Рубин А.Б., Пытьева Н.Ф., Ризниченко Г.Ю. Кинетика биологических процессов

Подождите немного. Документ загружается.

при

любом

х, а

поэтому производная правой части (III.6—9)

сов-

падает

(/пр — /от)

пр

сме-

На

графике

(рис.

III.19,

Б)

видно,

что все

точки, расположенные

на

ветвях

(участок

be) и III

(участок

da),

относятся

устойчи-

вым точкам,

а на

ветви

(участок

ас)

располагаются неустойчи-

вые стационарные точки.

Каждому положению прямой

от

= — (рис.

III.19,

А)

соответ-

ствуют

три точки пересечения ее с кубической кривой

р(*).

Та-

ким

образом, наша система триггерная, так как обладает тремя

стационарными состояниями, два из которых Х\, Хз устойчивы.

Расположение прямой /

от

= — = непосредственно зави-

а г [S]

сит от концентрации субстрата 5 в среде. Допустим, что система

находится в стационарной точке х

и что при этом происходит уве-

личение концентрации [S]. Тогда прямая /

от

будет

опу-

[S] _

скаться вниз вдоль оси ординат, а стационарная точка Х\

щаться по ветви I в направлении,

указанном стрелкой. Система при

этом

будет

последовательно прохо-

дить через ряд стационарных со-

стояний.

В бифуркационной точке

(с) произойдет скачкообразный пе-

реход

на ветвь III в точку (d). Если

теперь концентрация [S] начнет

уменьшаться, то система

будет

эво-

люционировать вдоль ветви III до

точки (а), из которой путем скач-

кообразного перехода она вновь

вернется на ветвь I. Таким образом

осуществится гистерезисный цикл,

уже описанный ранее.

В зависимости от концентрации субстрата [S] система может

переключаться из одного состояния в

другое,

что в данном

случае

означает существование управляющих внешних факторов, которые

определяют режим функционирования биосинтетических процессов

в клетке.

Заметим еще раз, что описанные переходы осуществляются в

результате

изменения управляющего параметра — концентрации

субстрата [S]. Скорость его изменения должна быть намного

меньше скорости метаболических реакций, с тем чтобы по мере

изменения

концентрации субстрата последние успевали достичь

стационарного состояния при каждом новом значении [S].

Рис.

III.19.

К определению ста-

ционарных состояний в системе

биосинтеза белка

231

Глава

КОЛЕБАНИЯ

В ФЕРМЕНТАТИВНЫХ СИСТЕМАХ

Нелинейность

кинетики важнейших биохимических процессов

обусловливает возможность существования в биологических систе-

мах

незатухающих

периодических режимов (автоколебаний).

В настоящей

главе

мы покажем применение качественных методов

анализа динамических систем в исследованиях периодических про-

цессов ферментативного катализа. Такого рода исследования поз-

воляют приблизиться к пониманию механизма ряда важных био-

логических процессов, протекающих в периодическом режиме.

Анализ колебательных свойств биохимических систем может так-

же

служить

средством изучения их внутренней

структуры

и орга-

низации,

что, в свою очередь, является важным и, по-видимому,

необходимым этапом в выяснении механизмов саморегулирования

живых организмов.

Периодическое течение некоторых биологических процессов

было обнаружено достаточно давно: первые сообщения о колеба-

тельных изменениях активности ряда ферментов появились около

пятидесяти лет назад (рис.

III.20).

Однако мысль о возможности

периодических явлений в биологии в те времена не привлекла

должного внимания исследователей. На основе представлений о

квазистационарном

течении биохимических реакций успешно раз-

вивалась стационарная кинетика ферментативного катализа.

Существование же

«колеблющихся»

биохимических реакций дол-

гое время считалось сомнительным. Такое мнение во многом было

обусловлено наличием термодинамических ограничений, согласно

которым колебания вблизи положения термодинамического равно-

весия

невозможны.

Позднее

развитие термодинамики необратимых процессов пока-

зало возможность колебаний около неравновесных стационарных

состояний,

которые как раз характерны для биологических систем

(Гленсдорф, Пригожий,

1973).

Одновременно шло накопление объективных эксперименталь-

ных данных о том, что некоторые биохимические процессы

могут

протекать с периодически меняющейся интенсивностью. Так, в

1955 г. Вильсоном и Кальвином были обнаружены колебания кон-

центраций

различных метаболитов цикла темновых реакций фото-

синтеза (рис. III.21)

(Wilson,

Calvin,

1955).

Дюйзенг и

Амез

заре-

гистрировали периодические изменения концентрации восстанов-

ленного пиридиннуклеотида в

ходе

гликолиза

дрожжевых

клеток

(Dnysens,

Amesz,

1957).

Шноль сообщил о спонтанных колебаниях

АТФ-азной активности актомиозина (Шноль,

1958).

232

Шестидесятые годы ознаменовались появлением большого чис-

ла работ Чанса с сотрудниками, Хиггинса, Хоммеза, Френкеля,

Хесса и

других,

посвященных исследованию колебательной

кине-

тики

изменения концентраций гликолитических метаболитов

(рис.

III.22,

23). Было установлено, что наиболее вероятным гене-

2.Ш

в.Ш 16.Ш 23.Ш 1.1

8.1

i.drni

Рис.

III.21.

Изменение концентра-

ций

метаболитов цикла Кальвина

при

резком уменьшении концентра-

ции

углекислоты

(Wilson,

Calvin,

1955):

РДФ

— рибулезодифосфат, ФГК —

фосфоглицериновая

кислота. Вре-

мя

отсчитывается с момента пре-

кращения

подачи СОг

Рис.

II 1.20. Периодическое изменение

во времени активности уреазы (А)

при

длительном выдерживании в тер-

мостате

ратором периодических колеба-

ний

в гликолизе является реак-

ция,

катализируемая фосфо-

фруктозокиназой,

и что значения

концентраций

субстрата (фрук-

тозо-6-фосфат) и продукта (фрук-

тозо-1,6-дифосфат) изменяются

противофазе, период колебаний

варьирует от 23 до 77 с.

Последнее время интерес к колебательным биологическим

процессам особенно возрос, что в значительной мере обусловлено

успехами в изучении «биологических часов». Их обнаружение в

одноклеточных организмах не оставляло сомнений в том, что ис-

точником

(генератором) биологических ритмов является автоколе-

бательная система биохимических реакций, локализованная вну-

три клетки (Гудвин, 1966). Вопрос о механизме биочасов и глико-

литических колебаний стимулировал начало важных теоретических

(модельных) исследований. Большую роль в изучении механизмов

периодических явлений в биохимии сыграли теоретические работы

Христиансена (Christiansen,

1961).

Широкую известность получила

модель, предложенная Спанглером и Снеллом (Spangler, Snell,

1961),

основанная на предположении о перекрестном угнетении

двух

ферментов продуктами катализируемых ими реакций. К чис-

лу таких исследований принадлежат и работы Чернавской, Чер-

навского,

в которых была предложена автоколебательная модель

233

темновых реакций фотосинтеза. Систематическому исследованию

условий возникновения периодических колебаний в системе биохи-

мических реакций посвящен ряд работ Хиггинса (Higgins, I964,

Глюкоза

Прекращение \

20мМ

аэрации

АМФ

Рис.

II 1.22. Затухающие ко-

лебания концентраций гли-

колитических метаболитов,

наблюдаемые в суспензии

дрожжевых клеток при до-

бавлении глюкозы и пере-

ходе

от аэробного дыхания

анаэробному. По оси ор-

динат отложена интенсив-

ность флуоресценции, харак-

теризующей уровень восста-

новленного НАД (верхняя

кривая)

и концентраций

АТФ, АДФ и АМФ (нижние

три кривые) (Betz A., Chan-

ce В., 1964)

Рис.

III.23.

Колебания концентраций

восстановленного НАД, зарегистриро-

ванные в экстрактах сердечной мыш-

цы

(Frenkel, 1966)

0,5 10 15 20 r,</

Рис.

III.24. Незатухающие колебания

концентрации

НАД — Н

в экст-

ракте дрожжей

1967). Важную роль в изучении механизмов биохимических коле-

баний

сыграли отечественные теоретические работы Селькова с

соавторами, на которых мы подробно остановимся ниже. Однако,

234

прежде чем перейти к изложению результатов этих работ, рас-

смотрим вопрос о том, каковы необходимые условия возникновения

колебаний

в системе ферментативных реакций.

Как

уже упоминалось, колебания в химических реакциях воз-

можны лишь вдали от термодинамического равновесия. Можно

показать,

что

«для

того чтобы в химической реакции существовало

неравновесное стационарное состояние, необходимо, чтобы измене-

ние

концентраций

двух

различных групп реагентов происходило

двух

сильно различающихся масштабах времени» (Уолтер, 1969).

В ферментативных системах это условие практически всегда вы-

полнено,

так как обычно концентрация субстрата намного превы-

шает концентрацию фермента, что, в свою очередь, обусловливает

возможность существования

двух

сильно различающихся масшта-

бов времени для субстрата и ферментсодержащих комплексов

(см.

гл. 4). Временная иерархия реагентов и условия приближен-

ной

стационарности для некоторых из них (например для фермент-

субстратного комплекса)

могут

реализоваться не только в откры-

тых, но и в замкнутых ферментативных системах. Однако в замк-

нутых

системах эти условия выполняются лишь в течение

некоторого ограниченного интервала времени, пока концентрация

субстрата достаточно велика. Следовательно, колебания, которые

могут

иметь место в замкнутых ферментативных системах, непре-

менно

должны быть затухающими. К аналогичному выводу приво-

дит теоретическое рассмотрение конкретных моделей

«замкнутых»

ферментативных систем (Higgins, 1967). Ясно, что затухание ко-

лебаний в замкнутой системе реакций обусловлено эволюцией си-

стемы к равновесному состоянию.

Незатухающие колебательные изменения концентраций реаген-

тов возможны лишь в открытых ферментативных системах, в ко-

торых существование

двух

сильно различающихся масштабов

времени может поддерживаться неограниченно долго за счет при-

тока субстрата от внешнего источника и оттока продукта во внеш-

нюю

среду.

случае

сопряженных полиферментативных реакций,

которых продукт одной реакции служит субстратом для следую-

щей,

тем более возможны незатухающие колебания концентраций

(автоколебательный режим). Дело в том, что масштаб времени,

связанный

с первым субстратом и последним продуктом, может

значительно превосходить масштаб времени, характерный для

промежуточных реагентов.

«Открытость»

ферментативной системы и существенное разли-

чие характерных времен отдельных стадий процесса является не-

обходимым, но не достаточным условием возникновения в такой

системе концентрационных автоколебаний. Пользуясь методами,

изложенными

в первой части книги, нетрудно показать, что авто-

колебания

возможны лишь в нелинейной динамической системе.

Поэтому для существования в открытой биохимической системе

незатухающих концентрационных колебаний необходим также не-

линейный

механизм реакций.

235

Весьма распространенная причина нелинейности биохимических

систем связана с наличием «обратной связи» в цепи ферментатив-

ных реакций, продукт которых контролирует активность фермента:

_*.s->p^

При

этом характер такого влияния может быть различным.

Наиболее распространен случай продуктного угнетения (по дан-

ным

Уолтера и Фридена не менее половины исследованных фер-

ментов угнетается продуктами). Продукт может также активиро-

вать фермент во всем диапазоне возможных значений собственной

концентрации

либо угнетать при одних и активировать при дру-

гих значениях концентрации.

Другой широко известный нелинейный механизм регулирования

биохимических систем — субстратное угнетение ферментов. Как

мы уже видели (гл. 5), в открытых ферментативных системах с

субстратным угнетением реализуются такие типичные нелинейные

явления,

как множественность стационарных состояний, гистере-

зис.

На примере реакции с комбинированным субстратным и про-

дуктным угнетением мы увидим, что торможение ферментов суб-

стратами оказывает сильное дестабилизирующее действие на си-

стемы, контролируемые механизмами обратной связи, способствуя

возникновению

в них неустойчивости и автоколебаний.

Итак,

на основании вышесказанного можно заключить, что в

открытой нелинейной ферментативной системе возможно сущест-

вование незатухающих периодических изменений концентраций

реагентов. В качестве примера такой системы рассмотрим реак-

цию

с субстратным и продуктным угнетением (Сельков,

19676,

1972)

Проанализируем условия, при которых в такой системе возникают

концентрационные

автоколебания.

Согласно

схеме

III.7—1,

субстрат

поступает в сферу реакции

от некоторого источника SQ

СО

скоростью V\ и превращается в про-

дукт

Р под действием фермента, активность которого подавляется

как

субстратом S, так и продуктом Р. Далее продукт Р утилизи-

руется

«стоком»

со скоростью v

. При этом имеет место следую-

щая

последовательность реакций:

S£A«._^p+ £-'-»-,

236

$ +

SE^±±SSE,

(III. 7—2)

P^E— ->£P,

-f S£ —"

P-J-.S.SE—-*SS£P.

*-e

Здесь

S£ —

активный фермент-субстратный комплекс;

SSE,

ЕР

и SEP —

пассивные комплексы;

±i

—

константы скоростей

прямых

(+) и

обратных

(—),

реакций.

Величину

k-2

будем

полагать равной нулю,

так как

обычно

обратная реакция

Р + Е

——>SE имеет очень

малую

скорость,

ее можно

не

учитывать. Анализ динамических режимов системы

(III.7—2)

показывает также,

что

возбуждение автоколебаний

реакции

рассматриваемого типа возможно лишь

в том

случае, если

эта реакция существенно необратима (Сельков,

19676).

схеме

(III.7—2) учтена возможность

как

конкурентного,

так

неконкурентного угнетения продуктом. Напомним,

что при не-

конкурентном

механизме угнетения продукт

равной вероятностью

может взаимодействовать

как со

свободным ферментом,

так и с

фермент-субстратными комплексами

SE, SSE.

Поэтому естествен-

но

полагать,

что

—

, (III.

7—За)

случае

конкурентного угнетения продукт может образовывать

неактивный

комплекс лишь

со

свободным ферментом.

При

этом

±ъ

= 0, k

±6

(III.

7—36)

Формулировка

модели.

Полное описание динамики системы

ре-

акций

(III.7—2)

соответствии

законом действующих масс

включает восемь нелинейных дифференциальных уравнений.

Однако

тот

факт,

что

обычно концентрации различных форм

фер-

мента

Е на

несколько порядков ниже концентраций субстрата

продукта, позволяет существенно упростить

это

описание.

Итак,

предположим,

что

имеют место соотношения

[£]<<[-$],

(III. 7—4)

Как

было показано

в гл. 4,

выполнение условий (III.7—4) озна-

чает,

что

концентрации свободного

связанного

различные

комплексы

фермента являются быстрыми переменными.

Это поз-

воляет воспользоваться теоремой Тихонова

заменить дифферен-

237

циальные уравнения для быстрых переменных алгебраическими

соотношениями.

Выполнив эту процедуру, получим систему дифференциальных

уравнений 2-го порядка, описывающую изменение во времени мед-

ленных переменных — концентраций субстрата 5 и продукта Р.

В общем виде редуцированная система может быть записана сле-

дующим образом:

(III.

7—5)

V(G, p) — v

где cr, p — безразмерные концентрации субстрата и продукта со-

ответственно; т — безразмерное время; л(0, p) представляет собой

относительную квазистационарную скорость ферментативной ре-

акции.

Примем для конкретности, что источник субстрата и сток про-

дукта

описываются уравнениями (III.7—6) и (III.7—7) соответ-

ственно

= k

([S

]~ [S]), (III. 7—6)

v,=k7[P].

(III. 7—7)

Согласно

(III.7—6),

реакция притока субстрата обратима. Урав-

нение

(III.7—7),

в свою очередь, означает, что скорость утилиза-

ции

продукта линейно увеличивается с ростом его концентрации.

В работе (Сельков,

19676)

была показана возможность возникно-

вения

автоколебаний в системе реакций (III.7—2) при постоянной

скорости стока продукта

= const.

Однако условие (III.7—7) значительно расширяет область приме-

нимости рассматриваемой модели, так как линейный сток продук-

та может быть обеспечен как ферментативным, так и нефермента-

тивным путем.

учетом

(III.7—6,

7) схема реакций (III.7—2) описывается

следующей системой дифференциальных уравнений второго по-

рядка:

^ ~ = Pi К - а) - v (а, р), (III. 7-8)

ах

~T = v(a, P) — РгР.

где квазистационарная скорость ферментативной реакции v(o, p)

определяется в

случае

неконкурентного угнетения продуктом

(условие III.7—За) уравнением

238

(а, р) = •, (III. 7—9а)

;

(1 + о + оо») (1 -

р) '

случае

конкурентного

угнетения

(условие

III.7—36)

—

урав-

нением

v (а, р) = / . (III. 7-96)

l-LcJ-

ао

+ р

Здесь

—безразмерные

концентрации

субстрата

продукта

соответст-

венно,

т =

Vt;K

— безразмерное время; а, сто, Рь рг, !-i — безразмерные параметры:

Выше использованы следующие обозначения:

— ~* '—— — константа Михаэлиса

рассматриваемой ферментативной реакции; Ki = k-

— констан-

та субстратного ингибирования;

/С

= &-4/&+4 — константа продукт-

ного ингибирования; V=k

— максимальная скорость реакции,

v = v/V — относительная скорость реакции;

= [Е] + [SE] + [SSE] - [SEP] -

[SSEP] —

суммарное количество молекул свободного и связанного в комп-

лексы фермента.

Параметр

а=К

/К\

характеризует

«глубину»

субстратного

угнетения; параметр jx =

//C

— соответственно глубину про-

дуктного угнетения.

Исследование

модели.

Для определения числа и характера

устойчивости особых точек системы (III.7—8) используем графи-

ческое представление зависимостей \ч(о),

V2(cr)

и v(a, p). С при-

мерами такого графического анализа читатель уже встречался в

главах

4—6. Напомним еще раз, что в основе этого метода лежит

необходимое условие стационарности процесса — равенство скоро-

стей отдельных его стадий.

Графическое представление зависимости скоростей vi и v от

концентрации

субстрата а при различных значениях концентрации

продукта р показано на рис.

III.25,

А. Функции vi(a) на рисунке

соответствует «прямая» источника, функция \(а) выражается ха-

239

рактерной

кривой с максимумом (см. гл. 2). С увеличением кон-

центрации

продукта в сфере реакции максимум кривых v(a)

пони-

жается и смещается вправо — в область более высоких концен-

траций

субстрата, что обусловлено наличием продуктного

угнетения. На рис. III.25 дано графическое построение зависи-

мости v(p) с помощью уравнения баланса субстрата

а пХ

Из рис.

III.25,

А видно, что в зависимости от

графики

функций vi (о) и

v, = v

= 0

величины р (концентрации продукта)

Рис.

111.25.

К определению числа стационарных состояний в системе

с субстратным и продуктным угнетением:

— скорость «источника» Vi и ферментативной реакции v в зависи-

мости от концентрации

субстрата

0; 5 — скорость реакции v и стока

продукта V; в зависимости от концентрации последнего

v(a)

могут

иметь от одной до

трех

точек пересечения. Наличие

одной

точки пересечения указанных графиков при р<рг и р>р4

означает, что каждому ре[0, рг] и ре[р

, оо] соответствует одно-

единственное значение скорости реакции v(p). Каждому значению

из интервала (р2<р<р<0 соответствуют три точки пересечения

'графиков

VI((T) И V(CT), следовательно, три различных значения

v(p). Критическим значениям концентрации продукта

р=рг

р =

Р4

отвечают по два различных значения скорости реакции v(p).

Таким

образом, зависимость v(p) графически выражается харак-

терной Z-образной кривой, показанной на рис.

III.25,

Б.

Найдем теперь стационарное состояние системы (III.7—8) с

помощью уравнения баланса продукта v ((>) = v

(p) f—j-

Решениям

этого уравнения v = V2 соответствуют точки пересечения

графиков

v(p) и

л.'

(р),

представленных на рис.

III.25,

Б. Видно,

что кривая v(p) молсет иметь от одной до

трех

точек пересечения

с прямой стока продукта v

(p). Это означает, что в рассматривае-

240