положении

пептида (рис. 32.15). Этот промежуточный

продукт взаимодействует далее с амино-

группой концевого глицина другого пепти-

да. Как показали недавно проведенные ис-

следования, пенициллин ингибирует транс-

пептидазу путем образования ковалентной

связи с остатком серина в активном центре

фермента (рис. 32.16). Комплекс пеницилли-

ноил-фермент не подвергается деацилирова-

нию. В результате ингибирование транспеп-

тидазы пенициллином оказывается необра-

тимым.

Почему пенициллин является столь эф-

фективным ингибитором транспептидазы?

С помощью молекулярных моделей было

выявлено, что пенициллин сходен с одним из

субстратов фермента, а именно с ацил-D-

Ala-D-Ala (рис. 32.17). Кроме того, четырех-

членное β-лактамное кольцо пенициллина

имеет напряженную конформацию, вслед-

ствие чего пептидная связь в нем становится

высокореакционноспособной. В сущности,

пенициллин имеет, по-видимому, структуру

переходного состояния нормального суб-

страта этого фермента. Другими словами.

пенициллин - аналог переходного состояния.

Любопытно сравнить пенициллин с дру-

гими необратимыми ингибиторами фермен-

тов. Стабильный, неактивный пеницилли-

ноил-ферментный комплекс совершенно

аналогичен фосфорил-ферментному ком-

плексу, образующемуся при взаимодействии

органических фторфосфатов с ацетилхолин-

эстеразой или сериновыми протеиназами.

Однако специфичность пенициллина намно-

го выше, чем у фторфосфатных ингибито-

ров. Мишень действия пенициллина очень

строго задана его структурным сходством

с концевым участком D-Аlа-D-Аlа новообра-

зующейся цепи пептидогликана. След-

ствием этой исключительной специфичнос-

ти является низкая токсичность пеницилли-

на, столь ценная при клиническом использо-

вании. В организме человека нет ни одного

фермента, распознающего D-Ala-D-Ala, а по-

тому пенициллин не может помешать рабо-

те наших ферментов.

32.11. Некоторые бактерии резистентны

к пенициллину, так как синтезируют

разрушающий его фермент

Ряд бактерий синтезирует пенициллиназу -

фермент, способный расщеплять амидную

связь в β-лактамном кольце пенициллина

с образованием пенициллоиновой кислоты,

лишенной антибиотической активности:

32. Оболочки бактериальных

клеток

225

Рис. 32.14. Модель бензилпенициллина.

Был выделен целый ряд близких по струк-

туре пенициллиназ, имеющих массу около

30 кДа и высокое число оборотов (порядка

-1

). Активность фермента в значитель-

ной мере зависит от природы R-группы,

присоединенной к β-лактамному кольцу пе-

нициллина. Поэтому полусинтетические пе-

нициллины с R-группами, защищающими

их от действия пенициллиназы, представ-

ляют большую ценность для клинических

целей.

Ген, кодирующий пенициллиназу, локали-

зован в различных плазмидах (разд. 31.6).

Эти внехромосомные генетические эле-

менты у некоторых видов бактерий спо-

собны быстро появляться и исчезать. В ряде

бактериальных штаммов пенициллиназа

является индуцируемым ферментом. По-ви-

димому, пенициллиназа возникла в ходе эво-

люции как механизм детоксикации, посколь-

ку она свойственна только микроорганиз-

Рис. 32.15. В ходе реакции транспептиди-

рования в качестве промежу-

точного продукта образуется

ацил—фермент.

226

Часть V.

Молекулярная физиология

мам, клеточная стенка которых образована

пептидогликаном. Судя по тому, что утрата

гена пенициллиназы не вызывает поврежде-

ния клетки в отсутствие антибиотика, у фер-

мента, видимо, нет иной функции, кроме

инактивации пенициллина. К тому же

имеется хорошая корреляция между сте-

пенью устойчивости к действию пеницил-

лина и общей пенициллиназной актив-

ностью.

32.12. Грам-отрицательные бактерии

окружены наружной мембраной,

богатой липополисахаридами

Как уже упоминалось, клеточная оболочка

грам-отрицательных бактерий устроена бо-

лее сложно, чем клеточная оболочка грам-

положительных бактерий. У грам-отрица-

тельных микроорганизмов (например,

Escherichia coli или Salmonella typhimurium)

слой пептидогликана окружен наружной

мембраной, содержащей фосфолипиды, бел-

ки и липополисахариды. Эта наружная мем-

брана, подобно плазматической, имеет

структуру бислоя. Итак, грам-отрица-

тельные бактерии имеют две мембраны,

а грам-положительные - одну. Особенность

грам-отрицательных бактерий состоит так-

же в наличии водной прослойки между плаз-

матической мембраной и пептидогли-

кановым слоем. В этом периплазматичес-

ком пространстве содержится много бел-

ков, участвующих в связывании и транспор-

те сахаров и других питательных веществ

(разд. 37.20).

Липополисахариды (ЛПС) наружной мем-

браны представляют собой крайне необыч-

ные соединения, молекулы которых состоят

из трех частей: липида А, олигосахаридов

сердцевины («ядра») и О-боковой цепи

Рис. 32.16. Образование пенициллином

ферментного комплекса, обла-

дающего неограниченной ста-

бильностью.

Рис. 32.17. Конформация пенициллина

в области высокореакционно-

способной пептидной связи (А)

сходна с предполагаемой кон-

формацией структуры R-D-

Ala-D-Ala (Б) в переходном

состоянии при протекании

реакции транспептидирования.

[Lee В., J.Mol.Biol., 61, 464

(1971).]

(рис. 32.18). Липид А - это гидрофобная

часть большой (10 кДа) амфипатической

молекулы. Он включает шесть цепей насы-

щенных жирных кислот, присоединенных

к двум остаткам глюкозамина. Эти

ацильные цепи составляют примерно поло-

вину наружного слоя наружной мембраны.

Внутренний слой вместо цепей жирных кис-

лот содержит фосфолипиды (рис. 32.19). Да-

лее в молекуле липополисахарида идет

Рис. 32.18. Молекула липополисахарида

состоит из трех частей: липи-

да А, олигосахаридного «ядра»

и О-боковой цепи. Здесь пока-

зана последовательность саха-

ров, характерная для Salmonella

typhimurium. Сокращения:

Abe - абеквоза; EtN - этанол-

амин; Gal-галактоза; Glc-

глюкоза; GlcN - глюкоза-

мин; GlcNAc - N-ацетил-

глюкозамин; Hep - гептуле-

за; KDO - 2-кето-3-дезокси-

октонат; Man - манноза;

Rha - L-рамноза.

область олигосахаридного «ядра». Здесь де-

сять углеводных единиц вынесено кнаружи

от липида А; еще более наружно распола-

гается О-боковая цепь, состоящая из боль-

шого числа повторяющихся тетрасаха-

32. Оболочки бактериальных

клеток

227

Рис. 32.19. Молекулы липополисахаридов

локализованы в наружном

слое, тогда как фосфолипиды -

во внутреннем слое наружной

мембраны.

Рис. 32.20. Формулы ряда редких сахаров,

входящих в состав липополиса-

харидов.

ридных единиц. В этих двух областях

содержится несколько крайне редких в при-

роде углеводов, а именно 8-углеродный са-

хар 2-кето-3-дезоксиоктонат (КДО, KDO),

7-углеродный сахар гептоза, а также 6-угле-

родные сахара L-рамноза и абеквоза, в мо-

лекуле которых в положении С-6 стоит

—СН

вместо —СН

ОН (рис. 32.20). В от-

личие от ацильной части липида А олигоса-

228

Часть V.

Молекулярная физиология

хариды сердцевины и О-боковая цепь

высоко гидрофильны. Ряд сахаров в липо-

полисахариде фосфорилирован, и потому

молекула полисахарида в целом имеет от-

рицательный заряд.

Липополисахариды синтезируются в плаз-

матической мембране и затем транспорти-

руются в наружную мембрану. Сначала син-

тезируется липид А, а затем путем последо-

вательного присоединения сахаров (донора-

ми активированных сахаров служат соеди-

нения типа UDP-глюкозы или UDP-галак-

тозы) образуется полисахаридное «ядро».

О-боковая цепь собирается иным путем.

Ее повторяющееся тетрасахаридное зве-

но синтезируется на том же самом

-изопреноидном липидном переносчике,

который участвует в синтезе пептидоглика-

на (разд. 32.4). Растущая цепь таких единиц

удлиняется путем переноса олигосахарида

с одной молекулы переносчика на тетраса-

харидное звено, связанное с другой молеку-

лой переносчика (рис. 32.21). Аналогичный

способ удлинения имеет место при синтезе

жирных кислот (разд. 17.18) и белков

(разд. 27.16). Наконец, О-боковая цепь при-

соединяется к концу олигосахаридного

«ядра». По-видимому, повторяющийся те-

трасахарид О-боковой цепи образуется во

внутреннем слое плазматической мем-

браны, затем переносится в наружный слой

и там присоединяется к растущей цепи. Пол-

ностью сформированная молекула липопо-

лисахарида транспортируется из плазмати-

ческой мембраны в наружную, по-видимо-

му, в тех участках, в которых эти структуры

соприкасаются.

32.13. Благодаря разнообразию

О-боковых цепей грам-отрицательные

бактерии противостоят защитным силам

организма-хозяина

Липополисахариды содержат в высшей

степени необычные сахара и своеобразные

химические связи. Что дает такая вычур-

Рис. 32.21. Способ удлинения О-боковых

цепей.

Рис. 32.22. Изменение структуры О-бо-

ковых цепей бактерии Sal-

monella при заражении уме-

ренным фагом Р22.

ность? Ключ к решению этого вопроса был

получен при изучении мутантов, дефектных

по синтезу липополисахаридов. Липид А

и прилегающие к нему КДО олигосахарид-

ного «ядра», по-видимому, абсолютно необ-

ходимы для выживания. Цепи насыщенных

жирных кислот вносят определенный вклад

в барьерную функцию наружной мембраны,

благодаря которой периплазматические

белки не выходят наружу, а наиболее ядо-

витые вещества не проникают в клетку. Так,

пенициллин довольно плохо проходит

сквозь клеточную мембрану грам-отрица-

тельных бактерий. Кроме того, липид

А придает наружной мембране жесткость.

В отличие от липида А и олигосахаридного

«ядра» О-боковые цепи не являются жиз-

ненно важными. Например, любимый мно-

гими биохимиками штамм К12 Е. coli вооб-

ще лишен О-боковых цепей. Все же

в естественных условиях грам-отрица-

тельные бактерии почти всегда имеют О-бо-

ковые цепи. Полисахаридная наружная обо-

лочка придает поверхности бактериальных

клеток высокую степень гидрофильности,

что повышает их устойчивость к фагоцитозу

клетками хозяина. О-боковые цепи полиса-

харидов крайне разнообразны; показанная

на рис. 32.18 структура - это только одна из

многих известных. Грам-отрицательные

бактерии способны быстро мутировать, из-

меняя таким путем состав своих О-боковых

цепей. В результате популяция клеток хозя-

ина, встретившись с новой для себя поверх-

ностной структурой, не имеет на первых по-

рах достаточного количества антител про-

тив О-боковых цепей. Следовательно, ви-

доизменяя О-боковые цепи, микроорганизмы

на один шаг опережают систему иммуноло-

гической защиты организма-хозяина.

Источником генетической информации,

необходимой для изменения О-боковых це-

пей, может служить включение умеренного

фага в грам-отрицательные бактерии. На-

пример, фаг Р22 обеспечивает бактериаль-

ную клетку геном фермента, добавляющего

глюкозу к повторяющемуся тетрасахарид-

ному звену в О-боковых цепях (рис. 32.22).

Такое изменение называют фаговой конвер-

сией. Приведенный пример демонстрирует

удивительное взаимодействие между бакте-

риальными и вирусными генами и те пре-

имущества в эволюции, которые возникают

в результате такого симбиоза.

32.14. Порин образует в наружной мембране

каналы для небольших полярных молекул

В наружной мембране бактериальной клет-

ки содержится большое количество (~10

)

молекул порина - трансмембранного белка

массой 37 кДа. Тримеры порина форми-

руют каналы, по которым небольшие по-

лярные молекулы быстро диффундируют,

проходя сквозь мембрану (рис. 32.23). По-

скольку диаметр канала 10 А, он пропу-

скает молекулы массой, не превышающей

600 Да. Гидрофобные молекулы независимо

от своего размера плохо проходят по кана-

лу; из этого следует, что пориновый канал

наполнен водой и выстлан полярными груп-

пами. Следовательно, канал приспособлен

для пропускания небольших полярных ме-

таболитов типа моносахара. Что касается

полярных соединений с большей молеку-

лярной массой, то для некоторых из них су-

ществуют специфические системы транс-

порта через наружную мембрану; примером

может служить система транспорта маль-

тозы. Диффузия мальтозы (дисахарида)

и мальтотриозы по пориновому каналу идет

очень медленно; для их переноса через мем-

брану существует специальная система

транспорта. Известны также специфические

системы транспорта витамина В

и хелатов

железа. Некоторые фаги проникают в бакте-

риальные клетки путем связывания со спе-

цифическими переносчиками. Так, фаг λ ис-

пользует рецептор мальтозы.

Среди белков наружной мембраны коли-

чественно преобладает (~ 7•10

молекул на

32. Оболочки бактериальных

клеток

229

Рис. 32.23. А. Электронная микрофото-

графия Е. coli. Видно располо-

жение негативно окрашенных

пориновых каналов. Б. Изобра-

жение пориновых каналов, по-

лученное после обработки

и фильтрации (обесцвечивания

фона) микрофотографии, при-

веденной на рис. А. В. Разъ-

ясняющая схема: показана

проекция каналов порина

при низком разрешении. [Ste-

ven А, С., Heggeler В. Ten, Mu-

ller R., Kistler J., Rosenbusch J.

P., J. Cell Biol., 72, 292 (1977).]

клетку) небольшой липопротеин, содержа-

щий всего лишь 58 остатков аминокислот.

Этот белок характеризуется высокой сте-

пенью α-спирализованности; к его N-конце-

вому цистеину ковалентно присоединены

три жирные кислоты. Примерно 1/3 моле-

кул липопротеина через ε-аминогруппы

своего С-концевого лизина связана

с СООН-группами расположенного над

ним пептидогликана. Таким образом, рас-

сматриваемый липопротеин прикрепляет на-

ружную мембрану к подлежащему пептидо-

гликанному слою и тем самым способствует

механической устойчивости клеточной обо-

лочки.

32.15. Новообразованные белки

наружной мембраны содержат отщепляемую

сигнальную последовательность

Белки, синтезируемые грам-отрицательны-

ми бактериями, могут локализоваться в ци-

гозоле, плазматической мембране, пери-

230

Часть V.

Молекулярная физиология

плазматическом пространстве, наружной

мембране или внеклеточной среде. Каким

образом новосинтезированная молекула по-

падает в нужное место, выбирая из пяти воз-

можных направлений правильное? Для вы-

яснения этого вопроса очень важное значе-

ние имеет следующий факт: как оказалось,

липопротеин наружной мембраны синтези-

руется в виде пролипопротеина, содержаще-

го на N-конце 20 дополнительных остатков

Рис. 32.24. Последовательность амино-

кислот N-концевой части про-

липопротеина. Эта сигнальная

последовательность содержит

много гидрофобных остатков

(показаны желтым цветом).