Попова Т.Н., Рахманова Т.И., Попов С.С. Медицинская энзимология

Подождите немного. Документ загружается.

форма). Отравления фосфорорганическими веществами и инсектицида-

ми сопровождаются выраженным снижением активности холинэстеразы.

Активность холинэстеразы наиболее резко снижается при тяжелых

хронических заболеваниях печени, особенно при циррозе. Значительное

снижение активности холинэстеразы наблюдается при распространен-

ных бластоматозных поражениях печени. В начальных стадиях обтура-

ционной желтухи снижение активности холинэстеразы встречается

очень редко.

Ярким проявлением снижения белково-синтетической функции

печени у больных вирусным гепатитом при развитии острой печеночной

недостаточности является резкое снижение активности холинэстеразы;

при этом степень снижения активности холинэстеразы обратно пропор-

циональна тяжести течения заболевания. Наиболее низкие показатели

отмечаются у больных за несколько дней до развития печеночной комы.

Однако длительный период полураспада сывороточной холинэстеразы

(7–10 сут.) снижает ее ценность как диагностического теста при пече-

ночной недостаточности.

При инфаркте миокарда резкое падение активности холинэстеразы

отмечают к концу первых суток заболевания; оно обусловлено шоком,

который приводит к тяжелому повреждению печени. В последнее время

исследование этого фермента широко используется для контроля за

применением релаксантов в хирургической практике. Курареподобные

вещества (дитилин, сукцинилхолин), применяемые в хирургии для рас-

слабления мышц, обычно быстро разрушаются, преимущественно холи-

нэстеразой сыворотки. Тяжелые последствия применения этих средств

(длительное апноэ, холинергический шок) возможны как при приобре-

тенном недостатке холинэстеразы (чаще при хронических заболеваниях

печени), так и при врожденном ферментном дефекте.

При нефротическом синдроме активность холинэстеразы повыша-

ется. Это связано с усилением синтеза альбуминов печенью из-за быст-

рой потери мелкодисперсной фракции белков с мочой. Повышение хо-

линэстеразы наблюдается также иногда при ожирении и экссудативной

энтеропатии.

Активность холинэстеразы незначительно возрастает при артери-

альной гипертонии, сахарном диабете, столбняке, хорее, маниакально-

депрессивном психозе, депрессивных неврозах, тревоге.

Показаниями к назначению анализа являются: диагностика воз-

можного отравления фосфорорганическими инсектицидами; оценка

функций печени при печеночной патологии (диагностика и мониторинг);

выявление атипичных форм фермента для оценки риска осложнений при

хирургических вмешательствах с применением миорелаксантов.

Повышение значений наблюдается при гиперлипопротеинемии

IV типа, нефротической и смешанной формами гломерулонефрита (по-

теря белка с мочой), ожирении, в том числе при сахарном диабете, психо-

зе, раке молочной железы.

Снижение значений наблюдается при печеночных патологиях:

цирроз, гепатит, метастатический рак печени, застойная печень при сер-

дечной недостаточности (низкая активность указывает на тяжелое тече-

ние болезни и является плохим прогностическим признаком), а также

при острой или хронической интоксикациях фосфорорганическими ин-

сектицидами (хлорофос, дихлофос), инфаркте миокарда, легочной эмбо-

лии, онкологических заболеваниях (раковая кахексия), на поздних сро-

ках беременности и при синдроме мальабсорбции. Применение некото-

рых лекарственных препаратов (например, оральные контрацептивы,

анаболические стероиды, глюкокортикоиды, циметидин, циклофосфа-

мид и др.), мышечные дистрофии сопровождаются снижением активно-

сти фермента.

Эластаза

Эластаза-1 (панкреатическая) является протеолитическим фер-

ментом, синтезируется в ацинарных клетках поджелудочной железы и

экскретируется в просвет двенадцатиперстной кишки вместе с другими

ферментами, в виде предшественника – проэластазы, которая активиру-

ется трипсином. Эластаза абсолютно специфична для поджелудочной

железы и не детектируется ни в каких других органах или тканях. В сы-

воротке крови человека содержатся высокоактивные ингибиторы эласта-

зы: альфа-1-антитрипсин и альфа-2-макроглобулин. Ингибиторы регу-

лируют уровень активности эластазы в соответствии с физиологически-

ми потребностями. В крови здоровых людей активность панкреатиче-

ской эластазы 1 почти не определяется или очень низкая (Норма: 0,1–

4,0 нг/мл). Сывороточная эластаза, вследствие воспалительных процес-

сов поджелудочной железы, попадает в общий кровоток через повреж-

денные клеточные мембраны. Подобно другим панкреатическим фер-

ментам (амилаза, липаза) показатель эластазы панкреатической начинает

увеличиваться в крови в острый период панкреатита, что позволяет по-

ставить диагноз этого заболевания. Концентрация фермента начинает

возрастать уже через 6 часов от начала заболевания, а через 48 часов

достигает максимальных показателей, свидетельствующих о развитии

острого панкреатита. Эластаза панкреатическая имеет более длительный

период полураспада, чем амилаза и липаза, поэтому ее концентрация ос-

тается повышенной в течение нескольких дней (в основном 3–5 дней, в

отдельных случаях до 10 дней). Этот тест назначается в комплексе с

другими тестами для дифференциальной диагностики, либо подтвер-

ждения диагноза «острый панкреатит».

Эластаза (в кале). Человеческая панкреатическая эластаза-1 не раз-

рушается при прохождении по кишечнику. Определение панкреатической

эластазы-1 в кале – новый неинвазивный тест для оценки экзокринной

функции поджелудочной железы. Скрининг эндокринной панкреатической

недостаточности показан, когда подозревают наличие хронического пан-

креатита или кистозного фиброза, а также при длительном мониторинге

уже выявленной недостаточности поджелудочной железы при хрониче-

ском панкреатите. Ориентируясь на уровень эластазы 1 в кале, можно бо-

лее точно назначать ферментные препараты и делать прогноз заболевания.

Для определения фермента кал собирают в течение 72 ч и анали-

зируют в тот же день: при необходимости он может быть заморожен

при –20 °С. На результаты определения панкреатической эластазы-1 в

кале не влияет проведение заместительной терапии препаратами фер-

ментов поджелудочной железы. Уровень эластазы-1 в стуле определя-

ется иммуноферментным методом с использованием моноклональных

антител (Elastase 1 stool test

, ScheBo Biotech, Германия) и в норме со-

ставляет не менее 200 мкг/г кала. Более низкие показатели свидетель-

ствуют о наличии экзокринной панкреатической недостаточности. Спе-

цифичность теста при исследовании кала составляет 94 %, чувстви-

тельность – 93 % – Stein J. et al., 1996]. Определение эластазы-1 в стуле

показано во всех случаях, когда имеется подозрение на экзокринную

недостаточность поджелудочной железы и обсуждается вопрос о при-

менении препаратов панкреатических ферментов, так как использова-

ние этого метода позволяет избежать их необоснованного назначения.

Снижение активности панкреатической эластазы-1 в кале выявляют у

больных с хроническим панкреатитом, раком поджелудочной железы,

сахарным диабетом типа 1 (менее 100 мкг/г у 3 % больных) и типа 2

(менее 100 мкг/г у 12 % больных), у детей с муковисцидозом, что отра-

жает недостаточность экзокринной функции поджелудочной железы в

данных группах пациентов.

ФЕРМЕНТЫ КАК АНАЛИТИЧЕСКИЕ РЕАГЕНТЫ

В КЛИНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

До недавнего времени ферменты служили лишь объектом исследо-

вания в клинической биохимии, и лишь сравнительно недавно они стали

использоваться, как аналитические реагенты, то есть как реактивы для ко-

личественного определения других веществ.

Преимущества ферментативных методов исследования: высокая

точность, специфичность (в силу специфичности используемых фермен-

тов), чувствительность. К этим «трем китам», на которых стоят фермента-

тивные методы, следует добавить простоту проведения анализа, значи-

тельное сокращение времени исследования и, часто, отсутствие необходи-

мости построения калибровочных графиков.

Использование ферментов как аналитических реагентов началось с так

называемого оптического теста Варбурга. Этот тест основан на том, что вос-

становленные формы никотинамидадениндинуклеотидов (HAДH и HAДФН)

имеют выраженный максимум поглощения в ультрафиолетовой области при

340нм, тогда как их окисленные формулы (HAД и HAДФ) этого максимума

не имеют. Это позволяет следить за ходом ферментативной реакции по уве-

личению или уменьшению величины оптической плотностью при 340 нм, т.е.

по увеличению или уменьшению содержания HAДH + Н

(или НAДФH + H

)

в анализируемом образце. Простейшим примером использования оптическо-

го теста Варбурга служит реакция, катализируемая ЛДГ:

ЛДГ

Пируват + НАДН. НЛактат + НАДН

¾¾¾¾¾¾®

На рисунке представлено изменение оптической плотности в ходе реакции:

Поскольку в процессе окисления пирувата количество НAДH снижает-

ся, величина оптической пдлотности падает и это падение продолжается до

тех пор, пока весь имеющийся в пробе пируват не вступит в реакцию. Этот

момент соответствует выходу кривой на графике на плато. Так как пируват и

НAДH вступают в реакцию в эквимолярных количествах, то убыль НAДH

равна количеству пирувата, содержащегося в анализируемом образце. Расчет

содержания пирувата может быть произведен на основании коэффициента

молярной экстинкции НАДН + H

, равного 6,22·10

/М по формуле

,(1)

=D××

где С – концентрация пирувата в мМ; ε – коэффициент молярной экстинк-

ции; V

– объем реакционной смеси; V

– объем исследуемого образца;

d – длина светового пути; ΔЕ – изменение величины оптической плотности.

Аналогичным образом может проводиться количественное опреде-

ление всех веществ, являющихся субстратами дегидрогеназ (малат, лактат,

сукцинат и т.д.). Построение калибровочных графиков или использование

калибраторов здесь не требуется, т.к. расчет ведется по коэффициенту мо-

лярной экстинкции. Однако следует заметить, что величина этого коэффи-

циента зависит от состава реакционной среды и в некоторых случаях мо-

жет незначительно отклоняться от величины 6,22 · 10

. Рассмотренная вы-

ше ЛДГ-реакция служит в качестве индикаторной при определении актив-

ности АлАТ. В этой сопряженной системе реакции протекают по схеме

АлАТ

ЛДГ

аланин +-кетоглутаратпируват -глутамат

пируват + НАДН. НлактатНАД

aaa

¾¾¾¾¾¾®+

Реакция сопровождается снижением величины оптической плотно-

сти при 340 нм, скорость которого пропорциональна активности АлАТ.

Аналогичным образом может быть определена активность АсАТ. Но ин-

дикаторным ферментом в этом случае будет малатдегидрогеназа. Расчет

активности ферментов, определение которых проводится с помощью оп-

тического теста Варбурга, также может быть проведен на основании коэф-

фициента молярной экстинкции по формуле

10,

E мкМ

минл

××=

D××

где ΔЕ – изменение оптической плотности; Δt – время измерения (мин); ε –

коэффициент молярной экстинкции (6,22 · 10

/М); d – длина светового пу-

ти, см; V

– объем реакционной смеси; V

– объем анализируемого образца.

На использовании в качестве индикаторного фермента глюкозо-6-

фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) основан самый точный метод из всех

существующих методов определения глюкозы. Здесь реакция идет по

схеме:

гексокиназа

Г6ФДГ

ГлюкозаАТФглюкозо-6-фосфат + АТФ

Глюкозо-6-фосфат + НАДФ 6-фосфоглюконатНАДФ

Н. Н

+¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾®

¾¾¾¾¾¾¾®+

Глюкоза при участии гексокиназы фосфорилируется в глюкозо-6-

фосфат, который с помощью глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы окисляется

в 6-фосфоглюконовую кислоту. Эта реакция сопровождается накоплением

НАДФН и, следовательно, возрастанием оптической плотности при

340 нм. Расчет содержания глюкозы в анализируемом образце может быть

произведен по формуле (1).

Другой подход к определению глюкозы основан на использовании

сопряженной системы глюкозооксидаза + пероксидаза и более широко из-

вестен. При участии глюкозооксидазы глюкоза окисляется кислородом

воздуха с образованием перекиси водорода, количество которой определя-

ется по ее способности в присутствии пероксидазы окислять диамины с

образованием окрашенных продуктов:

глюкозооксидаза

2222

пероксидаза

222

ГлюкозаО HO глюконоваякислота HO

красительокрашенныйпродукт +HO

++¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾®+

+¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾®

В качестве красителей (индикаторов) для пероксидазной реакции

предложена целая группа веществ: о-толидин, о-дианизидин, фенол+ 4-

амино-антипирин и др.

Считают, что реакция с 4-амино-антипирином более предпочтитель-

на, т.к. развивающаяся окраска более стабильна, чем при использовании

других веществ.

Эта же пероксидазная реакция с участием 4-амино-антипирина,

предложенная Триндером, может быть использована для количественного

определения холестерина и триглицеридов.

При определении холестерина его эфиры гидролизуются холестеро-

лэстеразой до свободных жирных кислот и холестерина, который под воз-

действием холестеролоксидазы окисляется кислородом воздуха до D

холестерола. Образующаяся при этом перекись водорода в присутствии

пероксидазы окисляет вещества-индикаторы с образованием окрашенных

соединений, интенсивность окраски которых пропорциональна содержа-

нию холестерина в исследуемом образце:

холестеролэстераза

холестеролоксидазы

222

пероксидаза

Эфирыхолестеринахолестерин +R-COOH

Холестерин +O-холестенон +HO

2HO4-аминоантипирин + фенолокрашенныйпродукт 4H

¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾®

¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾®D

+¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾®+

Описанный метод определения холестерина является самым точным

из ныне существующих. В реакции Либермана–Бурхарда, рутинном мето-

де определения холестерина участвуют и другие стерины, что приводит к

завышенным результатам. К другим преимуществам ферментативного ме-

тода следует отнести отсутствие влияния примесей билирубина и гемогло-

бина, необходимости проводить длительный гидролиз эфиров и экстрак-

цию холестерина, отсутствие агрессивных реагентов.

Еще более сложная ферментная система может быть использована

для определения триглицеридов. Триглицериды расщепляются липазой до

жирных кислот и глицерина, который при участии глицерокиназы и АТФ

фосфорилируется с образованием глицерол-3-фосфата. Глицерол-3-фосфат

в присутствии глицерофосфатоксидазы окисляется кислородом воздуха с

образованием фосфодиоксиацетона и перекиси кислорода, которая в свою

очередь окисляет краситель с образованием окрашенного комплекса, ин-

тенсивность окраски которого пропорциональна концентрации триглице-

ридов в исследуемом образце.

липаза

глицерокиназа

глицеролфосфат

222

оксидаза

Триглицерид 3HO глицерин +3R-COOH

Глицерин + АТФглицерол-3фосфат + АТФ

Глицерол-3фосфат + O фосфодиоксиацетон H

HO4-аминоантип

+¾¾¾¾¾¾¾®

¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾®

¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾®+

пероксидаза

ирин +4-хлорфенол

окрашенныйкомплекс 2HO+HCl

¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾®

¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾®+

Этот метод определения триглицеридов наиболее специфичен, ис-

ключительно точен и чрезвычайно прост в исполнении.

В настоящее время разработана целая группа ферментативных мето-

дов определения мочевой кислоты. Первым этапом этих методов является

расщепление мочевой кислоты уриказой до аллантоина, углекислоты и пе-

роксида водорода:

уриказа

22222

Мочеваякислота +2HO+O аллантоин +COHO

¾¾¾¾¾¾¾®+

Образовавшийся пероксид водорода может быть определен разными спо-

собами:

- по реакции с 4-аминоантипирином или другим аналогичным красителем;

- превращением метанола с участием каталазы в формальдегид, ко-

торый определяется специальными методами;

- окислением перекисью этанола в ацетатальдегид, который затем

восстанавливается НАДH (оптический тест Варбурга).

Следует отметить высокую специфичность всех ферментативных ме-

тодов определения мочевой кислоты по сравнению с рутинными фосфор-

новольфрамовыми методами т.к. кроме мочевой кислоты фосфорновольф-

рамовую кислоту восстанавливает аскорбиновая кислота, тирозин, трип-

тофан, цистин, цистеин и др.

Еще большее количество методов предложено для ферментативного

определения мочевины. Первым этапом всех этих методов является рас-

щепление мочевины уреазой до аммиака и углекислоты:

уреаза

242

Мочевина HO2NHCO

+¾¾¾¾¾¾¾®+

Определение ионов аммония может быть осуществлено разными способами:

- классической Бертолетовой реакцией;

- модифицированной Бертолетовой реакцией с салицилатом натрия;

- с помощью оптического теста Варбурга.

В последнем случае в качестве индикаторной служит реакция

глутаматдегидрогеназа

NH-

кетоглутарат + НАДНглутаматНАД 2HO

+¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾®+

Все эти методы высокоспецифичны, т. к. для уреазы мочевина явля-

ется единственным физиологическим субстратом, но наиболее точным яв-

ляется метод с оптическим тестом Варбурга.

В настоящее время разрабатывается новое направление в использо-

вании ферментов: ферментативных методах определения электролитов

(К

, Nа

, Сl

). Эти методы основаны на способности электролитов оказы-

вать активирующее влияние на активность некоторых ферментов.

НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ЭНЗИМОТЕРАПИИ

Для практического здравоохранения особый интерес представляет

использование очищенных препаратов ферментов, коферментов и регули-

рующих их активность ингибиторов и активаторов в качестве терапевтиче-

ских средств. Среди ферментов для клиники наибольшее значение имеют

гидролитические, особенно белокрасщепляющие – протеолитические эн-

зимы. Последние, составляя систему протеолиза, играют ключевую роль в

важнейших биологических процессах: обмене белков, защитных реакциях

организма (свертывание крови, фибринолиз), иммунологических реакциях,

регуляции сосудистого тонуса, дифференциации, метаболизме соедини-

тельной ткани и др. Эти функции протеолитических ферментов реализу-

ются с помощью ограниченного протеолиза без энергетических затрат, ха-

рактерной чертой которого являются быстрота и высокая экономичность.

Так, для лечения ряда болезней пищеварительного тракта применяют

некоторые протеиназы: пепсин, трипсин, химотрипсин и их смеси (абомин,

химопсин). Помимо протеиназ, ряд других ферментов, в частности РНКаза,

ДНКаза, гиалуронидаза, коллагеназы, эластазы, отдельно или в смеси с про-

теиназами используются при ожогах, для обработки ран, воспалительных

очагов, устранения отеков, гематом, келоидных рубцов, кавернозных процес-

сов при туберкулезе легких и др. Ферменты применяются также для лечения

сердечно-сосудистых заболеваний, растворения сгустков крови. В нашей

стране разработан первый в мире препарат иммобилизованной стрептокина-

зы, рекомендованный для лечения инфаркта миокарда. Калликреины – фер-

менты кининовой системы используются для снижения кровяного давления.

Важной и многообещающей областью энзимотерапии является при-

менение ингибиторов ферментов. Так, естественные ингибиторы протеи-

наз (α

-трипсин, α

-химотрипсин, α-макроглобулин) нашли применение в

терапии острых панкреатитов, артритов, аллергических заболеваний, при

которых отмечается активация протеолиза и фибринолиза, сопровождаю-

щаяся образованием вазоактивных кининов.

В последнее время получило признание применение в онкологической

клинике ферментов бактериальной природы в качестве лекарственных

средств. Широко используется L-аспарагиназа (выпускается в промышленных

количествах и L-глутамин(аспарагин)аза для лечения острых и хронических

форм лейкозов и лимфогранулематозов. Более десятка описанных в литерату-

ре бактериальных ферментов испытаны в основном на животных с перевив-

ными опухолями или на раковых клетках опухолей человека и животных, вы-

ращенных в культуре ткани. Основными постулатами применения ферментов

в онкологии являются различия в метаболизме клеток опухолей по сравнению

с обменом в нормальной, здоровой, клетке. В частности, современные страте-

гия и тактика энзимотерапии опухолевых поражений учитывают разную чув-

ствительность нормальных и опухолевых клеток к недостатку (дефициту) не-

заменимых (так называемых эссенциальных) факторов роста. К таким рост-

стимулирующим факторам относятся не только пищевые факторы (витамины,

незаменимые аминокислоты, макро- и микроэлементы), но и ряд так называе-

мых заменимых веществ, включая заменимые аминокислоты, к недостатку ко-

торых опухолевая клетка оказывается в силу особенностей ее обмена более чув-

ствительной, чем нормальная. Лечебный эффект, например, L-аспарагиназы и

L-глутамин(аспарагин)азы при лейкозах, вероятнее всего, объясняется необра-

тимым распадом как глутамина, так и аспарагина. Оказалось, что опухолевые

клетки для своего роста и размножения нуждаются в аминокислотах из орга-

низма, поскольку сами лишены способности синтезировать амиды аминокис-

лот, в то время как нормальные клетки наделены этой способностью. Был сде-

лан вывод о том, что амидный азот глутамина и аспарагина выполняет в клет-

ках ряд уникальных функций, которые лучше выяснены для глутамина. В ча-

стности, амидный азот глутамина оказался абсолютно необходимым и незаме-

нимым другими аминокислотами источником атома азота минимум в 10 реак-

циях синтеза, например, пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, соответ-

ственно ДНК и РНК, АТФ, гексозаминов, гистидина и др. Таким образом, не

лишена основания гипотеза, что любой фермент или агент, катализирующий

необратимое расщепление незаменимого для опухолевой клетки пищевого

фактора (включая аминокислоты), может в принципе быть применен в энзи-

мотерапии опухолей, если будут устранены ограничения, связанные с белко-

вой природой фермента. В оценке эффективности ферментов в эксперимен-

тальной и клинической онкологии имеется немало противоречий и очень мно-

го пробелов. Положительные результаты, отмеченные в ряде случаев, вселяют

надежду, что приготовление стандартных ферментных препаратов (включая

создание иммобилизованных форм) в промышленных масштабах и их разум-

ное применение в клинике, организованное на строгой научной основе, несо-

мненно, дадут в руки врачей еще одно ценное оружие в борьбе с опухолевыми

заболеваниями человека.

В настоящее время активно разрабатывается системная энзимотерапия

(СЭТ) – это лечение с помощью целенаправленно составленных смесей гид-

ролитических энзимов, лечебная эффективность которых основана на ком-

плексном воздействии на ключевые процессы, происходящие в организме.

Препаратами системной энзимотерапии являются, напрмер, вобэн-

зим, флогэнзим и вобэ-мугос Е (MUCOS Pharma GmbH & Co., Германия),

представляющие собой комбинацию натуральных высокоактивных энзи-

мов растительного и животного происхождения.

Клинические испытания показали, что вобэнзим, флогэнзим и вобэ-

мугос Е удовлетворяют всеобщему терапевтическому принципу: надеж-

ность и высокая эффективность при общей хорошей переносимости, что и

определяет широкий спектр их клинического использования. Действуя

системно, энзимы оказывают разнообразные эффекты, реализуя свое влия-

ние через противовоспалительное, иммуномодулирующее, антиагрегатное,