Страйер Л. Биохимия. Том 3

Подождите немного. Документ загружается.

Рис. 30.37. Схематическое изображение

генома вируса саркомы птиц.

Две идентичные молекулы (+)

РНК связаны между собой не-

ковалентно. На 5'-концах нахо-

дятся «колпачки», а на 3'-кон-

цах - poly(А)-последовательно-

сти. Молекула тРНК, которая

служит затравкой, присоедине-

на посредством спаривания ос-

нований к каждой молекуле

РНК.

Рис. 30.38. Генетическая карта вируса сар-

комы птиц. Геном имеет длину

10 kb. Буквой Т обозначены

концевые повторяющиеся по-

следовательности.

фекция - альтернативные пути. Еще одно от-

личие заключается в том, что частота ин-

теграции ретровирусной ДНК очень высока,

как и следовало ожидать исходя из ее клю-

чевой роли в продуктивной инфекции.

Геном вируса саркомы птиц длиной 10 kb

содержит четыре гена (рис. 30.38). Три из

них - gag, pol и env - необходимы для продук-

тивной инфекции. Ген gag кодирует поли-

протеин массой 76 кДа, который расще-

пляется на четыре белка, образующих

сердцевину вируса. Ген pol кодирует обрат-

ную транскриптазу, состоящую из α- и β-

субъединиц. α-Субъединица массой 65 кДа

представляет собой фрагмент (массой

90 кДа) протеолиза β-цепи. Ген env кодирует

гликопротеин оболочки вируса, необхо-

димый для прикрепления вируса к поверх-

ности клетки-хозяина. Четвертый ген - src

(от англ. sarcomа - саркома) - не нужен для

размножения вируса, но необходим для

трансформации, как будет показано чуть

ниже.

Различные вирусные мРНК, видимо,

образуются в результате сплайсинга из пер-

вичного транскрипта длиной 10 kb. Затем

они транспортируются в цитозоль и здесь

транслируются. Геномная РНК и вирусные

белки перемещаются к плазматической

мембране и включаются в нее. Затем часть

измененной мембраны отпочковывается

и образует новые вирусные частицы. Таким

образом, продуктивная ретровирусная ин-

фекция в отличие от инфекции онкогенными

ДНК-содержащими вирусами не является

литической. Ретровирусы обычно не уби-

вают клеток-хозяев. Ретровирусная ДНК

остается в геноме зараженной клетки и про-

должает экспрессироваться. Кроме того, ин-

тегрированная вирусная ДНК реплицирует-

ся вместе с клеточной ДНК, поэтому

дочерние клетки наследуют вирусный геном.

30.21. Киназа, кодируемая геном src вируса

саркомы птиц, участвует в трансформации

Изучение некоторых температурочувстви-

тельных мутантов принесло новые данные

о механизме трансформации под действием

вируса саркомы птиц. При высокой темпе-

ратуре эти мутанты нормально размно-

жаются, но не трансформируют клеток-хо-

зяев, а при низкой температуре оба процесса

протекают нормально. Кроме того, фибро-

30. Вирусы

191

Рис. 30.39. Электронная микрофотогра-

фия частиц вируса миелобла-

стоза птиц. Введение этого опу-

холеродного РНК-содержа-

щего вируса новорожденным

цыплятам вызывает в течение

3 недель злокачественную лей-

кемию. (Печатается с любезно-

го разрешения д-ра Ursula

Heine, Национальный институт

раковых исследований.)

бласты, трансформированные этими мутан-

тами при низкой температуре, при повыше-

нии температуры возвращаются к нормаль-

ному фенотипу. Сдвиг от трансформирован-

ного состояния к нормальному оказывается

полностью обратимым. Анализ этих мутан-

тов показал, что в процессе трансформации

участвует только один вирусный белок -

продукт гена src. Ген src получил свое на-

звание потому, что способен направлять син-

тез какого-то белка, вызывающего саркому.

Важно подчеркнуть, что в таких мутантных

клетках при высокой температуре вирусная

ДНК остается интегрированной с кле-

точным геном. Следовательно, интеграция

сама по себе не приводит к трансформации.

192

Часть IV.

Информация

Для этого должен экспрессироваться ген

rsc.

Что же представляет собой продукт гена

src? Исследования, проведенные в последнее

время, показали, что этот белок массой

60 кДа - киназа, фосфорилирующая белки.

Проводится изучение мишени этой киназы,

что позволит выяснить механизм трансфор-

мации. Поразительно, что один небольшой

белок может полностью изменить характер

роста клетки и сделать ее раковой.

30.22. Двухцепочечная РНК подавляет

синтез белка в клетках, обработанных

интерфероном

Устойчивость животных клеток ко многим

вирусам заметно увеличивается под дей-

ствием интерферонов - группы небольших

белков, которые синтезируются и секрети-

руются клетками позвоночных, инфициро-

ванными вирусом. Двухцепочечные моле-

кулы РНК оказывают некоторое стимули-

рующее действие на образование интерфе-

рона. Интерфероны связываются с плазма-

тической мембраной других клеток организ-

ма и стимулируют их способность сопроти-

вляться вирусной инфекции. Клетки при-

обретают устойчивость к широкому спектру

вирусов. Иммунность, которую обеспечи-

вают антитела, наоборот, весьма специфич-

на. Интерфероны обладают очень высокой

активностью: всего 10

-1

М достаточно

для проявления выраженного противови-

русного действия.

Интерферон повышает противовирусную

устойчивость клеток путем увеличения син-

теза трех ферментов: олигонуклеотид-син-

тетазы, эндонуклеазы и киназы. До тех пор

пока сенсибилизированная клетка не зара-

жается вирусом или не подвергается воздей-

ствию двухцепочечной РНК, эти три фер-

мента бездействуют. Активация этих фер-

ментов блокирует синтез белков двумя

различными путями (рис. 30.40). Протеин-

киназа фосфорилирует один из факторов

инициации синтеза белка и тем самым инак-

тивирует его. Напомним, что тот же фактор

инициации служит мишенью регуляторного

каскада в ретикулоцитах (разд. 29.27). Дру-

гой важный результат воздействия двухспи-

ральной РНК на сенсибилизированные ин-

терфероном клетки - стимулирование дегра-

дации мРНК. Эндонуклеаза активируется

олигоаденилатом, который называется 2,5А.

Двухцепочечная РНК стимулирует синтета-

зу, образующую этот стимулятор эндону-

Рис. 30.40. Двухцепочечная РНК стимули-

рует расщепление мРНК (А)

и ингибирует инициацию син-

теза белка в клетках, обрабо-

танных интерфероном (Б).

[Farrell P.J., Sen G.C, Dubois

M. F., Ratner L., Slattery E.,

Lengyel P., Proc. Nat. Acad.Sci.

USA, 75, 5896 (1978).]

клеазы. Было бы крайне интересно выяс-

нить, играют ли эти регуляторные пути

какую-либо роль в незараженной клетке, по-

мимо того что они защищают ее от вирусов.

Заключение

Вирусы представляют собой плотно упако-

ванную инфекционную нуклеиновую кисло-

ту, окруженную защитной оболочкой. Они

содержат ДНК или РНК, которые могут

быть одно- или двухцепочечными. Простей-

шие вирусы имеют всего 3 гена, а наиболее

сложные - около 250 генов. Вирусные обо-

лочки в большинстве случаев состоят из

большого числа белковых субъединиц одно-

го или нескольких видов, так как вирусы со-

держат крайне ограниченное количество ге-

нетической информации. Два основных

способа укладки - цилиндрическая оболоч-

ка, обладающая спиральной симметрией,

и сферическая оболочка, обладающая ико-

саэдрической симметрией. Частица вируса

(вирион) табачной мозаики состоит из 2130

идентичных субъединиц, уложенных спи-

ралью вокруг одноцепочечной молекулы

РНК; она образуется в результате само-

сборки, которая осуществляется путем при-

соединения белковых дисков к петле РНК.

Вирус кустистой карликовости томатов

образует икосаэдрическую оболочку, так

как домены, из которых состоит его белок

оболочки, связаны друг с другом подвижно.

Сборка фага Т4 - гораздо более сложный

процесс, в котором участвует примерно 50

белков. Три основных пути сборки ведут

к независимому образованию головки, от-

ростка и нитей отростка. Формирование фа-

га Т4 идет в строго определенном порядке,

в нем участвуют процессы самосборки

и сборки с участием ферментов. Кроме того,

важную роль в сборке фага Т4 играют вспо-

могательные (морфопоэтические) белки.

Незараженные клетки не могут синтези-

ровать РНК по РНК-матрице. Следователь-

но, общее свойство РНК-содержащих виру-

30. Вирусы

193

сов (кроме РНК-содержащих опухоле-

родных вирусов) - это кодирование РНК-за-

висимой РНК-полимеразы. РНК, содержа-

щаяся в вирионах некоторых вирусов

(например, фага Qβ), служит при заражении

информационной РНК. У других вирусов

(например, у реовирусов) геномная РНК

должна сразу после заражения транскриби-

роваться. Транскрипция осуществляется

ферментом, который имеется в вирионе.

РНК-содержащие вирусы используют раз-

личные способы синтеза белка. Белки виру-

са полиомиелита образуются путем расщеп-

ления гигантского предшественника. Реови-

рус содержит отдельную «хромосому» для

каждого синтезируемого им белка, а вирус

везикулярного стоматита транскрибирует

несколько моноцистронных РНК с одной

геномной РНК.

Не все вирусы разрушают свои клетки-хо-

зяева. Умеренный фаг λ может принимать

форму дремлющего профага, когда его

ДНК интегрирована с бактериальной хро-

мосомой путем реципрокной рекомбина-

ции. Этот профаг сохраняет способность

к размножению и лизису, которую он про-

являет, когда происходит его исключение из

клеточной ДНК. Подобно этому, ДНК-со-

держащие опухолеродные вирусы SV-40

и полиомы либо размножаются и лизируют

свои клетки-хозяева, либо их ДНК интегри-

рует с ДНК клетки-хозяина. Ретровирусы

могут размножаться только путем интегра-

ции с клеточной ДНК. Эти вирусы содержат

обратную транскриптазу, катализирующую

синтез двухспиральной ДНК с использова-

нием в качестве матрицы геномной РНК.

Продуктивная инфекция ретровирусами

в отличие от онкогенных ДНК-содержащих

вирусов не является литической. Клетки,

в геноме которых содержится ДНК вируса

SV-40, полиомы или ретровируса, имеют

аномальные поверхности и характеризуют-

ся нарушениями роста. При введении чув-

ствительным животным они образуют опу-

холи. Эти вирусы - удобная модель для

изучения молекулярных основ рака, так как

они имеют всего около пяти генов. Удалось

показать, что трансформацию вызывает

киназа, которую кодирует ген src вируса

саркомы птиц.

Устойчивость клеток животных ко мно-

гим - вирусам заметно увеличивается под

действием интерферона - белка, который

синтезируют и выделяют клетки, зара-

женные вирусом. Интерферон увеличивает

образование трех ферментов, блокирующих

синтез белка путем ингибирования фактора

инициации и стимулирования деградации

мРНК.

Биологические исследования представляют собой, в частности, упражнения по

эстетике природы. Занимаясь биологией, мы получаем удовольствие главным

образом оттого, что снова и снова осознаем, насколько экономичны, изящны

и целесообразны те механизмы, которые случайно возникли в ходе эволюции

и были закреплены отбором. Вирусолог может чувствовать себя одним из

самых счастливых биологов, так как он может изучить избранный им объект до

подробностей строения его отдельных молекул. Вирусолог наблюдает, как ви-

рус - этот полнейший паразит - использует для своего существования наиболее

общие принципы биологии клетки...

David Baltimore, Нобелевская лекция, 1976 г.

РЕКОМЕНДУЕМАЯ

ЛИТЕРАТУРА

С чего начать

Butler P.J.G., King A., 1978. The

assembly of a virus, Sci. Amer., 239(5),

62-69. (Сборка вируса табачной мо-

заики.)

Bishop J.M., 1980. The molecular

biology of RNA tumor viruses:

a physician's guide, New Engl. J. Med.,

303, 675-682.

Campbell A.M., 1976. How viruses

insert their DNA into the DNA of the

host cell, Sci. Amer, 235(6), 102-113.

Temin H.M., 1972. RNA-directed DNA

synthesis, Sci. Amer., 226(1), 24-33.

Nathans D., 1979. Restriction endo-

nucleases, simian virus 40, and the new

genetics, Science, 206, 903-909.

Книги

Luria S.E., Darnell J.E., Jr.

Baltimore D., Campbell A., 1978.

General Virology (3rd ed.), Wiley.

[Имеется перевод: Лурия С, Дар-

нелл Дж., Балтимор Д., Кэмпбелл Э.

Общая вирусология.- М.: Мир, 1981.]

(Доступное и увлекательное введение

в вирусологию.)

Тooze J. (ed.), 1980, The Molecular

Biology of Tumour Viruses (2nd ed.),

Cold Spring Harbor Laboratory.

Williams R.С., Fisher H.W., 1974. An

194

Часть IV.

Информация

Electron Micrographic Atlas of Airuses,

Thomas. (Сожержит превосходные

электронные микрофотографии

и очень увлекательные объяснения

ним.)

Строение вирусов

Bloomer А.С., Champness J.N.,

Bricogne G., Staden R., Klug A., 1978.

Protein disk of tobacco mosaic virus at

2,8 A resolution showing the

interactions within and between

subunits, Nature, 276, 362-368.

Stubbs G., Warren S., Holmes K., 1977.

Structure of RNA and RNA binding site

in tobacco mosaic virus from 4-A map

calculated from X-ray fibre diagrams,

Nature, 267, 216-221.

Harrison S.C., Olson A.J., Schutt C.E.,

Winkler F.K., Bricogne G., 1978.

Tomato bushy stunt virus at 2,9 A

resolution, Nature, 276, 368-373.

Harrison S.C., 1978. Structure of simple

viruses: specificity and flexibility in

protein assemblies, Trends Biochem.

Sci., 3-6.

Crick

F.H.C,

Watson J.D., 1957.

Virus

structure: general principles. In:

Wolstenholme G. E. W. (ed.), Ciba Fou-

ndation Symposium on the Nature of

Viruses, pp. 5-13.

Caspar D.L.D., Klug A., 1962. Physical

principles in the construction of regular

viruses, Cold Spring Harbor Symp.

Quant Biol., 27, 1-24. (В этой класси-

ческой статье рассматривается тео-

рия строения сферических вирусов.)

Сборка вирусов

Lebeurier G., Nicolaieff A., Ric-

hards К.E., 1977. Inside-out model for

self-assembly of tobacco mosaic virus,

Proc. Nat. Acad. Sci., 74, 149-153.

Butler P.J.G., Finch J. Т., Zimmern D.,

1977. Configuration of tobacco mosaic

virus RNA during virus assembly,

Nature, 265, 217-219.

Wood W.В., 1978. Bacteriophage T4

assembly and the morphogenesis of

subcellular structures, Harvey Lectures,

73, 203-223.

Casjens S., King J., 1975. Virus

assembly, Ann. Rev. Biochem., 44,

555-611.

Рестрикция и модификация

Smith D.H., 1979. Nucleotide sequence

specificity of restriction endonucleases,

Science, 205, 455-462.

Arber W., 1979. Promotion and

limitation of genetic exchange, Science,

205, 361-365.

Интерферон

Friedman R.М., 1977. Antiviral activity

of interferon, Bacteriol. Rev., 41.

543-567.

Farrell P.J., Sen G.C., Dubois M.F.,

Ratner L., Slattery E., Lengyel P., 1978.

Interferon action: two distinct pathways

for inhibition of protein synthesis by

double-stranded RNA, Proc. Nat. Acad.

Sci., 75, 5893-5897.

Burke D.C., 1977. The status of

interferon, Sci. Amer., 236(4), 42-50.

Внеклеточная эволюция РНК фага Qβ

Mills D.R., Peterson R.L., Spiegel-

man S., 1967. An extracellular

Darwinian experiment with

a selfduplicating nucleic acid molecule,

Proc. Nat. Acad. Sci., 58, 217-224.

Лизогення

Lwoff A., 1966. The prophage and I. In:

Cairns J., Stent G. S. and Watson J. D.

(eds.), Phage and the Origins of

Molecular Biology, pp. 88-99, Cold

Spring Harbor Laboratory. (Захваты-

вающий рассказ об открытии основ

лизогении.)

Опухолеродные вирусы

Baltimore D., 1976. Viruses,

polymerases, and cancer, Science, 192,

632-636.

Timin H., 1976. The DNA provirus

hypothesis: the establishment and

implications of RNA-directed DNA

synthesis, Science, 192, 1075-1080.

Dulbecco R., 1976. From the molecular

biology of oncogenic DNA viruses to

cancer, Science, 192, 437-440.

Bishop J.M., 1978. Retroviruses, Ann.

Rev. Biochem., 47, 35-88.

Reddy V.В., Thimmappaya В., Dhar R.,

Subramanian K.N., Zain B.S., Plan J.,

Ghosh P.K., Celma M.L., Weiss-

man S. M., 1978. The genome of simian

virus 40, Science, 200, 494-502.

ГЛАВА 31

Перестройки генов:

рекомбинация,

транспозиция и

клонирование

Тема настоящей главы - перестройка генов

путем перемещения крупных участков ДНК.

Прежде всего мы обсудим процесс генетиче-

ской рекомбинации, при котором новая мо-

лекула ДНК возникает путем разрыва и вос-

соединения цепей ДНК. Вероятность гене-

тической рекомбинации существенно увели-

чивается при наличии обширных участков

гомологии между взаимодействующими

молекулами ДНК. Были выделены проме-

жуточные продукты рекомбинации, а срав-

нительно недавно был охарактеризован

и фермент, катализирующий взаимный об-

мен цепей ДНК. Затем мы обсудим транс-

позицию - перемещение гена из одной хро-

мосомы в другую или с одного места на

другое в пределах одной хромосомы. В от-

личие от общей рекомбинации для транспо-

зиции не нужны протяженные участки гомо-

логии. У прокариот присутствие так назы-

ваемых последовательностей-вставок, или

IS-элементов (от англ. insertion sequences),

сообщает подвижность неродственным

фрагментам ДНК, обеспечивая их соедине-

ние. Рекомбинация и транспозиция сыграли

важную роль в эволюции, так как они приво-

дили к возникновению новых геномов. В кон-

це настоящей главы мы рассмотрим кон-

струирование новых комбинаций генов

в пробирке и их выражение в клетках-хозяе-

вах. Гены можно ковалентно соединить

с ДНК плазмид и вирусов с помощью ре-

стриктирующих эндонуклеаз и ДНК-ли-

газы. Такие рекомбинатные молекулы ДНК

196

Часть IV.

Информация

могут реплицироваться и экспрессироваться

в подходящих клетках-хозяевах. Кроме то-

го, мы обсудим важность клонирования ге-

нов и возможность его практического при-

менения. Исследования рекомбинации

и транспозиции и разработка методов кло-

нирования идут исключительно быстрым

темпом. В результате этих работ возникают

новые плодотворные методы изучения гено-

мов, которые позволяют глубже проник-

нуть в механизмы их эволюции и выраже-

ния.

31.1 В основе генетической рекомбинации

лежат разрыв и воссоединение цепей ДНК

При генетической рекомбинации возникает

молекула ДНК, последовательность кото-

рой происходит частично от одной роди-

тельской молекулы, а частично от другой.

Исследования клеток Е. coli, зараженных

смесью фагов Т4, меченных

Р и бром-

дезоксиурацилом, позволили получить

представление о молекулярной природе ре-

комбинантных молекул. Плавучая плот-

ность ДНК, меченной бромурацилом, зна-

чительно выше, чем плотность ДНК, мечен-

ной

Р, так что родительские молекулы

можно отделить друг от друга и от реком-

бинантных молекул центрифугированием в

градиенте плотности хлористого цезия

(CsCl). Результаты опытов по центрифуги-

рованию показали, что после заражения

смесью фагов рекомбинантные молекулы

содержат и

Р, и бромурацил. Структура

гибридных молекул зависела от того, про-

исходил ли во время их образования синтез

ДНК. В отсутствие синтеза ДНК

Р-ДНК

в составе рекомбинантных молекул не была

ковалентно соединена с меченной бромура-

цилом ДНК. При нагревании выше темпе-

ратуры плавления двухспиральных молекул

гибрид диссоциировал на легкий и тяжелый

компоненты. Фрагменты родительских мо-

лекул в этом гибриде удерживаются вместе

в результате спаривания оснований; поэто-

му этот промежуточный продукт называет-

ся составным (рис. 31.3). Если же синтез

Рис. 31.1. Перенос генетической инфор-

мации от одной клетки Е. coli

к другой. На этой электронной

микрофотографии видны две

клетки Е. coli, соединенные при

помощи пиля во время конью-

гации. ДНК переносится через

пиль из донорной клетки в ак-

цепторную. (Печатается с лю-

безного разрешения д-ра

Charles Brinton и д-ра Judith

Carnahan.)

31. Перестройки генов

197

Рис. 31.2. Электронная микрофотогра-

фия кольцевой молекулы ДНК,

содержащей гены устойчиво-

сти к нескольким антибиоти-

кам. Такие плазмиды (факторы

R - от англ. resistance - устойчи-

вость) сообщают клеткам

устойчивость к различным ве-

ществам, которая может пере-

даваться другим клеткам. (Пе-

чатается с любезного разреше-

ния д-ра Stanley Cohen.)

Рис. 31.3. Составной промежуточный

продукт рекомбинации ДНК

фага Т4 в зараженных бакте-

риях. Меченная

Р ДНК пока-

зана красным цветом, а ДНК,

меченная бромурацилом,- си-

ним.

198

Часть IV.

Информация

ДНК происходил, одноценочечные пробелы

в составном промежуточном продукте за-

полнялись ДНК-полимеразой I и концы со-

единялись ДНК-лигазой. Образовавшуюся

рекомбинатную молекулу уже нельзя было

разделить на легкий и тяжелый компо-

ненты, так как куски ДНК были ковалентно

соединены. Эти эксперименты показали,

что одноцепочечные участки ДНК являют-

ся промежуточными продуктами генетиче-

ской рекомбинации и что в этом процессе

участвуют ферменты.

31.2. При генетической рекомбинации

происходит спаривание гомологичных

цепей ДНК с образованием двухцепо-

чечного промежуточного продукта

Изображение промежуточных продуктов ге-

нетической рекомбинации было получено

методом электронной микроскопии. В этих

исследованиях была использована ДНК

плазмид Е. coli. Как мы вскоре увидим (разд.

Рис. 31.4. Электронная микрофотогра-

фия молекул ДНК в процессе

рекомбинации: А - промежу-

точный продукт в форме вось-

мерки, состоящий из двух мо-

лекул ДНК; Б - при расщепле-

нии этого промежуточного

продукта рестриктирующей

эндонуклеазой образуется х-

форма. [Potter H., Dressier D.,

Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 76,

1089 (1976).]

Рис. 31.5. Предполагаемая схема расще-

пления двух молекул ДНК, со-

единенных в негомологичных

(А) и в гомологичных (Б) участ-

ках. Наблюдаемая симметрия

χ-форм (как на рис. 31.4, Б) по-

казывает, что молекулы ДНК

в форме восьмерок соединены

в гомологичных участках.

31.4), эти небольшие кольцевые двухцепо-

чечные ДНК автономно реплицируются

в бактериальной клетке. В присутствии

хлорамфеникола число плазмид в одной

бактерии увеличивается примерно с 20 до

1000. Этот антибиотик - ингибитор синтеза

белка - подавляет репликацию бактериаль-

ной хромосомы, но не ингибирует реплика-

ции плазмид. Итак, бактериальная клетка

оказывается наполненной молекулами плаз-

мид, способными к рекомбинации. Элек-

тронная микроскопия плазмид, выделенных

из этих клеток, показывает, что примерно

четверть из них представляют собой ди-

меры в форме восьмерок (рис. 31.4, А). За-

тем эти димеры расщепили рестриктирую-

щей эндонуклеазой EcoRI. разрезающей

мономер плазмиды в строго определенном

месте. Если бы димеры были взаимозаце-

пленными друг с другом мономерами или

кольцами двухкратной длины, то под дей-

ствием рестриктирующей эндонуклеазы

образовались бы палочки одинаковой

длины. С другой стороны, если два плаз-

мидных кольца ковалентно соединены

в области участка гомологии, должна быть

видна структура с четырьмя ветвями в фор-

ме греческой буквы χ. В действительности

почти все восьмерки превращаются в χ-

форму (рис. 31.4, Б). Это служит надежным

подтверждением, что восьмерки представля-

ют собой промежуточные продукты репли-

кации. В пользу этого вывода говорит и то,

что у некоторых мутантов Е. coli, дефект-

ных по рекомбинации, восьмерки не обра-

зуются.

Какова структура области перекрестка

двух геномов в восьмерках? Точка контакта

(пересечения) χ-форм всегда делит всю

структуру на две пары плеч равной длины.

Это означает, что геномы соединяются

в области гомологии (рис. 31.5). Если бы

плазмиды соединялись в области негомоло-

гичных последовательностей, то длины всех

четырех плеч распределялись бы случайным

образом. Кроме того, точка контакта распо-

лагается примерно с равной вероятностью

вдоль всей плазмиды; отсюда следует, что

спаривание может происходить во многих

положениях. Способ соединения нитей

в области перекреста был исследован с по-

мощью его избирательной денатурации. На

электронных микрофотографиях видно, что

четыре двухцепочечные молекулы в местах

соединения двух геномов отходят от кольца,

31. Перестройки генов

199

Рис. 31.6. А - электронная микрофото-

графия χ-формы; Б - схема мо-

лекулы, изображенной на фо-

тографии. Участок гомологии

(богатый АТ-парами основа-

ний) был избирательно денату-

рирован формамидом, чтобы

было видно соединение цепей

в области перекреста. [Pot-

ter Н., Dressier D., Cold Spring

Harbor Symp. Quant. Biol., 43,

973 (1979).]

состоящего из одиночных нитей (рис. 31.6).

Затем этот промежуточный продукт может

быть расщеплен и лигирован, так что обра-

зуются две пары различных рекомби-

нантных молекул (рис. 31.7).

31.3. Белок геcА катализирует

АТР-зависимый обмен цепей ДНК

при генетической рекомбинации

Процесс, который мы обсуждали до сих пор,

называется общей генетической рекомбина-

цией, поскольку обмены могут происходить

между любыми парами гомологичных по-

следовательностей в родительских молеку-

лах ДНК. У Е. coli общая рекомбинация за-

висит от генов rec. В клетках rec

бакте-

риальная ДНК не может рекомбинировать

с экзогенными молекулами ДНК. Были

идентифицированы три гена rec: recА, recВ

и recС. Белки recВ (масса 140 кДа) и recС

(128 кДа) - две субъединицы одной ну-

клеазы, которая расплетает двухспираль-

ную ДНК и расщепляет на куски сначала

одну из расплетенных цепей, а затем дру-

200

Часть IV.

Информация

гую. Эти куски, содержащие несколько со-

тен нуклеотидов, подвергаются дальнейше-

му расщеплению ферментом recВС, обла-

дающим активностью экзонуклеазы. Рас-

плетающая и нуклеазная активности этого

ферментного комплекса зависят от гидро-

лиза АТР. Скорее всего роль белка recВС

в рекомбинации сводится к образованию

одноцепочечной ДНК, способной внедриться

в двухцепочечную молекулу ДНК.

Как одноцепочечная ДНК находит гомо-

логичную последовательность в двухцепо-

чечной молекуле, спаривается с компле-

ментарной цепью и вытесняет вторую цепь?

Недавно было показано, что эту реакцию ка-

тализирует белок recА с массой 40 кДа, ко-

торый гидролизует АТР и использует выде-

ляющуюся энергию. Продукт этой реакции

состоит из двухцепочечного участка и вы-

тесненной одноцепочечной петли и имеет

форму буквы D; он называется D-петлей

(рис. 31.8). Образованию D-петли способ-

ствует белок, который специфически связы-

вается с одноцепочечной ДНК. Этот белок

играет также важную роль в репликации

ДНК (разд. 24.21); он стабилизирует одноце-

почечную ДНК, образовавшуюся под дей-

ствием нуклеазы recВС, и стимулирует вне-

дрение этой цепи в гомологичную двухспи-

ральную молекулу, катализируемую белком

rесА.

31.4. Бактерии содержат плазмиды и другие

подвижные генетические элементы

Общая генетическая рекомбинация приво-

дит к возникновению новых комбинаций

специфических аллелей, но не изменяет рас-

положения локусов. Другими словами, при

гомологичной рекомбинации ABCDE

с A'B'C'D'E' легко получится ABC'D'E', но не

может получиться ABXYZCDE или ABE.

Такие крупные генетические перестройки