Страйер Л. Биохимия. Том 3

Подождите немного. Документ загружается.

Рис. 32.25. У прокариот синтез белков

клеточной оболочки происхо-

дит на рибосомах, прикре-

пленных к плазматической

мембране. Сигнальная после-

довательность (показана

красным цветом) новообразо-

ванного полипептида напра-

вляет рибосомы к плазматиче-

ской мембране, а также обеспе-

чивает перенос белка через нее.

аминокислот (рис. 32.24). Аналогичным

образом и другие белки, предназначенные

для плазматической мембраны или еще бо-

лее наружно расположенных участков, несут

сигнальные последовательности, отличаю-

щие их от тех белков, которые остаются

в цитозоле. Рибосомы, синтезирующие бел-

ки, предназначенные для выхода из цитозо-

ля, соединяются с плазматической мембра-

ной посредством именно этих крайне гидро-

фобных N-концевых последовательностей.

Таким образом, начальные этапы процесса

секреции у прокариот и эукариот очень

сходны (разд. 29.30). Однако есть и разли-

чие: у прокариот рибосомы, синтезирующие

белки клеточной оболочки, прикрепляются

к плазматической мембране (рис. 32.25),

тогда как у эукариот рибосомы с аналогич-

ной функцией связываются с эндоплазмати-

ческим ретикулумом (разд. 29.29). Как и

у эукариот, пептидазы прокариот отще-

пляют сигнальные последовательности но-

восинтезированных белков, как только эти

белки минуют барьер мембраны.

Гипотеза сигнальных последовательно-

стей подтверждается данными, полученны-

ми при изучении бактериальных мутантов;

проиллюстрируем это на примере белка,

связывающего мальтозу: его масса 38 кДа,

он участвует в поглощении мальтозы клет-

кой. Обычно этот белок локализован в пери-

плазматическом пространстве. Однако при

мутации, затрагивающей N-конец его пред-

шественника, локализация белка (в его зре-

лой форме) меняется: замещение гидрофоб-

ной аминокислоты в сигнальной последова-

тельности на заряженный остаток приводит

к накоплению связывающего мальтозу бел-

ка в цитозоле. Таким образом, следствием

замены всего лишь одного аминокислотного

остатка оказалось изменение локализации

белка: вместо периплазматического про-

странства - цитозоль. Рассмотрим обрат-

ную ситуацию: может ли белок цитозоля

ошибочно попасть в наружную мембрану?

Часть гена, ответственного за синтез N-кон-

цевой части белка-переносчика мальтозы

(белок наружной мембраны, являющийся

также рецептором фага λ), соединили с ге-

ном β-галактозидазы. Кодируемый полу-

ченным геном белок-химера накапливался

не в цитозоле, как это свойственно β-галак-

тозидазе, а в наружной мембране. Этот

опыт показывает, что N-концевая последова-

тельность новосинтезированной полипеп-

тидной цепи - это своего рода форма записи

адреса белков клеточной оболочки. Совер-

шенно очевидно, что клетки прокариот, как

и эукариот, способны транспортировать

белки в соответствующие участки. Молеку-

лярные основы этого процесса сортировки

белков - важная область современных ис-

следований.

Заключение

Бактериальные клетки окружены клеточны-

ми стенками, которые защищают их от ос-

32. Оболочки бактериальных

клеток

231

мотического лизиса. Клеточная стенка

грам-положительных бактерий имеет обыч-

но толщину 250 А и состоит из пептидогли-

кана и тейхоевой кислоты; клеточная по-

верхность грам-отрицательных бактерий

имеет более сложное строение. Клеточная

стенка - это одна огромная макромолекула,

имеющая форму мешка. Пептидогликан из

S. aureus содержит 3 повторяющихся звена;

NAG-NAM, тетрапептид из D- и L-остатков

и пентаглициновую цепь. Пентаглициновые

звенья поперечно связывают отдельные по-

лисахаридные цепи. В биосинтезе пептидо-

гликанов используются активированные са-

хара в форме UDP-NAG и UDP-NAM.

Биосинтез протекает в пять этапов: 1) на

остатке NAM, присоединенном к UDP, на-

ращивается пептидное звено; 2) NAM-пеп-

тид переносится на липидный переносчик;

3) к NAM-пептидной единице присоеди-

няются NAG и пентаглициновый мостик;

4) NAG-NAM-пептидное звено переносится

от липидного переносчика на растущую по-

лисахаридную цепь; 5) аминогруппа пента-

глицинового мостика на одной полисаха-

ридной цепи атакует концевую D-Ala-D-Ala-

пептидную связь в тетрапептиде, принадле-

жащем другой цепи, и таким образом

образуется поперечная сшивка между поли-

сахаридными цепями.

Пенициллин убивает бактерии, подавляя

синтез клеточных стенок. Пенициллин по-

хож по структуре на ацил-D-Ala-D-Ala и со-

держит высокореакционноспособную пеп-

тидную связь. Он необратимо ингибирует

гликопептид-транспептидазу и тем самым

блокирует образование поперечных сшивок

в пептидогликане. Некоторые бактерии ре-

зистентны к действию пенициллина благо-

даря наличию пенициллиназы, гидролизую-

щей и тем самым инактивирующей пени-

циллин.

Грам-отрицательные бактерии в отличие

от грам-положительных имеют наружную

мембрану, расположенную над слоем пеп-

тидогликана. Кроме того, между плазмати-

ческой мембраной грам-отрицательных

бактериальных клеток и слоем пептидогли-

кана имеется периплазматическое простран-

ство. Наружная мембрана состоит из крайне

своеобразных липополисахаридов. Эти ам-

фипатические соединения содержат заяко-

ренный в наружном слое наружной мем-

браны липид А, а также еще более наружно

расположенные олигосахарид и О-боковые

цепи.

О-боковые цепи, в состав которых входят

необычные сахара, образуются путем поли-

меризации тетрасахаридных звеньев на ли-

пидном переносчике. Разнообразие струк-

туры О-боковых цепей позволяет грам-

отрицательным бактериям обойти иммуно-

логическую защиту организма-хозяина. По

содержащим воду каналам в наружной мем-

бране происходит диффузия небольших по-

лярных (но не гидрофобных) молекул; эти

каналы образованы трансмембранно распо-

ложенным белком порином. Молекулы

большей величины, например мальтоза или

витамин В

, проходят сквозь мембрану

благодаря наличию специфических систем

их транспорта. К числу основных белковых

компонентов наружной мембраны относит-

ся небольшой липопротеин, посредством

которого мембрана прикрепляется к подле-

жащему слою пептидогликана. Белки кле-

точной оболочки синтезируются на рибосо-

мах, присоединенных к плазматической

мембране. Предшественники этих белков

содержат N-концевые сигнальные последо-

вательности, которые отщепляются после

переноса белка-предшественника через мем-

брану.

РЕКОМЕНДУЕМАЯ

ЛИТЕРАТУРА

С чего начать

Nikaido H., Nakae Т., 1979. The outer

membrane of gram-negative bacteria,

Advan. Microbiol. Physiol., 14, 163-250.

DiRienzo J.M., Nakamura K., Inouye

M., 1978. The outer membrane proteins

of gram-negative bacteria: biosynthesis,

assembly, and functions, Ann. Rev.

Biochem., 47, 481-532.

Sharon N., 1969. The bacterial cell wall,

Sci. Amer., 220(5), 92-98.

Оболочки бактериальных клеток

Leive L. (ed.), 1973. Bacterial

Membranes and Walls, Marcel Dekker.

[Прекрасный сборник критических

обзоров. Статьи Гюйсена и Шокмана

(Ghuysen, Shockman) по биосинтезу

пептидогликана и Накайдо (Nikaido)

по биосинтезу клеточных оболочек

грам-отрицательных микроорганиз-

мов имеют непосредственное отно-

шение к теме данной главы.]

Nikaido H., 1979. Permeability of the

outer membrane of bacteria, Angew.

Chem. (Int.Ed.), 18, 337-350.

Hussey H., Baddiley J., 1976.

Biosynthesis of bacterial cell walls. In:

Martonosi A. (ed), The Enzymes of

Biological Membranes, vol. 2, pp.

227-326, Plenum.

Osborn M.J., 1971. The role of

membranes in the synthesis of

macromolecules. In: Rothfield L.L.

(ed.), Structure and Function of

232

Часть V.

Молекулярная физиология

Biological Membranes, pp. 343-400,

Academic Press.

Steven A.C., ten Heggeler B., Muller R.,

Kistler J., Rosenbusch J.P., 1977.

Ultrastructure of a periodic protein layer

in the outer membrane of Escherichia

coli, J. Cell Biol., 72, 292-301.

Пенициллин и бацитрацин

Fleming A., 1929. On the antibacterial

action of cultures of a penicillinium, with

special reference to their use in the

isolation of B. influenzae, Brit. J. Exp.

Pathol., 10, 226-236.

Chain E., 1971. Thirty years of penicillin

therapy, Proc. Roy. Soc. London (B),

179, 293-319.

Strominger J.L., Blumberg P.M.,

Suginaka H., Umbreit J., Wickus G.G.,

1971. How penicillin kills bacteria:

progress and problems, Proc. Roy. Soc.

London (B), 179, 369-383.

Yocum R.R., Waxman D.J., Rasmussen

J.R., Strominger J.L., 1979.

Mechanisms of penicillin action:

penicillin and substrate bind covalently

to the same active serine in two bacterial

D-alanine carboxypeptidases, Proc. Nat.

Acad. Sci., 76, 2730-2734.

Stone K.J., Strominger J.L., 1971.

Mechanism of action of bacitracin:

complexation with metal ion and

-isoprenyl pyrophosphate, Proc.

Nat. Acad. Sci., 68, 3223-3227.

Boyd D.B.. 1977. Transition state struc-

tures of a dipeptide related to the mode

of action of b-lactam antibiotics, Proc.

Nat. Acad. Sci., 74, 5239-5243.

Сигнальные последовательности и ло-

кализация белков

Chang C.N., Model P., Blobel G., 1979.

Membrane biogenesis: cotranslational

integration of the bacteriophage f1 coat

protein into an Escherichia coli

membrane fraction, Proc. Nat. Acad.

Sci., 75, 4891-4895.

Inouye S., Wang S., Sekizawa J., Halej-

oua S., Inouye M., 1977. Amino acid

sequence for the peptide extension on the

prolipoprotein of the Escherichia coli

outer membrane, Proc. Nat. Acad. Sci.,

74, 1004-1008.

Bedouelle H., Bassford P.J., Fowler A.

V., Zabin I., Beckwith J., Hofnung M.,

1980. Mutations which alter the function

of the signal sequence of the maltose

binding protein of Escherichia coli,

Nature, 285, 78-81.

Emr S., Hedgpeth J., Clement J.-M.,

Silhavy T.J., Hofnung M., 1980.

Sequence analysis of mutations that

prevent export of λ receptor, an

Escherichia coli outer membrane

protein, Nature, 285, 82-91.

Bassford P., Beckwith J., 1979.

Escherichia coli mutants accumulating

the precursor of a secreted protein in the

cytoplasm, Nature, 277, 538-541.

Emr S.D., Schwartz M., Silhary T.J.,

1978. Mutations altering the cellular

localization of the phage λ receptor, an

Escherichia coli outer membrane

protein, Proc. Nat. Acad. Sci., 75,

5802-5806.

Lin J.J.C., Kanazawa H., Ozols J.,

Wu H.C., 1978. An Escherichia coli

mutant with an amino acid alteration

within the signal sequence of outer

membrane prolipoprotein, Proc. Nat.

Acad. Sci., 75, 4891-4895.

ГЛАВА 33

Иммуноглобулины

К началу этого столетия были выявлены

многие важнейшие свойства иммунного от-

вета. Однако представление о защитных ме-

ханизмах возникло гораздо раньше, о чем

свидетельствуют записи Фукидида о чуме,

поразившей Афины в 430 до н.э.:

«Пусть другие рассуждают о ее проис-

хождении и причинах, вызвавших ее по-

явление, если только для такого страшно-

го бедствия могут быть найдены доста-

точные причины... что до меня, я просто

опишу ее природу и объясню, по каким

симптомам ее можно распознать, если

она когда-нибудь разразится снова. Тем

лучше я смогу это сделать, что болел сам

и видел, как развивалась болезнь у дру-

гих...

Именно у тех, кто выздоровел после

этой болезни, больные и умирающие вы-

зывали особенное сочувствие. Пережив-

шие болезнь знали по своему опыту, что

это такое, и не боялись более за себя, ибо

один и тот же человек никогда не заболе-

вал вторично или по крайней мере не уми-

рал при этом. И таких людей не только

поздравляли другие, но и сами они в радо-

сти преисполнялись тщетной надеждой,

что отныне они спасены от какой-бы то

ни было болезни».

Называя надежду на спасение тщетной,

Фукидид явно имел в виду специфичность

защиты, свойственную иммунной системе.

33.1. Основные определения

Антитела (или иммуноглобулины) - это бел-

ки, синтезируемые в организме животного

в ответ на присутствие чужеродного веще-

ства. Антитело обладает специфическим

234

Часть V.

Молекулярная физиология

сродством к стимулировавшему его синтез

чужеродному веществу. Антиген (или имму-

ноген) - чужеродная макромолекула, спо-

собная вызвать образование антител. Эф-

фективными антигенами обычно служат

белки, полисахариды и нуклеиновые кис-

лоты. Антитела проявляют специфичность

в отношении определенного участка моле-

кулы антигена; этот участок называют ан-

тигенной детерминантой.

Чужеродные молекулы малого размера

не вызывают образования антител. Однако

если они присоединены к макромолекулам,

то может иметь место синтез специфических

антител. В этом случае макромолекула вы-

полняет функцию носителя присоединенной

химической группы, называемой гаптенной

детерминантой. Сама по себе чужеродная

молекула малого размера называется гап-

теном.

Рис. 33.1. Электронная микрофотогра-

фия кристалла молекул антите-

ла. [Labaw L. W., Davies D. R.,

J. Ultrastruct. Res., 40, 349

(1972).]

Рис. 33.2. Электронная микрофотогра-

фия В-лимфоцита. (Печатается

с любезного разрешения

L. Mercer.)

Молекулы антител секретируются плаз-

матическими клетками, образовавшимися

из В-лимфоцитов (рис. 33.2). Другой класс

лимфоцитов, а именно Т-лимфоциты, обус-

ловливает клеточный иммунный ответ, ко-

торый дополняет гуморальный ответ, выра-

жающийся в появлении растворимых анти-

тел. В этой главе мы рассмотрим только

гуморальный ответ, поскольку его молеку-

лярные основы изучены значительно лучше.

Однако нужно подчеркнуть, что молекулы

антител - всего лишь один из компонентов

большой, согласованно функционирующей

системы молекул и клеток, распознающих

и удаляющих чужеродные вещества.

33.2. Синтез специфических антител

в ответ на антиген

Животные способны синтезировать специ-

фические антитела против практически лю-

бой химической группы. Особенно эффек-

тивно стимулирует образование антител

динитрофенол (ДНФ), и потому его широко

используют в качестве гаптенной детер-

минанты. Антитела против ДНФ получают

следующим образом.

1. ДНФ-группы присоединяют ковалент-

но к белку-носителю, например к альбумину

сыворотки быка (БСА), используя взаимо-

действие фтординитробензола с боковыми

цепями лизина или других нуклеофильных

остатков белка (рис. 33.4).

2. ДНФ-БСА вводят кролику в качестве

иммуногена (антигена). Спустя несколько

Рис. 33.3. Электронная микрофотогра-

фия плазматической клетки.

Виден очень хорошо развитый

шероховатый эндоплазматиче-

ский ретикулум. (Печатается

с любезного разрешения

L. Mercer.)

Рис. 33.4. Динитрофенильное производ-

ное бычьего сывороточного

альбумина (ДНФ-БСА) - эф-

фективного антигена.

33. Иммуноглобулины

235

Рис. 33.5. Кинетика появления иммуно-

глобулинов М и G (IgM и IgG)

в сыворотке после иммуниза-

ции.

дней содержание антител против ДНФ-аль-

бумина начинает возрастать (рис. 33.5). Эти

первыми появляющиеся антитела принадле-

жат к классу иммуноглобулинов М (IgM)

массой около 1000 кДа.

3. Спустя примерно 10 дней после введе-

ния антигена количество иммуноглобулина

М начинает уменьшаться, но одновременно

растет содержание антител другого класса,

а именно иммуноглобулинов G (IgG) массой

около 150 кДа.

4. Спустя примерно 3 недели после введе-

ния антигена содержание анти-ДНФ-анти-

тел класса иммуноглобулинов G достигает

плато. Введение в этот период новой порции

ДНФ-БСА вызывает дальнейшее увеличе-

ние содержания антител против ДНФ в сы-

воротке кролика.

5. Собирают кровь иммунизированного

кролика и получают сыворотку (называе-

мую антисывороткой, поскольку она полу-

чена после иммунизации). Содержание анти-

тел против ДНФ в этой сыворотке может

достигать 1 мг антител в расчете на 1 мл

сыворотки. ДНФ исключительно эффекти-

вен как агент, стимулирующий образование

больших количеств специфических антител.

Почти все эти антитела принадлежат к клас-

су иммуноглобулинов G - основному классу

иммуноглобулинов сыворотки.

6. Следующий этап - отделение антител

против ДНФ от антител с другой специфич-

ностью и от прочих сывороточных белков.

Антитела против ДНФ отличаются от

остальных белков антисыворотки очень вы-

236

Часть V.

Молекулярная физиология

соким сродством к ДНФ. Следовательно, их

можно выделить методом аффинной хрома-

тографии. Для этого готовят колонку, со-

держащую динитрофенильные группы, ко-

валентно связанные с нерастворимым угле-

водным носителем. На колонку наносят

антисыворотку и затем промывают бу-

ферным раствором. Большая часть белков

антисыворотки проходит сквозь колонку,

поскольку их сродство как к ДНФ-группам,

так и к углеводному носителю ничтожно

мало или вовсе отсутствует. В то же время

антитела против ДНФ прочно связываются

на колонке. Далее эти антитела снимают

с колонки. Для этого на колонку наносят

ДНФ в высокой концентрации: доба-

вленный ДНФ связывается с антителами,

вытесняя их из связи с динитрофенильными

группами нерастворимого углеводного но-

сителя. Растворимый комплекс, состоящий

из ДНФ и антител против ДНФ, выходит

с колонки. Далее ДНФ удаляют путем диа-

лиза или ионно-обменной хроматографии,

и в результате остается препарат очи-

щенных антител.

33.3. Участки антител, связывающие

антиген, подобны активным центрам

ферментов

Участки связывания антигена в молекулах

антител во многих отношениях сходны с ак-

тивными центрами ферментов.

1. Константы связывания для гаптенов

были определены методами равновесного

диализа и спектроскопии. Например, при-

соединение окрашенного гаптена типа дини-

трофенильного производного тушит флуо-

ресценцию остатков триптофана в белке-ан-

тителе. Степень тушения служит мерой

насыщения участков связывания в молекуле

белка. Для большинства гаптенов кон-

станты связывания лежат в пределах от

-4

до 10

-10

М. Следовательно, стандарт-

ная свободная энергия связывания соста-

вляет от —6 до —15 ккал/моль, т. е. лежит

в границах, характерных для фермент-суб-

стратных и фермент-коферментных ком-

плексов. Кроме того, комплексы гаптен-ан-

титело образуются под действием тех же

сил, что и фермент-субстратные ком-

плексы. Сочетание слабых нековалентных

связей типа электростатических, водо-

родных и вандерваальсовых обеспечивает

прочное и специфическое связывание.

2. Проверяли способность антител к дек-

страну (полисахариду, состоящему из остат-

ков глюкозы) связывать олигомеры. Обна-

ружили, что полное связывающее сродство

проявляется в отношении олигомера, со-

стоящего из шести остатков глюкозы. Здесь

напрашивается сравнение с лизоцимом,

у которого в щели активного центра разме-

щается тоже шесть углеводных остатков. Из

этого сопоставления следует, что длина

связывающего участка в молекулах антител

против декстрана составляет 25 А.

3. На основе спектроскопических свойств

ряда гаптенов можно получить информа-

цию о степени полярности участков связы-

вания в молекулах антител. Так, некоторые

нафталины, находясь в высокополярном

окружении (например, в воде), дают слабую

желтую флуоресценцию, а в выраженно не-

полярном окружении (например, в гекса-

не) - интенсивно голубую. Если такой на-

фталиновый гаптен присоединяется к специ-

фическому антителу, то появляется интен-

сивно голубая флуоресценция, что указы-

вает на изгнание воды из участка связыва-

ния. Как правило, участки связывания

представляют собой неполярные ниши в мо-

лекуле антитела; это увеличивает прочность

связывания антигена по причинам, которые

уже обсуждались применительно к фермент-

субстратному взаимодействию (разд. 6.8).

4. Гаптен довольно точно соответствует

связывающему участку по структуре. Специ-

фичность связывания, безусловно, очень вы-

сока, но не абсолютна. Гаптен прочно удер-

живается в участке связывания, имея, таким

образом, малую свободу вращения. Кон-

станта скорости связывания для многих гап-

тенов составляет около 10

-1

•с

-1

Столь высокая константа свидетельствует

о том, что скорость процесса контролирует-

ся скоростью диффузии. Связывание гапте-

на не сопровождается, по-видимому, суще-

ственными структурными перестройками.

33.4. Препараты антител с определенной

специфичностью обычно гетерогенны

Антитела имеют существенное отличие от

ферментов: большинство нормальных анти-

тел с определенной специфичностью, напри-

мер антитела против ДНФ, неоднородны по

молекулярному составу. Анализ связывания

динитрофенильных гаптенов с препаратом

анти-ДНФ-антител выявил целый набор ве-

личин сродства. Некоторые молекулы анти-

тел связывают ДНФ с К = 10

-6

М, тогда

как другие - с К = 10

-10

М. В отличие от

этого ферменты, как правило, характери-

зуются только одной константой связыва-

ния данного субстрата или кофермента. Да-

лее при электрофорезе препарата антител

против ДНФ или других специфических ан-

тител выявляется множество полос белка.

Ферменты же при электрофорезе дают одну

полосу или небольшое число отдельных по-

лос (например, изоферменты лактат-деги-

дрогеназы).

Гетерогенность антител с данной специ-

фичностью определяется самой природой

иммунного ответа. В чем причина гетеро-

генности? Оказалось, что антитела, проду-

цируемые одной клеткой, гомогенны. Одна-

ко различные клетки образуют разные по

структуре антитела. Антитела против ДНФ

синтезируются большим количеством раз-

личных клеток, что и обусловливает их

гетерогенность.

33.5. При ферментативном расщеплении

иммуноглобулина G образуются активные

фрагменты

Иммуноглобулин G имеет массу 150 кДа.

При изучении такого большого белка целе-

сообразно предварительно расщепить его

на активные фрагменты. В 1959 г. Родни

Портер (Rodney Porter) показал, что при

ограниченном протеолизе папаином имму-

Рис. 33.6. Флуоресценция ε-дансилли-

зина отчетливо меняется при

связывании этого гаптена со

специфическими антителами.

Сдвиг максимума флуоресцен-

ции в сторону более коротких

волн и увеличение интенсивно-

сти флуоресценции свидетель-

ствуют о том, что связывание

гаптена происходит в неполяр-

ном участке.

33. Иммуноглобулины

237

Рис. 33.7. Протеолитическое расщепле-

ние иммуноглобулина G (IgG).

Рис. 33.8. Схематическое изображение

решетки, формирующейся при

образовании перекрестных свя-

зей между IgG (показано синим

цветом) и антигеном (показано

желтым цветом).

ноглобулин G расщепляется на три ак-

тивных фрагмента массой по 50 кДа. Два

фрагмента связывают антиген. Их обозна-

чили F

(ab - от англ. antigen binding - свя-

зывающий антиген, F - от англ. fra-

gment - фрагмент), каждый из F

содержит

по одному участку связывания гаптена или

антигена, причем по связывающему срод-

ству этот участок не отличается от всей мо-

238

Часть V.

Молекулярная физиология

лекулы в целом. Однако, будучи однова-

лентным (т.е. имея один участок связыва-

ния), F

не дает осадка с антигеном; этим

отличается от интактной молекулы

иммуноглобулина G, содержащей два иден-

тичных участка связывания антигена. Им-

муноглобулин G может дать осадок с анти-

геном, содержащим не одну, а несколько

антигенных детерминант. При этом форми-

руется структура в виде протяженной ре-

шетки, где каждая молекула антитела обра-

зует перекрестные связи с двумя и более

антигенами и наоборот (рис. 33.8). Осадок

достигает наибольшего размера, если анти-

тело и антиген присутствуют в эквива-

лентных количествах.

Третий фрагмент (также 50 кДа), обозна-

чаемый F

, не способен к связыванию анти-

гена, но обладает другими биологически

важными функциями. В отличие от F

этот

фрагмент способен проникать через плацен-

тарную мембрану. Следовательно, способ-

ность иммуноглобулина G проходить

сквозь плаценту и попадать в систему кро-

вообращения плода определяется наличием

на F

специфического участка, обеспечиваю-

щего перенос через плаценту. На F

имеется

также участок связывания комплемента.

Связывание антитела с антигенной детерми-

нантой на поверхности чужеродной клетки

часто ведет к лизису последней. Такой ре-

зультат взаимодействия антитела с антиге-

ном опосредован группой белков, носящих

общее название комплемент. Присоедине-

ние одного из этих белков к комплексу анти-

ген—антитело и запускает последователь-

ность реакций, приводящих к лизису чуже-

родной клетки. В обозначении фрагмента F

индекс «с» (от англ. cristallizable - кристалли-

зуемый) указывает на способность этого

фрагмента кристаллизоваться, Обнаруже-

ние этого свойства послужило первым ука-

занием на гомогенность F

; что касается

фрагментов F

, то они гетерогенны и обы-

чно не кристаллизуются.

33.6. Иммуноглобулин G состоит

из L- и Н-цепей

Следующий важный шаг в развитии имму-

нологии был сделан также в 1959 г., когда

Джералду Эделману (Gerald Edelman) уда-

лось показать, что иммуноглобулин G со-

стоит из полипептидных цепей двух видов.

Белок обрабатывали следующим образом:

дисульфидные мостики в молекуле восста-

навливали меркаптоэтанолом; далее разру-

шали нековалентные связи 6 М раствором

мочевины. При хроматографическом анали-

зе смеси было обнаружено, что иммуногло-

булин состоит из полипептидных цепей мас-

сой 25 и 50 кДа, обозначенных соответ-

ственно как легкие (L) и тяжелые (Н) цепи.

Впоследствии Портер подобрал более

мягкие условия обработки, позволившие ре-

конструировать иммуноглобулин G из двух

Н- и двух L-пепей. На основе этих исследо-

ваний он предложил модель (рис. 33.9)

субъединичной структуры иммуноглобу-

лина G, в соответствии с которой каждая

L-цепь соединена с Н-цепью дисульфидной

связью. Н-цепи, кроме того, связаны между

собой по крайней мере одной дисульфидной

связью. В целом субъединичная структура

иммуноглобулина G L

Далее удалось определить, какие участки

предложенной структуры соответствуют

фрагментам, образующимся при расщепле-

нии папаином. Папаин отщепляет Н-цепи со

стороны С-конца от дисульфидного мости-

ка, соединяющего L- и Н-цепи. В итоге F

состоит из целой L-цепи и аминоконцевой

половины Н-цепи, тогда как F

состоит из

С-концевых половин обеих Н-цепей, Часть

Н-цепи, содержащаяся в F

, обозначается

33.7. Иммуноглобулин G - гибкая

Y-образная молекула

Электронно-микроскопические исследова-

ния, проведенные Робином Валентайном

и Майклом Грином (Robin Valentine,

Michael Green), показали, что иммуноглобу-

лин G имеет форму буквы Y и что гаптен

присоединяется на концах F

-единиц.

-единица и две F

-единицы в интактном

антителе соединены между собой своего ро-

да шарниром, благодаря чему угол между

-единицами может меняться быстро и

в большом диапазоне величин (рис. 33.10).

Этот вид подвижности (гибкости) шарнир-

ного типа усиливает комплексообразование

между антигеном и антителом, так как спо-

собствует лучшему связыванию полива-

лентных антигенов. В самом деле, таким пу-

тем расстояние между антиген-связываю-

щими участками на концах F

-единиц мо-

жет быть приведено в соответствие

с расстоянием между специфическими

детерминантами на антигене (например, на

вирусе, имеющем много повторяющихся

субъединиц). Как правило, если связывание

поливалентного антигена происходит в двух

участках связывания антигена, то сродство

возрастает в 10

раз по сравнению со связы-

ванием в одном участке. Не исключено, что

подвижность шарнирного типа играет так-

же определенную роль и в передаче инфор-

мации от F

-единиц на F

-единицу.

Рис. 33.9. Субъединичная структура

IgG — L

. F

-фрагменты,

высвобождающиеся при рас-

щеплении папаином, показаны

синим цветом, F

-фрагмент -

красным.

Рис. 33.10. Иммуноглобулин G имеет

Y-образную форму. Наличие

в молекуле шарнирного соеди-

нения обусловливает подвиж-

ность отдельных участков.

33. Иммуноглобулины

239

33.8. Антитела образуются под действием

отбора или инструкции?

Специфичность ферментов вырабатывалась

на протяжении миллионов лет эволюции.

Специфические антитела появляются в кро-

ви животного всего лишь через несколько

недель после воздействия чужеродной де-

терминанты. Каким же образом обеспечи-

вается образование специфических антител

в столь короткое время?

1. В 1940 г. Лайнус Полинг (Linus Pauling)

предложил так называемую инструктивную

теорию, согласно которой антиген дей-

ствует как матрица, определяющая конфор-

мацию новообразованной полипептидной це-

пи антитела. При этом предполагалось, что

молекулы антител с данной последователь-

ностью аминокислот обладают потенциаль-

ной способностью к образованию антиген-

связывающих участков самой разнообраз-

ной специфичности; возникновение же опре-

деленной специфичности зависит от при-

роды антигена, присутствующего во время

свертывания полипептидной цепи. Согласно

инструктивной теории, специфическое анти-

тело не может образоваться в отсутствие со-

ответствующего антигена.

2. Селекционная теория (теория отбора),

которую в 50-х годах выдвинули Макфер-

лейн Вернет и Нильс Ерне (Macfarlane

Burnet, Niels Jerne), постулирует, что анти-

ген регулирует только количество синтези-

руемых специфических антител. Согласно

этой теории, антиген-связывающие участки

специфических антител полностью детер-

минированы еще до встречи с антигеном.

33.9. Конец инструктивной теории

Инструктивная теория предсказывала, что

если молекула антитела будет развернута

(денатурирована), а затем вновь свернется

(ренатурируется), то ее специфичность будет

утрачена. Этому предсказанию противоре-

чили экспериментальные данные по ренату-

рации рибонуклеазы, полученные в лабора-

тории Христиана Анфинсена (Christian

Anfinsen). Вспомним, что денатурированная

рибонуклеаза спонтанно восстанавливает

исходную трехмерную структуру, специфич-

ность и каталитическую активность после

удаления денатурирующего агента

(разд. 2.12). Для ренатурации присутствие

субстрата не требуется. Этот принципиаль-

но важный факт относительно рибону-

240

Часть V.

Молекулярная физиология

клеазы послужил стимулом для постановки

аналогичных опытов с антителами

(рис. 33.11). Были взяты F

-фрагменты ан-

тител против ДНФ; использование фраг-

ментов относительно небольшого размера,

а не целых антител значительно упрощает

эксперимент. F

-фрагмент обрабатывали

высокоэффективным денатурирующим

агентом - 7М солянокислым гуанидином.

Денатурированный таким образом

-фрагмент терял сродство к гаптену

(ДНФ). Данные гидродинамического и оп-

тического анализа свидетельствовали о том,

что конформация денатурированного F

была близка к случайному клубку. Далее

гуанидин-HCl удаляли путем диализа; при

этом денатурированный F

восстанавливал

исходную пространственную структуру

в отсутствие гаптена ДНФ. Самым пора-

зительным было то, что ренатурированный

обладал высоким сродством к динитро-

фенольным гаптенам. Поскольку ренатура-

ция происходила в отсутствие гаптена, не

оставалось сомнений, что специфичность

участка связывания антигена определяется

только последовательностью аминокислот

белка-антитела. Результат этого экспери-

мента свидетельствовал в пользу отбора

и противоречил основному предсказанию

инструктивной теории. Более того, было об-

наружено, что клетки, продуцирующие анти-

тела, способны синтезировать их в большом

количестве в отсутствие антигена. Это

окончательно подтвердило основной тезис

селекционной теории: антиген влияет на ко-

личество продуцируемых специфических ан-

тител, но не на их аминокислотную последо-

вательность или трехмерную структуру.

33.10. Иммуноглобулины миеломы

и гибридомы гомогенны

Как же могут синтезироваться специфиче-

ские антитела до появления антигенов? Ге-

терогенность антител и трудности анализа

смеси их молекул на протяжении многих лет

служили препятствием к изучению этой про-

блемы. Выйти из этого положения удалось

путем использования такого объекта иссле-

дования, как множественная миелома - зло-

качественное перерождение клеток, проду-

цирующих антитела. При этом виде рака

происходит перерождение одного лимфоци-

та или плазматической клетки, что ведет

к неконтролируемому клеточному делению.

Следовательно, в этом случае образуется

большое число клеток одного типа. Они со-

ставляют клон, т.е. происходят от одной