Каминская Э.А. Общая генетика

Подождите немного. Документ загружается.

Транскрипция. Трансляция

Проблема биологического кодирования была решена в удиви-

тельно короткий срок — за 10 лет был решен вопрос относительно

того, как последовательность нуклеотидов определяет последователь-

ность аминокислот в белковых молекулах. В связи с этим необходимо

было выяснить механизм дешифровки записанной в ДНК информа-

ции, т. е. перевода ее в аминокислотную последовательность.

Схема синтеза белка первоначально представлялась в следующем

виде: ген—>-рибосома—>-белок. Но так как рибосомы эукариотических

клеток не могут непосредственно контактировать с молекулой ДНК

ядра, то очевидно, что сама ДНК не может участвовать в сборке

белковых молекул.

В 1952 г. И. Дауне, а через год Дж. Уотсон и Ф. Крик высказали

идею о том, что синтез белка в клетке осуществляется в две стадии.

Вначале в ядре синтезируются молекулы РНК. Матрицей для них

служат гены. Причем последовательность нуклеотидов с закодиро-

ванной в ней информа1Тией о последовательности аминокислот точно

переписывается (транскрибируется) в молекулы РНК. Затем моле-

кулы РНК перемещаются в цитоплазму, и здесь их нуклеотидная

последовательность переводится (транслируется) в полипептидную

цепь. Было высказано предположение, что роль переносчика наслед-

ственной информации в данном случае выполняет р-РНК и что она

служит матрицей в синтезе белка. Впоследствии было установлено,

что рибосомы действительно являются местом синтеза белка.

В 1961 г. Е. Гейл и П. Замечник не только экспериментально дока-

зали, что белок синтезируется на рибосомах, но и проследили с по-

мощью радиоактивного лейцина путь этого синтеза in vitro в экстрак-

те печеночных клеток и in vivo на крысах. Сначала они регистри-

ровали лейцин лишь в рибосомах, но затем — ив растворимом бел-

ке. Причем было обнаружено, что количество меченого лейцина

в рибосомах при этом убывает.

Вскоре были получены доказательства, что р-РНК не кодирует

последовательности аминокислот и, следовательно, рибосомы не мо-

гут служить матрицей для синтеза белка.

В 1955 г. Крик выдвинул так называемую адапторную гипотезу,

предположив, что существуют низкомолекулярные соединения нук-

леиновой природы, способные с помощью специфического фермента

присоединять к себе ту или иную аминокислоту, находить на РНК-

матрице соответствующее ей место и вставлять ее в растущую бел-

ковую цепь. По его мнению, молекулы-адапторы должны содержать,

помимо аминокислоты, антикодон, комплементарный кодону РНК-

Это предположение подтвердилось в 1957 г., когда М. Хоглэнд открыл

новый класс РНК—транспортные РНК (т-РНК), а в 1965 г. Р. Холли

составил полную нуклеотидную последовательность сначала алани-

новой т-РНК, затем всех других типов т-РНК.

В 1958 г. Крик сформулировал основной постулат молекулярной

биологии, названный впоследствии центральной догмой молекуляр-

ной биологии. Согласно этой догме, путь переноса наследственной

информации выглядит следующим образом:

(ДНК ^РНК сделок

В 1960 г. Ф. Жакоб и Ж- Моно высказали предположение, что

гипотеза «один ген — одна рибосома — один белок» неверна. Они

считали, что р-РНК не может служить матрицей для сборки амино-

кислот и что, по-видимому, существует еще один тип РНК — матрич-

ная, или информационная, РНК (м-РНК, или и-РНК), в которую

транскрибируется ген, после чего и-РНК соединяется с рибосомами,

содержащими свою собственную р-РНК. Эта система, как оказалось,

способна синтезировать полипептид. Таким образом, и-РНК, по мне-

нию авторов, служит посредником между ДНК и белоксинтезирую-

щей системой. Для того чтобы это доказать, нужно было найти в клет-

ке специфический фермент, участвующий в синтезе и-РНК, поскольку

любой матричный синтез катализируется соответствующим фермен-

том. Так, механизм репликации стал ясен после открытия ДНК-

полимеразы. Открытие же в 1961 г. ДНК-зависимой РНК-полиме-

разы позволило вскрыть механизм транскрипции РНК на матрице-

ДНК. Этот фермент в присутствии ДНК и четырех типов азотистых

оснований РНК (А, Г, Ц, У) катализирует синтез РНК комплемен-

тарной по составу оснований определенному участку ДНК. (ДНК-

зависимая РНК-полимераза обнаружена во всех клетках как прока-

риот, так и эукариот.) После этого открытия формула центральной

догмы молекулярной биологии несколько видоизменилась:

трансляции

дупликация

Транскрипция — это процесс матричного синтеза, заключаю-

щийся в переносе наследственной информации с двухцепочечной

молекулы ДНК на одноцепочечную молекулу РНК. Она так же, как

и репликация, является функцией ДНК, происходит в клетке перед

ее делением и по времени совпадает с максимальной деспирализацией

хромосомы в интерфазе. У эукариот частичная транскрипция реги-

стрируется и в самом начале митотического цикла — в период ран-

ней профазы. В то же время транскрипция существенно отличается

от репликации прежде всего тем, что в ней участвуют и копируются

лишь отдельные гены или их группы, тогда как в репликации задей-

ствована вся ДНК и поэтому дочерние молекулы полностью копи-

руют материнскую.

Транскрипция представляет собой ферментативный процесс.

Однако у про- и эукариот она контролируется разными ферментами.

У кишечной палочки ДНК-зависимая РНК-полимераза состоит

из четырех полипептидных цепей: из двух одинаковых а-цепей и двух

разных — р и (Зь Такая РНК-полимераза носит название кор-фер-

мента. Он катализирует рост цепи РНК, однако не способен «узна-

вать» место начала транскрипции и выбирать цепь ДНК, с которой

считывается информация. Это обеспечивается холоферментом,

т. е. РНК-полимеразой, содержащей, кроме указанных, еще субъеди-

ницу о. Последняя диссоциирует после начала синтеза РНК, но

транскрипция продолжается благодаря присоединению к кор-фер-

менту продукта гена nus А — белка, обеспечивающего «узнавание»

терминаторного участка. Окончание транскрипции и освобождение

синтезированной цепи РНК осуществляется р-фактором — белком,

входящим в состав полимеразы.

У эукариот имеются три типа РНК-полимераз: РНК-полимераза I

(отвечает за синтез р-РНК), РНК-полимераза II (участвует в син-

тезе и-РНК) и РНК-полимераза III (контролирует синтез т-РНК и

р-РНК).

Синтез РНК-полимераз у про- и эукариот контролируется хромо-

сомными генами.

Транскрипция никогда не начинается и не заканчивается в лю-

бом месте ДНК-матрицы. На матрице имеются специфические старто-

вые точки, к которым молекулы фермента присоединяются, и специ-

фические конечные участки, где они освобождаются. РНК-поли-

мераза выбирает также цепь ДНК, которую она должна копировать.

Однако механизм этого процесса пока не известен.

Область, к которой присоединяется РНК-полимераза, назы-

вается промотором. У Е. coli промотором служит участок ДНК раз-

мером около 40 пар азотистых оснований, богатый парами А — Т.

В нем различают стартовую точку, обычно представленную пурином,

причем чаще аденином, чем гуанином. Вправо от стартовой точки

нуклеотиды обозначаются знаком плюс, влево — знаком минус, так

что вся область промотора занимает участок приблизительно от

— 20

до +20 пар оснований. Со стартовой точки начинается синтез

информационной РНК. Влево от стартовой точки располагается

область размером 6—9 пар нуклеотидов ТАТААТ (последователь-

ность, блок, или ящик, Прибнова), включающая в основном пары

А — Т. Причем первой парой нуклеотидов обязательно является

А — Т, так как она, будучи соединена двумя водородными связями,

легче разъединяется на отдельные нити. Последовательность Прибно-

ва служит для ориентировки синтеза РНК в направлении б'-^З'.

На расстоянии 35 нуклеотидов влево от стартовой точки распола-

гается район распознавания, к которому присоединяется а-фактор

РНК-полимеразы.

У эукариот стартовой точкой является аденин, по обе стороны

от которого располагаются пиримидины. Влево от нее на расстоянии

19—27 пар нуклеотидов располагается 7 пар оснований ТАТАА,

носящих название TATA или последовательность (блок, ящик) Хог-

неса. Она аналогична последовательности Прибнова, но более уда-

лена от стартовой точки по сравнению с таковой у прокариот. После-

довательность Хогнеса контролирует выбор стартового нуклеотида.

Связывание же РНК-полимеразы происходит в области ЦААТЦТ,

Рис. 46. Схема образования и-РНК (по Г. Стенту и Р. Кэлиндару,

1981).

расположенной еще левее, в районе от — 70 до — 80 пар. Эта область

называется последовательностью ЦААТ.

Для того чтобы фермент узнавал стартовые точки, должна сохра-

няться двухспиральная структура ДНК. Если же цепь ДНК одиноч-

ная, РНК-полимераза может ошибаться в выборе стартовой точки

и использовать для связывания и начала транскрипции любой ее

участок. После выбора стартовой точки на двойной спирали ДНК

РНК-полимераза разъединяет ее на отдельные нити, присоединяется

к одной из них и использует ее в качестве матрицы для транскрипции.

Матрицей может служить любая цепь ДНК, которая в данном случае

называется « + »-цепь. Выбор ее осуществляется РНК-полиме-

разой.

Транскрипция, как и всякий матричный синтез, протекает в три

стадии: инициация, элонгация, терминация. Инициация заключается

в распознавании РНК-полимеразой промотора и сборке первых вось-

ми рибонуклеотидов. Далее у прокариот от РНК-полимеразы отщеп-

ляется а-фактор и кор-фермент начинает катализировать дальнейший

рост цепи РНК, который идет слева направо в направлении от

Б'-конца к З'-концу: полимераза удлиняет цепь РНК за счет присоеди-

нения рибонуклеотидов к З'-гидроксильному концу молекулы РНК

(рис. 46). Завершение процесса транскрипции и прекращение роста

цепи РНК происходит на специфическом участке ДНК, носящем

название терминатор. Он представлен группой последовательностей

А — Т, в начале которой располагаются пары Г — Ц, образующие

так называемый палиндром — участок ДНК, на котором в «+»

и «—»-цепях в разных направлениях читается одна и та же после-

довательность азотистых оснований:

РНК-полимераза прекращает работу как только и-РНК, достиг-

нув палиндрома, приобретает форму шпильки ).У про-

кариот в этот момент р-фактор захватывает фермент и сбрасывает

его с ДНК.

Скорость роста цепи РНК в клетках кишечной палочки при 37 °С

составляет примерно 43 нуклеотида в минуту, что значительно ниже,

чем скорость репликации (около 1625 нуклеотидов за то же время).

Информационная РНК имеет однонитчатую структуру и обладает

низкой молекулярной массой, поскольку при ее синтезе информация

считывается лишь с ограниченного участа молекулы ДНК. Размеры

и-РНК можно приблизительно рассчитать, если известна величина

белковых молекул, которые она кодирует. У всех живых организмов

и-РНК выполняет одну функцию: переводит последовательность

нуклеотидов в последовательность аминокислот. Но ее структура

у про- и эукариот различна.

Бактериальная и-РНК нестабильна, в связи с чем ее выделение

и изучение представляет определенные трудности. Последователь-

ность нуклеотидов в ней полностью соответствует последовательности

нуклеотидов определенных генов бактериальной хромосомы. Бакте-

риальные и-РНК могут кодировать один или несколько белков.

В последнем случае и-РНК транскрибируется одновременно с группы

располагающихся рядом генов. Таким образом, у бактерий одна

и-РНК может участвовать в синтезе нескольких белковых молекул,

в то время как эукариотическая и-РНК — в синтезе только одной

полипептидной цепи.

Эукариотическая и-РНК имеет стабильную структуру. Поэтому

ее удалось выделить и достаточно детально изучить. Она синтези-

руется в виде предшественника — гетерогенной ядерной РНК (гя-

РНК), которая, как и ген, имеет интрон-экзонную структуру. Это

означает, что гя-РНК разделена на информативные участки —

экзоны и участки, не несущие наследственной информации,— интро-

ны. Последние располагаются между экзонами таким образом, чта

генетическая информация записывается прерывистой фразой. Чтобы

стать функционально активной,гя-РНК должна созреть, т. е. пройти

посттранскрипционный процессинг. При этом сначала из нее уда-

ляются интроны, затем «сшиваются» (сплайсинг) экзоны. Зрелая

и-РНК составляет примерно 1/10 часть первоначального транскрип-

та. Порядок расположения в ней триплетов и расстояние между

ними совпадает с таковыми аминокислот в белковой молекуле.

Информационная РНК поступает в цитоплазму для трансляции.

Трансляция — это процесс своеобразного перевода кодовой по-

следовательности нуклеотидов в реальную первичную структуру

полипептида. Центральная роль в нем принадлежит рибосомам

(рис. 47). Они представляют собой так называемые читающие ма-

шины и состоят у прокариот из двух субъединиц—30S и 505 (S — ско-

рость седиментации, т. е. осаждения частиц в центрифуге), построен-

ных из РНК и белка. Меньшая субъединица (30S) включает одну

молекулу РНК (16S-PHK из 1500 нуклеотидов) и приблизительно

20 рибосомных белков. Большая субъединица (50S) содержит две

молекулы РНК (5S-PHK из 120 нуклеотидов и 23S-PHK из 3000

нуклеотидов) и около 30 специфических рибосомных белков.

Рибосомы эукариот крупнее (две частицы — 40S и 60S), чем у

прокариот, но относительное содержание РНК в них несколько ниже.

Рибосомы выполняют две важные функции: обеспечивают точное

считывание молекул и-РНК и увеличивают эффективность, а также

скорость синтеза белка.

У прокариот процессы транскрипции и трансляции сопряжены:

бактериальная и-РНК приступает к трансляции при еще незавер-

шенной транскрипции. Иными словами, в то время как цепь РНК еще

продолжает синтезироваться, рибосомы одна за другой присоеди-

няются к ее 5'-концу и продвигаются вдоль нее по направлению к

З'-концу. Допускается и такой вариант, когда сначала синтезируется

вся и-РНК, а затем к ней присоединяются рибосомы и начинается

трансляция. Однако существование этого варианта эксперименталь-

но не доказано.

У эукариот синтез и-РНК и ее трансляция происходят совершен-

но независимо друг от друга в разных частях клетки. По завершении

транскрипции и-РНК через поры ядерной мембраны проникает

в цитоплазму и вступает в контакт с рибосомами. С этого момента

и начинается трансляция. Так как рост полипептидной цепи идет

ступенчато, нет необходимости в том, чтобы вся молекула и-РНК

постоянно находилась в контакте с рибосомной частицей. Поэтому

предполагается, что и-РНК протягивается через рибосомы подобно

тому, как магнитная лента проходит через головку магнитофона,

и может контактировать с ними лишь небольшим участком (при-

мерно около 10 нуклеотидов). В него входит триплет, определяющий,

какая конкретно аминокислота должна в данный момент присоеди-

ниться к полипептиду, строящемуся на рибосоме. Как только амино-

кислота присоединится к полипептиду, «лента» и-РНК продвигается

но контактирующей с ней рибосоме на один триплет и освободив-

шееся место занимает следующий кодон. Каждая молекула и-РНК

вступает в контакт с несколькими рибосомами. В результате обра-

зуется полирибосомный комплекс, который называют белоксинтези-

рующей системой. Рибосомы, продвигаясь по и-РНК, присоединяют

комплементарно каждому триплету определенные молекулы т-РНК.

Последние представляют собой низкополимерные молекулы, вклю-

чающие около 70 нуклеотидов. Каждая т-РНК специфична по отно-

шению к какой-то одной аминокислоте и соответствующему ей

(i. Зак. 5107

кодону в и-РНК, т. е. для каждой из £0 стандартных аминокислот

имеется один тип молекул т-РНК.

В 1965 г. Р. Холли составил полную последовательность

(77 оснований) аланиновой т-РНК. Позднее были расшифрованы

структуры других т-РНК. Транспортная РНК имеет форму клевер-

ного листа с двухцепочечным стеблем и тремя одноцепочечными

петлями на его концах (рис. 48). В головке средней, внутренней,

петли находится кодирующий триплет (антикодон), «узнающий»

кодон в и-РНК. Двухцепочечный стебель содержит в основном

пары Г — Ц; на З'-конце одной цепи располагается триплет ЦЦА,

к которому присоединяется аминокислота. Считается, что специфич-

ность т-РНК определяется структурой именно этой части молекулы

и заключается в особой последовательности пуриновых и пиримиди-

новых оснований. В петлях содержатся необычные нуклеотиды:

6-метиламиноадениловая и диметилгуаниловая кислоты, тиминри-

ботид, 5-рибозоурацил.

Итак, каждая т-РНК имеет два активных конца: один является

местом прикрепления аминокислоты, другой несет антикодон. Ин-

формация о структуре т-РНК записана в специальных генах

ДНК.

Трансляция так же, как репликация и транскрипция, является

матричным синтезом, но при трансляции роль матрицы выполняет

и-РНК. Процесс протекает по трем классическим стадиям, которым

предшествует стадия активации аминокислот, поскольку свободные

аминокислоты не используются рибосомой. В процессе активации

аминокислота присоединяется к т-РНК под действием фермента

аминоацил-т-РНК-синтетазы. Он «узнает» одновременно и аминоки-

слоту и т-РНК и соединяет их ковалентной связью, затрачивая на

это одну молекулу АТФ. Например, глицин присоединяется к

глициновой т-РНК с антикодоном ГЦЦ, комплементарным кодону

ГГЦ в и-РНК.

Затем начинается стадия инициации. Она заключается в присо-

единении малой рибосомной субъединицы к соответствующему цен-

тру на и-РНК. У эукариот этот центр включает метиониновый

кодон АУГ, поэтому синтез полипептида всегда начинается с

метионина. У прокариот инициирующей аминокислотой является

А^-формил метионин.

Далее следует стадия элонгации, которая сводится к много-

кратным повторениям цикла ковалентного присоединения амино-

кислот к растущей полипептидной цепи. Например, молекула т-РНК,

несущая метионин, на какое-то время присоединяется к кодону АУГ,

затем вторая т-РНК, несущая аланин, присоединяется ко второму

кодону ГЦЦ. Обе молекулы т-РНК располагаются рядом так, что

две аминокислоты оказываются столь близко друг к другу, что между

ними возникает пептидная связь (рис. 49). Эти связи образуются

при участии специфических ферментов. У формирующегося поли-

пептида на одном конце имеется свободная а-карбоксильная группа,

на другом — свободная а-аминогруппа. Рост полипептида начинает-

ся с аминоконцевой аминокислоты и завершается карбоксиконцевой

аминокислотой. Этот процесс идет ступенчато, путем присоединения

по одной аминокислоте.

Прекращают рост полипептидной цепи специфические кодоны —

терминаторы цепи. Это так называемая стадия терминации. Извест-

ны три терминирующих кодона: УАГ, УАА, УГА. В клетке имеются и

т-РНК, несущие для них антикодоны. Ни одна из них не способна

связываться с аминокислотами, поэтому синтез полипептида на них

обрывается.

Все стадии трансляции находятся под контролем специфических

факторов, которые содержатся в цитозоле клетки. Но природа их

пока не ясна.

Синтез одной молекулы белка, состоящего из 150 аминокислот,

идет примерно за 1,5 мин, т. е. со скоростью 2 аминокислоты в се-

кунду. Он зависит от многих факторов. Например, состояние рибо-

сомы может оказать влияние на считывание информации. Рибосома

«читает с ошибками», если на нее воздействовать какими-либо

внешними факторами, к примеру облучением, химическими веще-

ствами, способными изменять структуру и функцию рибосомы.

Перенос наследственной информации типа ДНК^ДНК (репли-

кация), ДНК-^и-РНК (транскрипция) и и-РНК->белок (трансля-

ция) возможен в любых клетках. Поэтому он получил название об-

щий перенос. У всех организмов в результате репликации образуется

молекула ДНК, транскрипции — и-РНК, трансляции — белок.

Однако Ф. Крик еще в 50-х годах допускал, что перенос генети-

ческой информации между биологическими макромолекулами может

осуществляться и в иных направлениях:

Однако если перенос информации общего типа был эксперимен-

тально доказан, то аргументов в пользу существования переносов

в других направлениях долгое время не было.

Доказательства существования в клетках при определенных усло-

виях не только общего, но и иных путей переноса наследственной

информации были получены экспериментальным путем в 70-х годах.

Так, in vitro было установлено, что одноцепочечная ДНК может уча-

ствовать в процессе трансляции. Этот путь переноса информации

назвали специализированным переносом. Однако в живых клетках он

не был выявлен.

Кроме того, в клетках, зараженных РНК-содержащим вирусом,

был обнаружен перенос типа РНК-^РНК: в присутствии фермента

РНК-зависимой РНК-полимеразы, или РНК-репликазы, на РНК-

матрице синтезировались дочерние РНК. Этот тип переноса также

был назван специализированным.

Мысль о возможности существования иных путей переноса

наследственной информации возникла при изучении механизмов

взаимодействия с клеткой опухолеродных вирусов. В 1969—L971 гг.

Р. Дульбеко экспериментально доказал, что ДНК опухолеродного

вируса прочно связывается с ДНК клетки и находит в ее хромосомах

скрытое убежище. Известно, что опухолеродные вирусы делятся

на две большие группы: ДНК-содержащие и РНК-содержащие.

Включение вирусной ДНК в ДНК клетки и их интеграцию пред-

ставить легко, но как включается в нее РНК-содержащий вирус,

было не ясно.

В 60-х годах Г. Темин высказал предположение, согласно

которому «жизненный цикл» РНК-содержащих опухолеродных виру-

сов должен включать стадию образования ДНК-продукта — прови-

руса. Это явно противоречило центральной догме молекулярной

биологии. Если допустить, что существует путь переноса информации

типа РНК->ДНК, то в клетке должен быть и специальный фермент,

участвующий в синтезе подобного рода. В 1970 г. Г. Темин и

С. Мизутани обнаружили в составе вируса саркомы Рауса (РНК-

Обратная транскрипция