Ермишин А.П. Биотехнология. Биобезопасность. Биоэтика

Подождите немного. Документ загружается.

ГЛАВА ВТОРАЯ

как моногенные, доминантные признаки). Это необходимо для гарантированного по-

лучения потомства с определенной степенью выраженности трансгенного признака.

С другой стороны, многокопийность трансгена у высших организмов часто со-

провождается не увеличением выработки протеина — продукта трансгена, а, напротив

ослаблением его активности вплоть до полного «замолкания» (это явление так и назы-

вают — gene silencing). Явление «замолкания» генов нашло широкое использование в

генетической инженерии для регулирования активности отдельных генов растения

или животного. Введение дополнительной копии гена в виде «смысловой» или «анти-

смысловой» (перевернутой концом по отношению к промотору, в результате чего об-

разуется мРНК, комплементарная нормальной мРНК гена) кодирующей последова-

тельности гена, активность которого хотят ослабить, позволяет получать сорта с улуч-

шенными качественными характеристиками (улучшенный состав масла, крахмала, уд-

линенный срок созревания и хранения плодов и др.).

Следующая важная особенность трансгенных высших организмов, которая может

существенно влиять на активность привнесенных генов, связана со случайным харак-

тером вставки трансгенов в геном. В зависимости от места встраивания активность

трансгенов может различаться в тысячи раз: от полного молчания до активной ста-

бильной экспрессии. Это явление получило название «эффект положения трансгена»

(gene position effect). Чтобы его нивелировать, обычно получают большое количество

(до тысячи) первичных трансформантов, среди которых в дальнейшем отбирают гено-

типы с требуемым уровнем экспрессии трансгенов. Также обращают внимание, чтобы

отобранные растения были без заметных изъянов, индуцированных вставкой трансге-

на. Нивелировать эффект положения можно и с помощью чисто генно-инженерных

подходов: путем введения в трансгенные конструкции так называемых MARs (matrix

attached regions) — специальных последовательностей, которые предположительно

обеспечивают повышенную экспрессию расположенных рядом с ними генов за счет

изменения конфигурации петель ДНК относительно ядерных структур — матрикса.

Недавно появилось сообщение о разработке системы сайт-специфического

встраивания чужеродной ДНК в геном растений.

2.7. Отбор трансформированных клеток

Поскольку процесс трансформации затрагивает лишь небольшое количество

компетентных клеток, то для их отбора используют селективные маркерные гены, ко-

торые, как правило, присутствуют в переносимых в растительные клетки генетических

конструкциях наряду с генами целевых признаков. При высеве клеток, подвергнутых

трансформации, на питательную среду, содержащую селективный агент, способно-

стью делиться будут обладать только те клетки, в геном которых произошла вставка

рекомбинантной ДНК. В генетической инженерии растений чаще всего используют в

качестве маркерных гены устойчивости к антибиотикам (например, канамицину, ам-

пициллину) или гены устойчивости к гербицидам (например, гены bar или pat устой-

чивости к гербициду глюфозинату аммония). Если целью генетической модификации

является получение гербицидоустойчивых форм, то сам целевой ген может выступать

в качестве селективного гена.

Имеется еще одна специфическая группа маркерных генов, широко используемая

в генетической инженерии растений. Речь идет о так называемых репортерных генах,

которые применяют для изучения регуляторных элементов генов: промоторов, энхан-

серов, сайлэнсеров, терминальных последовательностей. В частности, при исследова-

нии промоторов можно определить их области, связанные с тканеспецифической экс-

прессией генов, или выделить у них светочувствительные участки и т.д.

КАК ПОЛУЧАЮТ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ ОРГАНИЗМЫ

Таблица 2.2

Состав трансгенной конструкции при создании ГИО — рапса с системой получения гибридных семян

на основе мужской стерильности/восстановления фертильности

и толерантности к гербициду глюфозинату аммония (Aventis CropScience, 2000)

Аббревиатура

Генетический

элемент

Происхождение

Размер,

п.н.

Функция

RB Правый край Agrobacterium

tumefaciens

25 Встраивание ДНК

PLS Полилинкер Синтетический 72 Соединение фрагментов

3’g7 Сигнал терминации

транскрипции от гена

7 TL-ДНК

Agrobacterium

tumefaciens

212 Терминация транскрип-

ции, присоединение по-

ли-А

PLS Полилинкер Синтетический 21 Соединение фрагментов

ДНК

Bar Ген толерантности к

глюфозинату

Streptomices

hygroscopicus

552 Селективный маркер

PSsuAra Промотор Arabidopsis thaliana 1726 Конститутивный промо-

тор, экспрессия гена в

зеленых тканях

PLS Полилинкер Синтетический 50 Соединение фрагментов

3’nos Последовательность

полиаденилирования

от гена nos

Agrobacterium

tumefaciens

261 ДНК Присоединение

поли-А

3’UTR Сигнал терминации

транскрипции от гена

barnase

Bacillus

amyloliquefaciens

112 Терминация транскрип-

ции

Barnase* Ген РНКазы To же 336 Мужская стерильность

РТА 29 Промотор Nicotiana tabacum 1510 Конститутивный промо-

тор, экспрессия гена в

пыльниках

PLS Полилинкер Синтетический 44 Соединение фрагментов

ДНК

LB Левый край Agrobacterium

tumefaciens

25 Встраивание ДНК

* У восстановителя фертильности на этом месте ген barstar (273 п.н.) — ингибитор РНКаз со своей собственной тер-

минальной последовательностью (40 п.н.).

Репортерные гены помещают в генетических конструкциях вслед за промотором

на месте белок-кодирующей последовательности. Особенностью этих генов является

кодирование образования какого-либо фермента, не характерного для изучаемых жи-

вых организмов. Важно, чтобы активность этого фермента можно было измерить ко-

личественно, с высокой воспроизводимостью и достаточно просто.

Чаще всего в качестве репортерного гена используют ген gus (или uidA) из E.coli,

кодирующий образование фермента β-глюкуронидазы. Экспрессию этого гена оцени-

вают с помощью спектрометрических, флюорометрических или гистохимических ме-

тодов. Сам анализ простой, дешевый и высокочувствительный. У интактных (нетранс-

формированных) растений продукт этого гена практически не выявляется. Среди его

недостатков — необходимость разрушения растительных тканей трансформантов для

проведения анализа. Поэтому в тех случаях, когда требуется проследить динамику

экспрессии трансгена в онтогенезе растения, рекомендуют использовать такие гены,

как ген люциферазы (luc) из светлячков Photinus pyralis или ген флюоресцирующего зе-

леным протеина (GFP — green fluorescent protein) из медузы Aequorea victoria.

Таким образом, для успешного переноса и стабильной, адресной экспрессии в ор-

ганизме-хозяине трансгенные конструкции должны иметь определенный набор коди-

рующих повторностей и соответствующих регуляторных генетических элементов. В

ГЛАВА ВТОРАЯ

качестве примера типичной трансгенной конструкции можно привести конструкцию,

использованную при получении сортов рапса с системой мужской стерильно-

сти/восстановления фертильности, позволяющей получать гетерозисные гибридные

семена (табл. 2.2). Между левым и правым краями от A.tumefaciens (которые, как извест-

но, играют ключевую роль в переносе Т-области из агробактерии в растительную

клетку) в этой конструкции расположены два гена со своими собственными регуля-

торными элементами: ген целевого признака — мужской стерильности bamase и селек-

тивный маркерный ген bar толерантности к гербициду глюфозинату аммония (фос-

финотрицину). Отдельные фрагменты ДНК соединены между собой с помощью син-

тетических полилинкеров.

Интересно, что ген bar толерантности к гербициду глюфозинату аммония играет

в этой конструкции тройную роль. Во-первых, он обеспечивает эффективную селек-

цию трансформированных клеток. Во-вторых, толерантность к гербициду — важный

агрономический признак. В-третьих, этот ген необходим в системе производства гиб-

ридных семян для целей размножения родительских линий.

2.8. От единичной трансформированной клетки

к многоклеточному генно-инженерному организму

Надо иметь в виду, что есть организмы одноклеточные и многоклеточные. В пер-

вом случае все просто: имеются хорошо отработанные методы введения рекомбинант-

ных плазмид в клетки микроорганизмов. Если сконструированная плазмида способна

к самовоспроизведению, то она будет размножаться внутри клетки. В свою очередь са-

ми клетки реципиентного организма быстро делятся вместе с привнесенными в них

плазмидами. Так осуществляется клонирование генов, таким же образом получают

генно-инженерные микроорганизмы — суперпродуценты каких-либо веществ. Иногда

добиваются, чтобы привнесенная в клетку генетическая конструкция включилась (ус-

тойчиво интегрировалась) в хромосому реципиентного микроорганизма.

Для получения генно-инженерных многоклеточных организмов поначалу транс-

формируют (т.е. вводят) нужный ген лишь в отдельные клетки, из которых затем вос-

станавливают целый организм. Понятно, что восстановить организм из отдельной

клетки — не простая задача. Однако ученые научились делать это. Так, для получения

трансгенных животных (например, млекопитающих: мышей, кроликов, овец, коров и

т.д.) чаще всего используют оплодотворенные яйцеклетки, в которые с помощью мик-

романипуляторов впрыскивают

препараты ДНК, а затем имплантируют эти яйцеклет-

ки в матки суррогатных матерей, где из таких яйцеклеток развивается плод и далее

рождаются мышата, крольчата, ягнята, телята и т.д., часть из которых может содержать

в своем генетическом материале привнесенные гены.

С растениями ситуация, с одной стороны, сложнее, с другой — проще. Сложнее —

потому что каждая растительная клетка окружена плотной целлюлозной оболочкой,

что создает проблемы с введением в клетку чужеродной ДНК. Проще — потому что в

отличие от животных большинство растительных клеток тотипотентны, т.е. из них

можно восстановить целое растение (у животных этим свойством обладают только оп-

лодотворенные яйцеклетки и клетки зародыша на самых ранних стадиях развития). В

придачу ко всему для растительных клеток разработаны эффективные методы их

культивирования вне организма на специальных питательных средах и методы ин-

дукции у них процессов морфогенеза (с помощью фитогормонов, изменения условий

культивирования), в результате чего достигается регенерация из клеток целых расте-

ний. Поскольку вопросы культуры in vitro растительных клеток имеют для генетиче-

ской инженерии растений первостепенное значение, рассмотрим их подробнее.

КАК ПОЛУЧАЮТ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ ОРГАНИЗМЫ

2.8.1. Культура клеток и тканей растений in vitro. Культивирование клеток и

тканей растений производят на специальных питательных средах, которые содержат

все необходимые для их роста макро- и микроэлементы, углеводы, витамины и фито-

гормоны. Питательная среда является прекрасным субстратом для микроорганизмов.

Поэтому для того, чтобы на ней можно было культивировать клетки растений, ее не-

обходимо стерилизовать. Среды стерилизуют путем автоклавирования в течение 20—

30 мин при давлении 0,7—0,8 кг/см

. Термолабильные элементы (некоторые фитогор-

моны: зеатин, кинетин, индолилуксусную кислоту, гиббереллин и др.) стерилизуют с

помощью фильтрации через бактериальные фильтры и добавляют в уже проавтокла-

вированные и охлажденные до 40—50°С питательные среды.

Культуру клеток получают из так называемого первичного эксплантата: изолиро-

ванного зародыша семени, верхушки или средней части стебля, сегмента листа и т.д.

Поверхность первичных эксплантатов стерилизуют, помещая их по определенной схе-

ме в стерилизующие растворы. Например, применяется такая схема: 30 с в 70%-ном

растворе этилового спирта, потом 7—10 мин в 0,1%-ном растворе диацида (ртутьсо-

держащее соединение) или 15—20 мин в 5—9%-ном растворе гипохлорита натрия. За-

тем эксплантаты промывают в 3—5 сменах автоклавированной дистиллированной во-

ды, после чего они готовы для введения в культуру.

Манипуляции с изолированными тканями — введение эксплантатов в культуру,

пересадку культур на свежую питательную среду — производят в условиях асептики.

Это означает, что все работы выполняют на столе ламинар-бокса (в ламинарном пото-

ке пропущенного через бактериальные фильтры воздуха), используя стерильные ин-

струменты и посуду. Культивирование клеток осуществляют в пробирках или колбах,

укупоренных ватными пробками или специальными крышками, обеспечивающими

защиту внутреннего объема этих сосудов от проникновения посторонней микрофло-

ры.

В целом культура клеток растений аналогична культуре бактерий. Применяются

два основных способа культивирования: на твердых (агаризованных) и жидких пита-

тельных средах. В первом случае после помещения первичного эксплантата на пита-

тельную среду образуется так называемый каллюс: неорганизованная, активно проли-

ферирующая ткань, состоящая из недифференцированных клеток (рис. 2.12). Обяза-

тельным условием процесса дедиф-

ференциации (т.е. утраты свойств,

характерных для определенных тка-

ней: листовой, корневой и т.д.) кле-

ток первичного эксплантата для

большинства видов растений являет-

ся присутствие в питательной среде

двух групп фитогормонов: ауксинов

и цитокининов. Ауксины (индоли-

луксусная кислота, нафтилуксусная

кислота и др.) инициируют процесс

дедифференциации клеток, а цито-

кинины (кинетин, 6-

бензиламинопурин, зеатин и др.) вы-

зывают деление дедифференциро-

ванных клеток. В отдельных случаях,

например при получении каллюсной культуры из зародышей семян злаковых расте-

ний, достаточно присутствия в питательной среде только ауксина (чаще всего это 2,4-

дихлорфеноксиуксусная кислота — 2,4-Д).

Рис. 2.12. Каллюсная культура картофеля

(эксплантаты – пыльники)

ГЛАВА ВТОРАЯ

Дедифференцировка растительных клеток является важнейшим элементом по-

лучения активно делящихся культур. Дело в том, что глубоко специализированные

(дифференцированные) клетки растений утрачивают способность к делению. Для то-

го чтобы они вновь ее приобрели, необходимо как бы вернуть их в меристематическое

состояние, т.е. дедифференцировать.

Если каллюсную культуру поместить в жидкую питательную среду и обеспечить

автоматическое ее перемешивание, то мы получим так называемую суспензию клеток

растений. Перемешивание или встряхивание суспензии необходимо не только для

аэрации клеток, но и для предотвращения образования крупных агрегатов клеток. Со-

став питательной среды для культивирования суспензии клеток растений аналогичен

тому, который применяют для каллюсных культур, за исключением агар-агара. Из

суспензии клеток можно вновь получить каллюсную культуру. Для этого ее фильтру-

ют через марлевые, нейлоновые или металлические фильтры, после чего клетки и кле-

точные агрегаты с фильтра переносят на агаризованную питательную среду. Можно

также использовать для этих целей клетки и клеточные агрегаты, осевшие на дно сосу-

да при прекращении перемешивания суспензии. Если объем суспензии небольшой

(несколько миллилитров), ее можно просто «высеять» на поверхность агаризованной

среды. Как каллюсную, так и суспензионную культуру периодически пересаживают на

свежую питательную среду, благодаря чему деление клеток в культуре можно поддер-

живать длительное время (есть культуры, которые выращивают в течение многих деся-

тилетий).

Следует также упомянуть о такой важной разновидности культивирования кле-

ток растений на жидких питательных средах, как культура протопластов (рис. 2.13).

Протопласты получают из клеток паренхимы листа, из каллюсных и суспензионных

культур. Характерной особенностью растительной

клетки, как указывалось выше, является наличие у нее

жесткой целлюлозной оболочки. С помощью специаль-

ных ферментов, выделенных из микроорганизмов

(целлюлаз), эти оболочки можно растворить. При по-

лучении протопластов используют также ферменты

пектиназы, которые разрушают пектин, находящийся в

межклеточном пространстве, благодаря чему происхо-

дит дезагрегация эксплантатов, клетки становятся дос-

тупными действию целлюлаз. Чтобы не повредить

внутреннее содержимое растительной клетки (прото-

пласт) в ходе и после удаления целлюлозных оболочек,

в питательную среду обязательно добавляют осмотики

(обычно сахара в повышенных концентрациях). Под

действием осмотиков протопласт сжимается, отстает от

клеточных стенок, принимая шарообразную форму.

Вновь полученные протопласты через определен-

ное время восстанавливают клеточную стенку, начинают делиться, образуя суспензию

клеток, из которой в дальнейшем можно получить каллюсную культуру. Однако в тот

промежуток времени, когда они не имеют клеточной стенки, протопласты представ-

ляют собой очень ценный объект для проведения генетических манипуляций. В них

можно инъецировать рекомбинантную ДНК, эффективно проводить агробактериаль-

ную трансформацию (понятно, что в отсутствие клеточных стенок проникновение Т-

ДНК намного облегчается). Можно сливать протопласты разных видов растений с це-

лью получения так называемых соматических гибридов, многие из которых невозмож-

но получить с помощью традиционных методов селекции.

Рис. 2.13. Культура протопластов

из мезофилла листа табака (с лю-

безного разрешения Г.Г. Бричко-

вой, Институт генетики и цитоло-

гии НАН Беларуси)

КАК ПОЛУЧАЮТ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ ОРГАНИЗМЫ

Как видим, культивирование клеток растений во многом аналогично культиви-

рованию микроорганизмов. Каллюсные культуры — это те же «колонии» клеток, обра-

зовавшиеся на агаризованной питательной среде. Их используют в основном для гене-

тических исследований. Суспензия растительных клеток аналогична промышленному

культивированию микроорганизмов для производства каких-либо ценных веществ.

Так, с помощью промышленного культивирования суспензий растительных клеток

производят некоторые ценные лекарственные препараты (например, сердечные гли-

козиды), продуцентами которых являются клетки соответствующих видов растений.

Тем не менее, культура клеток растений в отличие от культуры микроорганизмов

имеет ряд особенностей. Если при высеве суспензии микроорганизмов на агаризован-

ную питательную среду практически из каждой отдельной клетки образуется своя ко-

лония клеток, то заставить делиться отдельные единичные клетки растений весьма

сложно. Растительные клетки, как правило, хорошо делятся только тогда, когда их со-

держание в каком-то объеме среды достаточно велико. Это связывают с присутствием

так называемого кондиционирующего фактора, который выделяется в среду делящи-

мися клетками. Природа его до конца не выяснена. Специальные методы культивиро-

вания единичных клеток растений как раз и основаны на использовании эффекта

кондиционирования. Для этого одиночные клетки культивируют в присутствии

«няньки», которая может представлять собой интенсивно делящуюся каллюсную или

суспензионную культуру, отделенную от клетки фильтром, или «кормящий слой»,

«подложку», полученные из инактивированных, но не убитых радиацией клеток сус-

пензии.

Другой метод основан на использовании очень малых объемов питательной сре-

ды и представляет собой культивирование клеток в подвешенных микрокаплях объе-

мом около 1 мкл. Если в микрокапле такого объема находится лишь одна клетка, соот-

ношение объема клетки и объема питательной среды будет таким же, как в обычной

культуре с плотностью 103 клеток на 1 мл среды. Предварительное культивирование

клеток в течение 1—3 дней в суспензиях с высокой плотностью и активностью клеточ-

ных делений значительно увеличивает эффективность этого приема. Описанный ме-

тод оказался весьма эффективным и нашел широкое применение дня культивирова-

ния единичных протопластов, представляющих собой гетерокариоциты, образовав-

шиеся при соматической межвидовой гибридизации.

Разработка методов получения клонов из единичных клеток при их культивиро-

вании in vitro имеет исключительно важное значение дня генетической инженерии

растений, поскольку делает возможным создание трансгенных растений из единичных

трансформированных клеток. Реализация этой возможности связана со следующей

важной особенностью культивирования растительных клеток. Суть ее заключается в

том, что с помощью специальных методов (изменения состава питательной среды и ус-

ловий культивирования) можно индуцировать у них процесс вторичной дифферен-

циации, в результате которого удается регенерировать из каллюса или суспензии це-

лое растение.

2.8.2. Индукция морфогенеза и органогенеза в культуре клеток и получение рас-

тений-регенератов. Растения обладают уникальным свойством восстанавливать целый

организм из отдельных фрагментов (например, черенков), органов, почек, клеток. В

основе его лежит способность отдельной соматической клетки реализовать программу

развития, заложенную в зиготе, и дать начало целому организму (тотипотентность

растительных клеток). Любая соматическая клетка растения имеет такой же набор ге-

нов, что и та единственная клетка — зигота, которая образовалась при оплодотворении

и из которой далее развился зародыш семени и само растение. В ходе развития расте-

ния клетки отдельных органов приобретают свойства, характерные для соответствую-

ГЛАВА ВТОРАЯ

щих тканей. Однако, несмотря на это, многие из них все-таки способны при опреде-

ленных условиях редифференцироваться и давать начало новым органам или целым

организмам.

При культивировании клеток растений in vitro появляется возможность в значи-

тельно большей степени реализовать их тотипотентность, чем в составе целого расте-

ния. Это связано с тем, что в культуре in vitro

по сравнению с целым растением не действует

жесткая программа развития организма, от-

сутствует тесная взаимосвязь и взаимозависи-

мость клеток отдельных органов и тканей.

Можно целенаправленно управлять процес-

сами дифференциации клеток.

Регенерация растений в культуре in vitro

происходит двумя основными способами: пу-

тем эмбриогенеза или органогенеза. При со-

матическом эмбриогенезе формируется бипо-

лярное образование, аналогичное зародышу

семени. Оно представляет собой рудиментар-

ное растение с зачатками стеблевых и корне-

вых меристем, которое берет начало от одной

из каллюсных клеток и которое не имеет сосу-

дистых соединений с остальными каллюсны-

ми клетками (рис. 2.14). При стеблевом орга-

ногенезе образуется однополярная структура

— зачаток стеблевой почки, из которой далее

развивается облиственный побег, соединенный с массой каллюсных клеток (рис. 2.15).

Полученный стебель можно укоренить и получить, таким образом, целое растение.

Процессы морфогенеза в культуре in vitro могут происходить и в виде корневого (обра-

зуются корни) или флорального (образуются цветы) органогенеза. Однако эти типы

морфогенеза не представляют интереса для целей получения

растений-регенератов.

Впервые стеблевой органогенез из каллюса, полученного из стебля растений та-

бака, наблюдал в 1939 году П. Уайт.

Позднее, в 1944 году, Ф. Скуг показал,

что ауксины могут стимулировать кор-

невой органогенез и ингибировать стеб-

левой. При этом ингибирующее дейст-

вие ауксинов можно минимизировать

путем повышения концентрации в среде

других компонентов: сахарозы, неорга-

нического фосфата, аденина. Дальней-

шие исследования многих авторов в

данном направлении увенчались в 1957

году классической работой Ф. Скуга и С.

Миллера. В ней была высказана идея, со-

гласно которой разные количественные

соотношения между регуляторами роста

растений, особенно между ауксинами и

цитокининами, а также другими компонентами питательной среды, могут служить

качестве универсального механизма регуляции всех возможных типов морфогенеза в

культуре клеток растений. Преобладание в питательной среде ауксинов над цитоки-

Рис. 2.14. Регенерация растений из эмбриои-

дов, развивающихся из каллюса тритикале

(эксплантаты -пыльники) (с любезного раз-

решения Н.М. Ермишиной, Институт гене-

тики и цитологии НАН Беларуси)

Рис. 2.15. Стеблевой органогенез из каллюса,

полученного в культуре пыльников картофеля

КАК ПОЛУЧАЮТ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ ОРГАНИЗМЫ

нинами, как правило, стимулирует образование корней, преобладание цитокининов

над ауксинами — стеблей, а промежуточное соотношение оказывает благоприятное

влияние на пролиферацию каллюса. Хотя в дальнейшем это правило не нашло под-

тверждения применительно ко всем видам растений, однако сама концепция опреде-

лила стратегию оптимизации питательных сред с целью получения растений-

регенератов.

Если органогенез в культуре многих видов растений можно индуцировать, варь-

ируя соотношение ауксинов и цитокининов в питательной среде, то соматический эм-

бриогенез зависит в основном от уровня и соотношения эндогенных фитогормонов

каллюсных клеток. Обычно соматические эмбриоиды образуются из компетентных

клеток при пересадке культур на питательную среду, не содержащую дедифференци-

рующего фактора.

Способность изолированных

клеток растений к морфогенезу определяется мно-

гими факторами. Есть виды растений, у которых очень сложно получить каллюсную

культуру и заставить ее перейти к морфогенезу (большинство злаковых растений,

многие древесные культуры, особенно хвойные). А есть виды, легко образующие кал-

люс и растения-регенераты (некоторые пасленовые, в частности табак). Морфогенети-

ческие потенции культур

могут сильно различаться в зависимости от генотипа в пре-

делах одного вида и даже сорта. Показано, что названные процессы находятся под ге-

нетическим контролем определенных ядерных генов. На них могут оказывать влияние

и цитоплазматические факторы. Для получения способных к морфогенезу культур

большое значение имеет и выбор эксплантата, условий выращивания растений — ис-

точников эксплантатов, а также состав питательной среды, условия культивирования

каллюсных клеток (температура, освещение) и др. В генно-инженерных исследованиях

принято работать с культурами клеток растений, для которых все названные парамет-

ры успеха определены и оптимизированы.

2.8.3. Клеточная селекция. Выше отмечалось, что культура клеток растений имеет

много общего с культурой микроорганизмов. Одно из таких общих свойств, имеющих

большое значение для генетической инженерии, — возможность использовать селек-

тивные среды для отбора клеток с определенным фенотипом. Если высеять суспензию

бактерий или растительных клеток на питательную среду, в которую добавлен какой-

либо антибиотик, то на ней будут расти только бактерии или растительные клетки,

обладающие устойчивостью к этому антибиотику. Более того, растения-регенераты,

полученные из отобранных таким образом клеток, тоже будут устойчивы к антибио-

тику.

Клеточная селекция растений является самостоятельным и достаточно эффек-

тивным направлением сельскохозяйственной биотехнологии. Речь идет, по сути, об

использовании методов селекции микроорганизмов в селекции растений. Манипули-

руя большим количеством генотипов (миллионы клеток, многие

из которых способны

дать начало целому растению, в пределах одной чашки Петри), можно эффективно

отбирать отдельные редкие мутанты, представляющие селекционный интерес.

Для селекции мутантов важно прежде всего индуцировать генетическую измен-

чивость в популяции, в которой проводят отбор. Условия культивирования изолиро-

ванных клеток сами по себе являются мощным мутагенным фактором. Изменчивость

каллюсных клеток можно усилить и с помощью традиционных мутагенных факторов:

радиации, ультрафиолетового облучения, химических мутагенов.

Клеточную селекцию используют для отбора мутантов, устойчивых к гербици-

дам, стрессовым воздействиям (к засолению, повышенной и пониженной температуре),

к аналогам аминокислот (получают растения-регенераты, продуцирующие в десятки-

ГЛАВА ВТОРАЯ

сотни раз больше определенных незаменимых аминокислот, чем обычные, неизме-

ненные формы).

Мутантные гены устойчивости к гербицидам, выделенные из генотипов расте-

ний, отобранных с помощью клеточной селекции, находят применение и в генетиче-

ской инженерии. Так, мутантные гены csr1-1, csr1-2, csr1-4 из Arabidopsis thaliana, а также

SuRB-Hra из табака, кодирующие фермент ацетолактатсинтетазу с измененным сайтом

связывания с гербицидом, широко используются для создания растений сельскохозяй-

ственных культур, толерантных к гербицидам типа сульфонилмочевины, имидозоли-

нона, триазопиримидиновой группы.

Клеточная селекция является одним из важных этапов создания генно-

инженерных растительных организмов (см. раздел 2.7).

2.8.4. Получение генно-инженерных животных. В отличие от растений дифферен-

цировка соматических клеток у животных более глубокая и

тотипотентностью обла-

дают лишь клетки зародыша на самых ранних стадиях развития. В связи с этим для по-

лучения генно-инженерного многоклеточного организма обычно трансформируют

эмбриональные клетки на ранних стадиях развития эмбриона. Причем нередко случа-

ется, что развившееся из такого зародыша животное будет иметь лишь отдельные сек-

тора, состоящие из клеток,

содержащих рекомбинантные ДНК. Если в число этих сек-

торов попадут и генеративные органы, то можно рассчитывать, что потомство таких

мозаичных организмов окажется генно-инженерно-модифицированным. Чтобы ото-

брать родительские формы, дающие нерасщепляющееся потомство со стабильно вы-

раженными трансгенными признаками, обычно требуется от двух до четырех поколе-

ний.

Второй подход к получению многоклеточных генно-инженерных животных осно-

ван на трансформации половых клеток. Процесс оплодотворения с участием транс-

формированных половых клеток позволяет получать зиготы, дающие начало генно-

инженерным организмам. Однако, как отмечалось (см. 2.5.2), в целом эффективность

этого подхода остается очень низкой.

2.9. Трансформация органелл

В живой клетке высших организмов ДНК содержится не только в ядре, но и в ор-

ганеллах: пластидах (хлоропластах, хромопластах, лейкопластах и др.) и митохондри-

ях. Изучение организации геномов пластид и митохондрий выявило их большое сход-

ство с бактериальными геномами. Оно касается структуры кольцевых молекул ДНК,

порядка генов и особенностей их организации

в полицистроны, параметров белоксин-

тезирующей системы, чувствительности органелл к антибиотикам и др. Эти данные

подтверждают симбиотическую гипотезу возникновения эукариотических клеток, со-

гласно которой предшественниками органелл являются прокариотические организмы.

Метод биолистики позволяет вводить чужеродную ДНК в клетки, в результате че-

го достигается, с определенной вероятностью, ее включение в ДНК хромосом. Однако

тем же успехом можно рассчитывать и на трансформацию ДНК органелл. Именно

разработка метода биолистики позволила получить первые транспластомные растения

(т.е. растения, которые в отличие от трансгенных имеют «генетически модифициро-

ванные хлоропласты»). В настоящее время получены транспластомные растения с

привнесенными генами устойчивости к антибиотикам (канамицину, стрептомицину,

спектиномицину), гербициду глифосату, с генами токсинов бактерий Bacillus

thuringiensis (cry 1A, cry 2Aa2), а также репортерным геном β-глюкуронидазы. Среди

трансформированных видов растений пока преобладают в основном модельные объ-

екты: табак, арабидопсис, а также томаты и картофель.

КАК ПОЛУЧАЮТ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ ОРГАНИЗМЫ

Количество копий молекул пластидных ДНК может достигать десяти тысяч (одна

клетка может содержать до 100 хлоропластов, в каждом из которых имеется до 100 мо-

лекул ДНК). Естественно, добиться одновременного встраивания чужеродных генов во

все эти молекулы невозможно. Поэтому одной из основных проблем получения транс-

пластомных форм является достижение гомоплазии трансформированных клеток, т.е.

полное исключение у них нетрансформированных пластидных ДНК. В первичных

транспластомных клетках последние преобладают: у них имеются лишь единичные

молекулы со вставкой привнесенных генов. Для достижения гомоплазии применяется

селективная процедура: культивирование «обработанных» рекомбинантными плаз-

мидами тканей на питательной среде с антибиотиком. Делиться на такой среде спо-

собны только клетки, в которых имеются трансформированные пластиды. Из каллюс-

ных клеток, полученных на среде с антибиотиком, далее регенерируют растения. Для

полного избавления от нетрансформированных пластомов проводят повторные циклы

получения каллюса — регенерации растений на среде с высоким содержанием анти-

биотика.

Трансформация пластид рассматривается как одно из перспективных направле-

ний генетической инженерии растений, поскольку имеет по сравнению с трансфор-

мацией ядерной ДНК ряд преимуществ. В силу прокариотической природы ДНК пла-

стид возможно использование механизма гомологичной рекомбинации для сайт-

специфического встраивания чужеродной ДНК в их геном подобно тому, как это де-

лают при трансформации прокариот (см. 2.5.1). Благодаря многокопийности ДНК пла-

стид удается достичь очень высокого уровня экспрессии белка — продукта привнесен-

ного гена у транспластомных растений (от 1—5 до 40% транспластомного протеина ко

всему клеточному белку). Это делает рассматриваемую модель весьма привлекатель-

ной для создания растений — супер продуцентов ценных веществ. Транспластомные

растения по сравнению с трансгенными являются менее потенциально опасными для

окружающей среды, поскольку не способны передавать привнесенные гены путем рас-

сеивания пыльцы — наследование пластомных генов происходит в основном по мате-

ринской линии (вопросы биобезопасности подробно рассматриваются в главах 4—6

настоящей книги).

Литература к главе 2

Биология / Под ред. Б.А. Кузнецова. М.: Высш. школа, 1975. — 295 с.

Биотехнология растений: культура клеток: Пер. с англ. / Под ред. Р.А. Диксона. М.: Агро-

промиздат, 1989.—280 с.

Бутенко P.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе: Учеб.

пособие. М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. — 160 с.

Гершензон С.М. Основы современной генетики. Киев

: Наукова думка, 1979. — 508 с.

Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Клеточная инженерия растений. Киев: Наукова думка, 1984. — 160 с.

Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология: принципы и применение. М.: Мир, 2002.

— 589 с.

Даниленко Н.Г., Давыденко О.Г. Миры геномов органелл. Мн.: Тэхналогiя, 2003. — 494 с.

Картель Н.А. Биоинженерия: методы и возможности.

Мн.: Ураджай, 1989. — 143 с.

Пирузян Э.С. Основы генетической инженерии растений. М.: Наука, 1988. — 304 с.

Петров Д. Ф. Генетика с основами селекции. М.: Высш. школа, 1976. —416 с.

Сельскохозяйственная биотехнология / Под ред. B.C. Шевелухи. М.: Высш. школа, 1998. — 416с.

Сидоров В.А. Биотехнология растений: клеточная селекция. Киев: Наукова думка, 1990. — 280с.

Уотсон Дж., Туз Дж., Курц

Д. Рекомбинантные ДНК: Краткий курс. М.: Мир, 1986. —285 с.