Марголин В.И. Основы нанотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

скопов был разработан в конце 19 века и представлял собой вращающийся диск с

мельчайшими отверстиями, позже названный по имени своего изобретателя Нип-

ков диск. Принцип изобретения состоял в возможности света, проходя через мель-

чайшие отверстия в диске и увеличительную линзу, проникать в глубину ткани и

освещать фрагмент клетки на удалении от

поверхности. При быстром вращении

диска фрагменты складывались в общую картинку. За счет удаления или прибли-

жения конструкции к объекту варьировалась и глубина оптического среза иссле-

дуемой ткани.

Назначением конфокального микроскопа является получение увеличенных

изображений микрогеометрии поверхности и внутренней микроструктуры непро-

зрачных и полупрозрачных объектов в биологии, полупроводниковой микроэлек-

тронике, интегральной

оптике, геологии, химии и т.д. В 1955 году Марвин Мин-

ский создал первую опытную рабочую модель подобного микроскопа, кроме пере-

работанного нипков диска в схеме прохождения света были применены две опти-

ческие линзы, связанные и, одновременно, взаимодействующие друг с другом, что

и легло в название микроскопа (конфокальный т.е. основанный на

взаимодействии

оптик).

Схема мик-

роскопа приве-

дена на рис.

9.6.2., на кото-

ром 1 - источник

излучения; 2,6 -

игольчатые диа-

фрагмы; 3,5 -

объективы; 4 -

сканирующий

координатный

стол; 7 - приемник излучения.

Рис. 9.6.2. Принципиальная схема хода лучей в микроскопе Мин-

ского.

В микроскопе Минского были частично устранены причины, затрудняющие

просматривать детали объёмного препарата на некоторой его глубине из-за рассея-

ния и преломления светового потока, на оптически неоднородных

фрагментах. По-

высить контрастность наблюдаемого участка удалось благодаря фокусировки луча

в глубине препарата и использованию специальной игольчатой диафрагмы распо-

ложенной вблизи плоскости регистрации (pinhole). К достоинствам прибора следу-

ет отнести повышение качества сигнала за счёт снижения уровня рассеянного све-

та; увеличение эффективного разрешения; улучшение соотношения сигнал/шум;

возможность исследовать объёмные препараты

и объекты, рассевающие свет; воз-

можность сканирования в плоскости ХУ больших объектов; возможность сканиро-

вания по оси Z; выбор увеличения электронным способом; возможность количест-

венного исследования оптических свойств препаратов; возможность применения

различных способов микроскопирования: тёмное поле, фазовый контраст, интер-

ференционный контраст; возможность использования простых объективов из-за

фокусировки луча в точку. Весьма впечатляющий перечень преимуществ по срав-

нению с обычной оптической микроскопией. Эти возможности конфокального

микроскопа обеспечивали послойное наблюдение фрагментов ткани с последую-

щей трёхмерной реконструкцией изображения.

Поскольку наличие диафрагмы является основным отличием конфокального

микроскопа от обычного, то вполне очевидно, что ее параметры являются опреде-

ляющими. Основной из параметров - это размер диафрагмы в фокальной плоскости

облучающей и собирающей линз. Предполагается, что источник излучения являет-

ся

точечным, что позволяет получить функцию размытия точки (PSF) для обычно-

го и конфокального микроскопа. Полученные PSF описывают свойства объектив-

ной линзы, а изображение диафрагмы в плоскости объекта определяет, свет из ка-

ких областей регистрируется фотодетектором. Очевидно, однако, что уменьшение

размера диафрагмы приводит к уменьшению количества проходящего света, уве-

личивает уровень шума и, в

конечном итоге, может свести на нет все достигнутые

преимущества по контрастности. Таким образом, стоит вопрос об оптимальном

выборе размера диафрагмы и разумном компромиссе.

Диафрагма с отверстием меньше размера пятна Эйри просто приводит к потере

интенсивности и никак не влияет на разрешение. Диафрагма размером в одно пят-

но Эйри позволяет по

максимуму использовать разрешающую способность объек-

тивной линзы. Однако размер диафрагмы примерно в 3-5 раза больше пятна Эйри

представляется наиболее подходящим компромиссом. Следует понимать, что об-

суждаемый здесь размер имеет смысл размера изображения в плоскости объекта, а

поэтому реальный размер отверстия в диафрагме зависит от увеличения линзы. В

частности, при использовании 100-кратной линзы

диафрагма с отверстием 1 мм

будет спроецирована в плоскость объекта в круг радиусом 10 мкм.

В первом микроскопе результаты исследования фиксировались на фотопленку.

С развитием телевидения и появлением телевизионных мониторов в середине 60-х

годов прошлого века прошла первая волна конструирования конфокальных микро-

скопов и бум описательных работ по строению и функционированию тканей.

К со-

жалению, технические возможности того времени не позволяли бороться с поме-

хами изображения, происходящими из-за малых скоростей сканирования, ручной

настройки и слабости световых источников. Основную же проблему составляли

сложности регистрирования полученных результатов на кинопленку. Только с по-

явлением видеомагнитофонов в 80-х и компьютеров, способных обрабатывать изо-

бражения, в начале

90-х годов появилась реальная возможность создать и эффек-

тивно применить те современные микроскопы, используемые в наше время.

Принцип работы конфокального лазерного микроскопа основан на непосредст-

венном сканировании исследуемого объекта субмикронным лазерным зондом, ко-

торый формируется при помощи уменьшающей оптической системы. Сканирова-

ние производится с помощью двухкоординатного зеркального сканатора. Отличи-

тельной особенностью конфокального режима является использование точечного

детектора, размер которого определяется конфокальной диафрагмой, расположен-

ной в плоскости, оптически

сопряженной с фокальной плоскостью микрообъектива

(объекта). Вследствие этого на фотодетектор попадает только световое излучение

от точек объекта, а излучение от точек, лежащих вне фокальной плоскости, прак-

тически не дает вклада в полезный сигнал.

Теоретические основы метода были разработаны в 1977 году, а первые уста-

новки были сконструированы спустя еще два года

. Условие конфокальности, сов-

падение фокусов, состоит в том, чтобы диафрагма детектора находилась в таком

месте, что если ее спроецировать на объект, то ее изображение точно совпало бы с

фокусом освещающего объект света. Если тот же объектив используется и для ос-

вещения объекта, и для детекции изображения, то это условие может

быть выпол-

нено.

Конфокальная микроскопия и созданные на ее основе конфокальные лазерные

сканирующие микроскопы (КЛСМ) - принципиально новое направление в световой

микроскопии. С возникновением методов конфокальной сканирующей микроско-

пии появилась возможность путем послойного сканирования просматривать детали

объемного образца на некоторой его глубине, что не позволяет делать обычный,

даже самый совершенный микроскоп из

-за рассеяния и преломления света на оп-

тически неоднородных фрагментах.

Конфокальный микроскоп практически не отличается от флуоресцентного мик-

роскопа. Если в объективе обычного микроскопа изображение можно увидеть про-

сто глазом, то в конфокальном микроскопе изображение формируется только на

экране компьютера. Область фокусировки в конфокальном микроскопе примерно

на порядок меньше, за

счет того, что диафрагма на приемнике имеет очень малень-

кую апертуру.

Существенным моментом является также как можно меньший диаметр диа-

фрагмы детектора. Это достижимо при использовании достаточно мощных источ-

ников освещения, какими являются лазеры. Сочетание этих особенностей позволя-

ет значительно увеличить разрешение (до 100-200 нм) и контрастность по сравне-

нию с обычной

световой микроскопией. Кроме того, в случае флуоресцентной

КЛСМ, лишь только та флуоресценция, которая возникает в той части образца, на

которую сфокусирован объектив, достигает детектора и регистрируется. В обыч-

ной же световой люминесцентной микроскопии детектируется флуоресценция из

всей освещенной части образца, хотя те части, которые находятся вне фокуса, вид-

ны неконтрастно.

Благодаря этим особенностям КЛСМ появляется возможность

послойно просматривать различные объекты и количественно характеризовать их

флуоресцентные изображения. Для этого необходим прецизионно перемещаемый в

трех направлениях, или сканируемый предметный столик.

Предметный столик передвигается в плоскости латерально и по вертикали. Ка-

ждое полученное изображение запоминается компьютером, по этим изображениям

компьютер воссоздает изображение каждого оптического среза, а также, при необ

ходимости, любого вертикального среза, что совершенно невозможно для обычной

световой микроскопии. Количественные характеристики можно получать опреде-

ляя интенсивность флуоресценции с помощью ФЭУ из выделенных окон на изо-

бражении. Например, можно выделить квадратное окно размером 5х5 мкм в инте-

ресующей части получаемого флуоресцентного изображения и определить интен-

сивность флуоресценции, испускаемой клеткой

только из этого окна.

Разрешающая способность определяет пределы различимости деталей изобра-

жения и по этому является одной из главных характеристик любого микроскопа. В

обычном микроскопе и КЛСМ механизмы формирования изображения различны, и

это различие косвенно находит выражение в значение разрешающей способности.

Оценивается разрешающая способность по характеру дифракционных явлений,

возникающих при микроскопировании

близкорасположенных точечных светящих-

ся объектов. Критерии её оценки основаны на анализе функции рассеивания точки.

Для качественного описания разрешения оптических приборов используются раз-

личные критерии - Рэлея, Спарроу, Дау, Шустера и т.д.. Наиболее распространены

в применении к микроскопии критерии Рэлея и Спарроу.

Критерий Рэлея формулируется следующим образом: две точки различимы ес-

ли в картине распределения интенсивности средние точки между ними имеется

провал на 26,5 % от максимального значения. Он предполагает, что разрешение

микроскопа определяется расстоянием между двумя некогерентными источниками

света, при котором максимум отклика на один источник освещения совпадает с

первым нулём отклика на другой. Разрешение по Рэлею численно равно радиусу

диска Эри и

для обычного микроскопа равно:

61,0

)R(d

где d

(R)- разрешение по Рэлею для стандартного микроскопа, λ - длина волны

источника в нм, NA - числовая апертура. Использование в КЛСМ точечной диа-

фрагмы размеры которой согласованы с увеличением микроскопа и длиной волны,

даёт возможность повысить разрешение немногим более чем на 10%. Очевидно,

что разрешение КЛСМ и соответственно возможности анализа тонких структур

могут превышать аналогичные

возможности обычного микроскопа, не более чем

на 40% в условиях сканирования препарата тонким лучом.

Разрешающая способность КЛСМ от способа микроскопирования и освещения.

Разрешение КЛСМ определяется как оптической системой, так и электронным

трактом обработки информации. По этому в конструкции КЛСМ, его схемах долж-

ны быть согласованы такие параметры, как разрешение оптической системы, шаг

сканирования, характеристики детектора, а так же выбранные оптимальные алго-

ритмы обработки и соответствующее программное обеспечение.

Главная особенная КЛСМ по сравнению с обычным микроскопом состоит в

том, что при дефокусировке

препарата изображения его фрагментов, лежащие вы-

ше и ниже фокальной плоскости вдоль оси Z, не попадают на детектор благодаря

применению игольчатой диафрагмы. В обычном световом микроскопе при смеще-

нии плоскости препарата относительно фокальной плоскости препарата относи-

тельно фокальной плоскости детали изображения теряют резкость и яркость,

вследствие чего изображение становиться неясным и

размытым. В конфокальном

лазерном микроскопе они исчезают, поэтому параметры игольчатой дипфрагмы

являются определяющими. Выбор оптимального диаметра игольчатой диафрагмы

важен для получения требуемых характеристик прибора. Реально размер игольча-

той диафрагмы конечен, и от него зависят поперечное разрешение прибора, яр-

кость освещённых элементов препарата, смещённых относительно фокальной

плоскости по оси Z, и глубина резкости

При малых размерах диаметра игольчатой диафрагмы световой поток стано-

вится малым, что уменьшает отношение сигнал/шум и снижает контрастность. При

больших диаметрах эффективность игольчатой диафрагмы снижается за счёт

уменьшения апертуры. Как правило, в современных конфокальных микроскопах

игольчатые диафрагмы размещены на вращающемся барабане и имеют размеры 2-

6-8-10-20-40-100 мкм. Выбор размера отверстия определяется

скоростью сканиро-

вания, структурой объекта, апертурой и увеличением объектива, параметрами ФЭУ

и рядом других факторов. Набор диафрагм установлен в поворотном диске. Выбор

нужной диафрагмы определяется автоматически с помощью шагового двигателя.

Поворотный диск устанавливается в измерительном модуле с возможностью юсти-

ровки по оси прибора и перпендикулярно ей. Ориентировочно можно считать, что

в КЛСМ глубина резкости приблизительно в 1.4 - 1.5 раза меньше, чем у обычного

микроскопа, а латеральное разрешение в том же соотношении выше. Оптимальное

значение диафрагмы можно приблизительно определить по формуле:

M25,0

opt

где М - полное увеличение микроскопа. Если глубина резкости лежит в преде-

лах величин от 0.162 до 0.414 мкм в зависимости от размеров отверстия игольчатой

диафрагмы и апертуры объектива, то в этом диапазоне удаётся получить послойное

изображение объектов. Шаг по высоте может составить 50 мкм и более.

Глава IX. Раздел 7 Рамановская микроскопия

Глава X. Слабые и сверхслабые воздействия в нанотехнологии.

Раздел 1 Проблема "КТ"

Глава X. Раздел 2 Воздействие слабых импульсных магнитных полей

Глава X. Раздел 3 Резонансы и резонансное взаимодействие

Глава X. Раздел 4. Эффекты дальнодействия