Рубин А.Б., Пытьева Н.Ф., Ризниченко Г.Ю. Кинетика биологических процессов

Подождите немного. Документ загружается.

где / — ингибитор. Оба процесса

следует

рассматривать совместно,

учитывая при этом сохранение числа частиц:

[S] + [P) = [S

(Ш.2—10)

[E]+[ES]

[EI] [E]

Равновесная концентрация неактивного фермент-ингибиторного

комплекса может быть определена из соотношения

~~к~с

[EI] '

откуда

[Е

1]=Ш1,

(Ш.2-11)

Здесь Кг — так называемая ингибиторная константа, определя-

емая соотношением скоростей образования и диссоциации комп-

лекса El.

использованием (III.2—11) условие сохранения молекул фер-

мента (Ш.2—10) можно представить следующим образом:

[Л

[Е

] = [Е] + [ES] + МЖ- = [ES] + [Е] (1 +

откуда

концентрация свободного фермента

[ES]

(Ш.2—12)

1Ъ

В условиях квазистационарного образования комплексов ES

EI выполняется

Подставляя (III.2—12) в уравнение

[ES] = k

[E] [S] — k.

[ES] — £

[ES] = 0

разрешая его относительно [ES], получим окончательное выра-

жение для стационарной концентрации фермент-субстратного ком-

плекса

[Е

]

[S]

[ES] =

К„

Стационарная скорость реакции у, в присутствии ингибитора, рав-

ная

Vi=k+2[ES],

определяется при этом уравнением

= Ш. = k,

EMJS] (Ш.2-13)

4ГЧ1 '

Г/1

201

Это уравнение аналогично каноническому уравнению Михаэ-

лиса — Ментен и отличается от него лишь добавочным членом

Km[I]IKi

в знаменателе. При

[S]-»-oo

из уравнения (III.2—13)

получаем, что максимальное значение скорости синтеза продукта

в присутствии ингибитора, как и в простейшем случае, равно

В частном

случае

конкурентного угнетения

продуктом

справедливо следующее выражение для скорости реакции:

[Ер] [S]

—, где К, -

-==*-.

(Ш.2-14)

(1 +

[P\lKt)

+S k

Теоретическое рассмотрение ферментативной реакции с обра-

тимым конкурентным ингибированием допускает эксперименталь-

ную проверку. Так, из уравнений (III.2—8) и (III.2—13)

следует,

что отношение скоростей синтеза продукта в отсутствие ингиби-

Рис.

III.

Стационарная скорость

простейшей ферментативной реак-

ции

как функция концентрации

субстрата

Рис.

III.2.

Стационарная скорость

ферментативной реакции с конку-

рентным продуктным угнетением

как

функция концентрации про-

дукта

тора и в его присутствии при постоянной концентрации субстрата

линейно

зависит от концентрации ингибитора. Если соответствую-

щие экспериментальные зависимости

v/Vi([I])

будут

представлять

собой прямые, отсекающие на оси ординат отрезок, равный еди-

нице,

то это доказывает правильность исходных предположений

относительно механизма действия исследуемого ингибитора.

Зависимость u

([S]) и в этом

случае

не отличается по форме

от кривой, изображенной на рис.

III.1.

Зависимость величины v

от концентрации продукта реакции с конкурентным продуктным

угнетением показана на рис.

III.2.

В практике встречаются также случаи активации продуктом,

в том числе квадратичной. Реакция с активацией продуктом про-

текает по следующей схеме:

202

4-F

(

-I±l~>.SF-±J->

+ P,

Стационарная

скорость такой реакции дается выражением

[Е

] [S] (*

, + k

[P]IK

)

v =

(Ш.2—14а)

+ [S] -f [S]

[Р]1К

+ _й

[P]/ft

i #

где

Am =- ; .

Схему

реакции с квадратичной активацией продуктом и соот-

ветствующее

выражение для стационарной скорости утилизации

субстрата

можно найти в книге Жаботинского (1974).

Аналогичным

путем

можно проанализировать стационарную

кинетику

ферментативных реакций с

неконкурентным

(аллостери-

ческим) ингибированием. Легко показать, что скорость синтеза

продукта в этом

случае

определяется выражением '

= Ш. = . *±Ш ,

(Ш.2-15)

^S)(l

[I]IKi)

}

из

которого при [5] > К

получаем

У,~-

fe+a[£o]

. (Ш.2—16)

+ lWKt) '

Из

выражения (Ш.2—16)

следует,

что максимальная скорость

реакции

в присутствии неконкурентного ингибитора, в отличие от

случая

конкурентного угнетения, зависит от концентрации ингиби-

тора.

Ингибирование

субстратом

Важным частным

случаем

регулирования скорости фермента-

тивных реакций является угнетение субстратом. Исследование ки-

нетики

торможения ферментов высокими концентрациями

субстра-

та имеет большое значение для понимания механизмов фермента-

тивного катализа. Как мы увидим в дальнейшем, именно

субст-

ратное угнетение ферментов является наиболее типичной причиной

нелинейности

биохимических систем. Наличие такого типа нели-

нейности

обусловливает важные с точки зрения механизмов

регу-

лирования

свойства ферментативных систем: множественность

стационарных состояний, явления гистерезиса.

* Подробный вывод выражения (Ш.2—16) есть в книге Яковлева (1965).

203

Рассмотрим стационарную кинетику ингибирования

субстра-

том простейшей ферментативной реакции, в которой, помимо ак-

тивного комплекса ES, образуется неактивный комплекс ES

+ S ч_^

-S4_^i-

~r P,

(III.2—17)

Путем несложных преобразований можно получить выражение для

стационарной скорости реакции, термозящейся избытком суб-

страта:

(Ш.2-18)

v =

где Ks =

k-з

[S]

IS]*/K

Уравнение (III.2—18) графически выражается

характерной «колоколообразной» кривой с максимумом (рис.

III.3).

В практике реализуются и более сложные механизмы

субстрат-

ного угнетения. Авторами (Бресткнн и др., 1961) выполнен

кине-

тический анализ систем, допускающих возможность образования

неактивных фермент-субстратных комплексов, соответственно, бо-

лее сложного состава:

В такой системе зависимость

([S]) также имеет немонотонный

характер, показанный на рис.

III.3.

Итак,

мы рассмотрели стацио-

нарные характеристики отдельных

ферментативных реакций, наиболее

часто встречающихся в энзимоло-

гии.

Однако, как правило, в живых

системах такие реакции протекают

не

изолированно, а являются эле-

ментами сложных полифермента-

тивных систем. Процесс переработ-

ки

исходного

субстрата

в конечный

продукт осуществляется в таких

системах в несколько стадий с уча-

стием целой последовательности

ферментов. Полиферментативные системы, в свою очередь, бы-

вают

линейные, разветвленные и кольцевые (или циклические),

как,

например, циклы Кребса и Кальвина. В следующей

главе

мы рассмотрим принципы регулирования и основанные на этих

принципах

методы анализа процессов, протекающих в сложных

полиферментативных системах.

"opt

\PJ

Рис.

Ш.З. Стационарная скорость

ферментативной

реакции с

субст-

ратным

угнетением как функция

концентрации

субстрата

204

Глава

СТАЦИОНАРНЫЙ

АНАЛИЗ

ПОЛИФЕРМЕНТАТИВНЫХ СИСТЕМ.

ЭФФЕКТ

УЗКОГО МЕСТА

Важной особенностью стационарной кинетики ферментативного

катализа является так называемый принцип узкого места, соглас-

но

которому скорость последовательной цепи реакций определяет-

ся

наиболее медленной стадией. Этот эффект играет важнейшую

роль в регулировании процессов метаболизма, так как позволяет

изменять активность полиферментативной системы, управляя лишь

одной,

«определяющей» реакцией. При этом остальные звенья це-

пи

никак не влияют на скорость образования конечного продукта.

Принцип

минимума, широко известный в практике биохимиче-

ских исследований, получил строгое математическое обоснование.

Остановимся кратко на основных этапах теоретического исследо-

вания,

выполненного в работе Чернавского и Иерусалимского

(1965).

Рассмотрим неразветвленную цепь из

двух

ферментативных

реакций.

Предположим, что на первой стадии процесса

субстрат

S[ преобразуется в продукт Р\, который, в свою очередь, является

субстратом для следующей ферментативной реакции:

Si +

^^SA-^-^-Pj+f;,

(III. 3—1)

(III.

3—2)

Пусть каждая реакция подвержена неконкурентному торможе-

нию

ингибиторами 1\ и /

соответственно (ради сокращения записи

не

будем

приводить схемы, описывающие взаимодействие фермен-

тов с ингибиторами). Тогда скорость синтеза продукта первой

реакции

будет

равна (см. предыдущую

главу)

d [Pil \

& [Е

] [S

] ц

П 3

Здесь

[EQI]—исходная

концентрация фермента, катализирую-

щего первую реакцию; Km, Ki — константы Михаэлиса и ингиби-

рования

для этой реакции.

Скорость убыли продукта Р\ за счет второй реакции

будет

равна

'd[Pi\\

__ *" [Е

] [Рг] ,

—^—

till,

«J * I

(К

^ + [Pj]) (1 -]-

]//c")

где

[Е

ог

Km, К]

— соответствующие параметры второй реак-

ции.

205

Очевидно, в стационарном режиме должно выполняться усло-

вие баланса продукта Pi

ЛЗЩ

(*Щ .

(ш.з-5)

[dt

Это условие невыполнимо, если скорость первой реакции больше

скорости второй. В этом

случае

продукт Р

будет

неограниченно

накапливаться,

и стационарное течение процесса невозможно. Для

того чтобы рассматриваемая система реакций могла функциони-

ровать в стационарном режиме, необходимо допустить существо-

вание слабого оттока продукта Pi из сферы реакций, что может

обеспечиваться, например, за счет частичной обратимости первой

стадии процесса.

При

наличии слабого оттока продукта Pi

уравнение баланса этого соединения в стационарных условиях

0 имеет вид

суммарное

- * [Pi] ~

В уравнении (III.3—6) введены обозначения:

да

Заметим,

что величина Qi в (III.3—7) не зависит от парамет-

ров второй реакции, а величина Q2, по смыслу равная максималь-

ной

скорости второй стадии процесса, не зависит от параметров

первой реакции.

Разрешая

уравнение (III.3—6) относительно [Pi], получим сле-

дующее

выражение для стационарной концентрации продукта пер-

вой

реакции:

(HI.

3—8)

При

этом стационарная скорость суммарного процесса образо-

вания

продукта Рг определяется уравнением

206

или

= Qi - -у [Qi - Q

- х

/С"

+ /(Qi - Q

и/С")

(III.

3—9)

Примем,

что

скорость оттока продукта

Р;

(коэффициент

у. в

уравнении (III.3—6)) мала

по

сравнению

константами

/г

, k

характеризующими активность,

или

число оборотов соответствую-

щих ферментов

%<tk\

х«&». (III. 3-10)

Только

при

выполнении этого условия имеет место строгий

принцип

минимума,

т. е.

полная независимость скорости суммар-

ного процесса

от

скоростей

«не

самых медленных»

(не

находя-

щихся

минимуме) реакций.

Положим

примем

соответствии

вышесказанным,

что

выполняется силь-

ное

неравенство

е«1.

(Ш.З—11)

Тогда

выражении (Ш.З—9) можно пренебречь членами порядка

е,

именно: членом

х/Cm в

круглых скобках

вторым членом

под

корнем.

После извлечения корня получим

° t^l - 1 in

_[_ Г)

\О О h ПИ 3—12"»

Предположим теперь,

что

Qi>Q2-

Это

означает,

что

«минималь-

ной» (наиболее медленной) является вторая реакция. Раскрывая

знак

модуля, получим

-^*L^Q,,

(III.

3—13)

т.

е.

скорость образования конечного продукта

не

зависит

от

пара-

метров первой реакции

целиком определяется характеристиками

второй, наиболее медленной стадии. Аналогичная ситуация имеет

место

и в том

случае, когда величины

Q\ и

Q% одного порядка

(например,

различаются

на 10%),

если

е при

этом имеет порядок

Ю-

—10"

Итак,

согласно (Ш.З—8)

рассматриваемом

случае

Щ ^

Km•

(Ш.

3— 14)

207

Условие (Ш.З—14) означает, что промежуточный продукт Р\

накапливается в таких количествах, что скорость образования Рг

силу свойства насыщаемости ферментативных реакций прини-

мает постоянное, максимальное для данной системы значение

у _ kn [Е

]

Ясно,

что при этом скорость накопления конечного продукта Р

не

чувствительна к концентрации Pi, а стало быть, и к парамет-

рам первой реакции.

следует

рассмотреть случай, когда наиболее медленной

является первая реакция, т. е. СЬХЭь Тогда из (Ш.З—12) полу-

чаем

ЁЖ.

(III. 3-15)

Таким

образом, скорость результирующего процесса целиком

определяется параметрами первой реакции и совершенно не зави-

сит от характеристик более быстрой стадии П. Ясно, что при этом

промежуточный продукт Pi практически не накапливается, так как

все, что образовалось на первой стадии процесса, сразу же, без

задержки переходит в конечный продукт.

Как

показано авторами (Чернавский, Иерусалимский,

1965),

аналогичные соображения справедливы и для более сложных це-

пей

реакций, в том числе для разветвленных ферментативных си-

стем. В каждом

случае

скорость образования конечного продукта

определяется лишь наиболее медленной стадией процесса и

совер«

шенно

не зависит от скоростей

всех

прочих реакций.

Подчеркнем еще раз, что, в отличие от различных «небиологи-

ческих»

многостадийных процессов, в живых системах принцип

минимума строго выполняется

даже

в том случае, когда скорости

отдельных реакций сравнимы

между

собой (например, отличаются

на

10—20%)-

Это замечательное свойство рассматриваемых си-

стем обусловлено характерными особенностями ферментативных

реакций:

слабой обратимостью и насыщаемостью. Как было пока-

зано

выше, благодаря свойству насыщаемости

даже

самое незна-

чительное превосходство в скорости одной из стадий полифермен-

тативной цепи приводит к такому накоплению продукта этой ста-

дии,

что скорость последующей более медленной реакции уже не

зависит от его концентрации. Иными словами, самый медленный

фермент работает в режиме насыщения субстратом

даже

в том

случае, если скорость образования этого

субстрата

ходе

предыду-

щих реакций лишь на

10—20%

выше скорости его утилизации.

Свойство обратимости также играет принципиальную роль, так как

именно

оно обеспечивает стационарное течение процесса.

Вместе с тем

следует

отметить, что принцип минимума, строго

выполняющийся

в условиях стационарного течения процесса, в пе-

208

реходных режимах может быть выражен менее четко. Как мы

увидим в дальнейшем (см. часть IV), при переходе из одного ста-

ционарного

режима в

другой

кинетика многостадийного процесса

сложным образом зависит от параметров промежуточных стадий.

При

этом временные характеристики отдельных реакций, «совме-

стно» влияющих на ход всего переходного процесса в целом, мо-

гут различаться весьма существенно (в несколько раз и

даже

на

порядки).

Принцип

минимума имеет очень важные биологические след-

ствия,

так как он позволяет существенно упростить и, следова-

тельно, сделать более надежной и адаптивной систему внутрикле-

точных метаболических процессов. Благодаря эффекту узкого

места значительно снижается число управляющих параметров,

действующих на систему одновременно. Так, ингибитор или акти-

ватор какой-либо стадии процесса совершенно не влияет на ре-

зультирующую

скорость до тех пор, пока соответствующая ему

реакция

не окажется самой медленной.

Применительно

к целой клетке, а также к сложным многокле-

точным организмам и их сообществам эффект узкого места выра-

жается широко известным принципом Либиха, согласно которому

скорость развития организма определяется лишь небольшим чис-

лом «находящихся в минимуме» внешних параметров или так на-

зываемыми «лимитирующими» факторами.

Так,

рядом авторов было показано, что скорость роста микро-

организмов в проточном культиваторе определяется концентра-

цией

питательного субстрата, причем зависимость удельной ско-

рости роста от концентрации лимитирующего субстрата выражает-

ся

формулой, аналогичной уравнению Михаэлиса — Ментен:

Umax

IS] (III.3—16)

K + [S] • '

где Ks — константа, численно равная концентрации субстрата, при

которой

скорость роста достигает половины максимальной. Вели-

чина

(Лтах

соответствует удельной скорости роста микроорганиз-

мов в экспоненциальной фазе (напомним, что в этой фазе общая

численность популяции нарастает по экспоненте с постоянным

множителем ц.

ах в показателе).

Совпадение выражения (III.3—16) с уравнением Михаэлиса

подтверждает представления о том, что рост живой клетки опре-

деляется конкретным ферментативным процессом, лимитирующим

скорость метаболизма. Отметим, что в процессе роста популяции

возможна смена узкого места метаболизма. В лаборатории

Н.

Д. Иерусалимского было обнаружено, что на рост пропиново-

кислых бактерий оказывают угнетающее действие продукты жиз-

недеятельности этих же бактерий •— пропионат и ацетат. При этом

полном соответствии с принципом узкого места два продукта

действуют

альтернативно: либо один из них тормозит рост, либо

другой, но не оба вместе. Как показано на рис.

III.4,

при постоян-

209

ной

концентрации пропионата (Pi) продукт (Р

) (ацетат)

никак

не

влияет на скорость роста бактерий, пока концентрация [Рг]

меньше некоторого порогового значения (горизонтальный участок

кривой).

При дальнейшем увеличении концентрации ацетата, кри-

вая

и[Рг] резко переходит в гиперболу

Пороговые значения концентрации ацетата (Ро) зависят от содер-

жания

первого продукта (пропионата).

Если

учесть,

что в соответствии с (III.3—16) величина цо в

последнем выражении является, в свою очередь, функцией кон-

центрации

субстрата S:

+[S]

то окончательно скорость роста бактерий можно представить как

{К

Рг

(Ш.З—17)

Эта формула аналогична выражению (II

1.2—15)

для скорости

ферментативной реакции в

случае

неконкурентного ингибирования.

Отмеченное совпадение не случайно •— его можно рассматривать

как

еще одно макропроявление эффекта узкого места, в соответ-

ствии с которым скорость роста

бактерий в данных условиях ре-

гулируется вполне определенной

«лимитирующей» ферментатив-

ной

реакцией. Изменение внеш-

них условий может сопровож-

даться переключением узких

мест.

В этой главе мы рассмотрели

результаты строгого теоретиче-

моль

Рис.

III.4.

Зависимость скорости

роста

Propioni

bacterium

sherma-

nii от концентрации ацетата рг при

постоянной

концентрации

пропио-

ната

рю =

2,4-10-

ского исследования ферментатив-

ной

системы, состоящей из

двух

последовательных реакций. В слу-

чае более сложных полифермен-

тативных цепей такое исследо-

вание

становится затруднительным. Анализ стационарной

кине-

тики

многостадийных процессов проводится с помощью определен-

ных упрощающих алгоритмов. Один из способов такого анализа

был предложен и использован в ряде конкретных случаев авто-

рами (King, Altman, 1956). Наиболее эффективный в настоящее

210