Ермишин А.П. Биотехнология. Биобезопасность. Биоэтика

Подождите немного. Документ загружается.

ГЛАВА ПЕРВАЯ

ность, и некодирующие последовательности, роль которых пока неясна. Растения

имеют 25— 35 тысяч генов, у человека их около 70 тысяч. Можно себе представить, ка-

кой объем информации записан на ДНК. Длина ДНК одной клетки человека — 2 мет-

ра, а общая длина ДНК человека поистине астрономическая: приблизительно 60 тысяч

миллиардов километров, что соответствует расстоянию от Земли до Луны и обратно,

умноженному на 800! Несмотря на это, механизм использования наследственной ин-

формации работает исключительно четко и практически без сбоев. Как это достигает-

ся?

1.3. Каким образом используется информация,

записанная в молекулах ДНК

ДНК не может непосредственно участвовать в синтезе белков. Она является только

местом, где записана информация о них, подобно жесткому диску компьютера. Синтез

белков происходит в специализированных рибонуклеопротеидных частицах (т.е. со-

стоящих из рибонуклеиновой кислоты и белка), называемых рибосомами. Для того

чтобы доставить информацию из «жесткого диска компьютера» (ядра клетки с хромо-

сомами) к месту сборки белков, используется «дискета», в качестве которой выступает

так называемая информационная, или матричная, рибонуклеиновая кислота (мРНК).

РНК по своей природе очень близка к ДНК. Это тоже полимер, правда, имеющий

только одну нить, а вместо сахара дезоксирибозы нуклеотиды содержат рибозу. Нук-

леотиды, составляющие молекулу РНК, аналогичны тем, что содержатся в молекулах

ДНК: А, Г, Ц, а также У — урациловый, который близок по структуре Т — тиминовому

нуклеотиду ДНК и который так же, как и Т, комплементарен А. «Списывание» ин-

формации с «жесткого диска» (ДНК) на «дискету» происходит путем образования мо-

лекулы мРНК, комплементарной одной из нитей ДНК. Таким образом, последователь-

ность нуклеотидов в ней полностью идентична таковой другой нити ДНК (рис. 1.6).

Разумеется, этой информации вполне достаточно для синтеза белка со строго опреде-

ленной последовательностью аминокислот в соответствии с последовательностью нук-

леотидов в ДНК. Процесс считывания информации с ДНК на мРНК называется транс-

крипцией, синтез белка в рибосомах в соответствии с информацией, записанной на

мРНК, — трансляцией (рис. 1.7).

Рис. 1.6. Схема, иллюстрирующая механизм транскрипции (по Гершензон, 1979). А - аденин,

Г - гуанин, Ц - цитозин, Т - тимин, У - урацил. Фермент РНК-полимераза прикрепляется к ДНК в облас-

ти промотора, «расплетает» двойную спираль ДНК и, перемещаясь вдоль одной из нитей, последова-

тельно строит рядом с ней комплементарную ей нить молекулы мРНК. По мере передвижения РНК-

полимеразы растущая нить мРНК отходит от матрицы и двойная спираль ДНК позади фермента вос-

станавливается. Когда РНК-полимераза достигнет терминальной последовательности гена, мРНК отде-

ляется от ДНК

ЭЛЕМЕНТАРНЫЕ СВЕДЕНИЯ ПО БИОЛОГИИ И ГЕНЕТИКЕ

Большинство генов имеет сле-

дующее строение (рис. 1.8). Впереди

каждого гена на молекуле ДНК рас-

положена последовательность нук-

леотидов (она может быть по длине

даже больше самого гена), которая

регулирует его активность: «включе-

ние-выключение», интенсивность,

место (например, в листьях растения

на свету) и время работы (например,

в период цветения). Эта регуляторная

последовательность называется про-

мотором. Кодирующая область гена

начинается с триплета нуклеотидов

АТГ, который указывает место начала

считывания информации с мРНК

при ее трансляции в рибосомах, и за-

канчивается так называемым стоп-

кодоном (ТАГ, или ТАА, или ТГА),

указывающим место окончания

трансляции. У высших организмов, а

также у многих прокариот кодирую-

щая область гена может прерываться

одним или несколькими интронами

— участками ДНК, которые не несут

генетической информации о после-

довательности аминокислот закоди-

рованного белка (кодирующие уча-

стки называют экзонами). Участки

мРНК, соответствующие интронам,

удаляются в процессе «созревания»

(посттранскрипционного преобразо-

вания) мРНК (сплайсинг мРНК).

Следом за участком ДНК, коди-

рующим последовательность амино-

кислот в белке (собственно ген), рас-

полагается последовательность АА-

ТААА, обеспечивающая присоедине-

ние к мРНК так называемого «поли-

аденилового хвоста» (поли-А), кото-

рый предохраняет мРНК от разру-

шающего действия внутриклеточных

ферментов при перемещении ее из

ядра к рибосомам, и последователь-

ность нуклеотидов, указывающая ме-

сто окончания транскрипции.

Транскрипция осуществляется

следующим образом. В области про-

мотора находится специальная последовательность, к которой присоединяется моле-

кула фермента, катализирующего образование мРНК. Нити ДНК временно расплета-

Рис. 1.7. Схема механизма трансляции (по Уотсон и др.,

1986). Пояснения в тексте и на рисунке

ГЛАВА ПЕРВАЯ

ются, и фермент, «проходя» вдоль кодирующей области одной из нитей ДНК и ис-

пользуя ее в качестве матрицы, обеспечивает синтез мРНК (см. рис. 1.6).

Энхансер Сайлэнсер Промотор Экзон Интрон Экзон

Терминальная

последовательность

Рис. 1.8. Схема гена эукариот. Промотор, энхансер, сайлэнсер - регуляторные последовательности. Ко-

дирующая последовательность гена включает экзоны и интроны. Информация, записанная на мРНК с

интронов, удаляется в ходе «созревания» (посттранскрипционного преобразования) молекулы мРНК.

Терминальные последовательности гена включают кодоны, кодирующие место отсоединения РНК-

полимеразы от молекулы ДНК и место присоединения так называемого поли-А хвоста молекулы мРНК

(состоящего из остатков аденина)

Полученная мРНК из ядра переходит в цитоплазму, где на рибосомах происходит

синтез белка (трансляция) (см. рис 1.7). При этом мРНК выступает в качестве матрицы,

на которой происходит сборка цепи аминокислот. В этом процессе участвуют также

молекулы РНК другого типа — транспортные РНК (тРНК), которые связываются с

аминокислотами перед включением их в белок. Фактически они доставляют их к месту

синтеза белка. Причем каждой аминокислоте отвечает определенная тРНК, которая

умеет узнавать соответствующий своей аминокислоте кодон на молекуле мРНК. Это

оказалось возможным благодаря уже известному нам принципу комплементарности

нуклеиновых кислот. Транспортная РНК имеет последовательность из трех нуклеоти-

дов, комплементарных кодонам соответствующих аминокислот. Данные последова-

тельности получили название антикодонов. В ходе трансляции мРНК протягивается

через рибосому таким образом, что последовательные кодоны оказываются в положе-

ниях, при которых возможно присоединение определенной аминокислоты. Соответст-

вующие антикодоны тРНК узнают готовый к сборке кодон мРНК и к собираемой цепи

белка добавляется очередная аминокислота, которая должна быть именно в этом месте

цепи.

1.4. Каким образом клетка узнает,

когда и какой белок синтезировать и в каком количестве

Ни одна клетка никогда не использует всю информацию, закодированную в ДНК ее

хромосом. Клетки в организме разделяют свои обязанности — они специализированы.

Клетки мозга не образуют инсулин, клетки печени — слюну, а клетки кожи — кости.

Это же относится и к растениям: клетки корня не синтезируют зеленый пигмент хло-

рофилл, а клетки листа не образуют пыльцу или нектар. Работа генов, ответственных

за производство каких-либо веществ, зависит от возраста организма. Молодые расте-

ния не образуют веществ, связанных с процессом созревания плодов, у пожилых лю-

дей, как правило, не могут расти новые зубы. В придачу ко всему, регуляция активно-

сти генов тесно связана с условиями окружающей среды. Например, осенью при не-

достатке тепла и сокращении светового дня в листьях деревьев прекращается синтез

хлорофилла, и они приобретают желтую или красную окраску за счет сохранения дру-

гих пигментов — ксантофиллов.

Рассмотрим для примера, как функционирует ген, кодирующий образование инсу-

лина (гормона, регулирующего содержание сахара в крови). Специальная молекула-

«посыльный», несущая сигнал о недостатке инсулина в крови, находит промотор гена,

кодирующего инсулин, и присоединяется в определенном месте промотора, которое

она может распознать. Это служит сигналом к включению механизма работы (экспрес-

ЭЛЕМЕНТАРНЫЕ СВЕДЕНИЯ ПО БИОЛОГИИ И ГЕНЕТИКЕ

сии) гена. Когда инсулина в крови становится достаточно, поступает сигнал о «выклю-

чении» гена.

Селекционер, занимающийся выведением новых сортов растений или пород жи-

вотных, может с помощью подбора родительских форм получить гибридное потомст-

во, у которого активность отдельных генов выше или ниже по сравнению с обычным

уровнем, характерным для какого-либо растения или животного, например получить

сорта картофеля с повышенным содержанием крахмала или сорта рапса, не содержа-

щие в масле токсичные вещества типа эруковой кислоты. Но селекционер не может за-

ставить листья того же рапса образовывать масло, которое обычно синтезируется в се-

менах, хотя в хромосомах клеток листа содержится вся необходимая для этого инфор-

мация. Конечно, можно попытаться «обмануть» растение, заставив его листья образо-

вывать масло. Для этого необходимо у гена, кодирующего образование масла, поме-

нять промотор, поставив его под промотор того гена, который функционирует в ли-

стьях. Однако здесь кончается традиционная селекция и начинается генетическая ин-

женерия.

1.5. Что такое традиционная селекция

В основе традиционной селекции лежит прежде всего поиск оптимального сочета-

ния в одном организме генов, полученных от разных родительских форм. Для этого

проводят гибридизацию различных сортов или селекционных линий одного вида, об-

ладающих какими-либо ценными признаками (высокая продуктивность, устойчивость

к болезням и вредителям и т.п.). Чем выше генетическая изменчивость внутри вида

(широкий выбор селекционно-ценных генов), тем, как правило, выше эффективность

селекции. Но есть виды сельскохозяйственных растений, для которых естественная

внутривидовая изменчивость невысока (например, свекла). Многие ценные гены у ви-

дов культурных растений могут отсутствовать совсем (например, гены устойчивости к

некоторым болезням, вредителям). Поэтому в селекции широкое распространение по-

лучили методы, направленные на расширение генетического разнообразия вида с по-

мощью экспериментального мутагенеза или отдаленной гибридизации. В первом слу-

чае организм подвергается действию факторов, вызывающих различные нарушения в

структуре ДНК: радиации, обработке химическими веществами, обладающими мута-

генной активностью. Большинство индуцированных таким образом нарушений имеет

неблагоприятные последствия для организма. Однако отдельные мутации могут быть

весьма полезны с селекционной точки зрения.

Отдаленная гибридизация между культурными растениями и родственными ди-

кими видами позволяет не только расширить генетическую изменчивость культурного

вида, но, что наиболее важно, и привнести отдельные ценные гены от дикого вида, от-

сутствующие у культурного вида. Подобные скрещивания обычно являются весьма

сложным делом, поскольку между видами существуют жесткие репродуктивные барь-

еры. Чаще всего пыльца чужого вида не может расти на пестике и оплодотворить яй-

цеклетку. Если оплодотворение все же произошло, то семена получаются нежизнеспо-

собными из-за недоразвитого эндосперма (питающего элемента семени) или из семени

развиваются стерильные, не способные формировать жизнеспособные половые клетки

гибриды. Между видами существуют также жесткие барьеры, затрудняющие естест-

венную рекомбинацию. Это означает, что хромосомы межвидового гибрида, получен-

ные от разных видов, могут отличаться по количеству и гомологии (сходству). Отсутст-

вие гомологии между хромосомами приводит к тому, что они не способны сближаться

и обмениваться отдельными участками (а следовательно, и отдельными генами) в про-

цессе образования половых клеток. В результате становится невозможным перенос

нужных генов от дикого вида в генетический материал культурного вида. Поэтому от-

ГЛАВА ПЕРВАЯ

даленная гибридизация может быть эффективна только в том случае, когда скрещи-

ваются относительно близкие в эволюционном отношении виды.

Проблема отсутствия рекомбинации у отдаленных гибридов может быть решена

посредством удвоения у них количества хромосом. В этом случае каждая хромосома

будет иметь себе пару, и процесс образования половых клеток будет протекать нор-

мально. Такие гибриды, объединяющие в своем геноме полные (т.е. двойные) наборы

хромосом разных видов (их называют амфидиплоидами), весьма широко распростра-

нены в природе. Наиболее известные из них — пшеница, слива. Но если селекционер

попытается получить амфидиплоид с участием культурного и дикого вида, то он дол-

жен иметь в виду, что у этого гибрида помимо селекционно-ценных генов дикого вида

будет присутствовать и полный набор нежелательных «дикарских» генов. Избавиться

от них можно только путем возвратных скрещиваний с культурным видом, в ходе ко-

торых геном дикого вида замещается культурным и лишь отдельные ценные гены ди-

кого вида сохраняются благодаря селекции. Однако эта процедура может быть эффек-

тивной только в случае относительно высокой гомологии хромосом скрещиваемых ви-

дов (т.е. они должны быть относительно близкородственными). Круг замкнулся. Не

случайно поэтому, единственным амфидиплоидом, представляющим селекционную

ценность из числа полученных искусственно, остается тритикале — гибрид между

двумя культурными видами: пшеницей и рожью.

Как видим, традиционная селекция имеет целый ряд ограничений, не позволяю-

щих эффективно использовать все многообразие генов, существующее в природе. Ге-

нетическая инженерия дает возможность в значительной мере обойти все естественные

межвидовые репродуктивные и рекомбинационные барьеры. Она дает возможность

оперировать (комбинировать, переносить от одного вида к другому) любыми генами,

принадлежащими совершенно не родственным организмам или даже синтезирован-

ными искусственно. Все это стало возможным благодаря выдающимся достижениям в

изучении законов наследственности, среди которых на первом месте стоит открытие

универсальности построения и функционирования генетического материала живых

организмов на планете Земля.

Глава 2

КАК ПОЛУЧАЮТ

ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ ОРГАНИЗМЫ

2.1. Что такое генетическая инженерия

Существует много определений генетической инженерии. По мнению авторов,

суть новой технологии можно выразить следующим образом. Генетическая инженерия

— это технология получения новых комбинаций генетического материала путем про-

водимых вне клетки манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот и переноса соз-

данных конструкций генов в живой организм, в результате которого достигается их

включение и активность в данном организме и у его потомства.

Как видно из этого определения, процесс создания ГИО можно разделить на не-

сколько этапов. Первый этап включает выделение и идентификацию отдельных генов

(соответствующих фрагментов ДНК или РНК), которые собираются перенести другим

организмам, а также соответствующих регуляторных элементов (без них никакой ген

функционировать не будет!). Иногда гены или их части синтезируют искусственно.

Затем эти гены и регуляторные элементы соединяют между собой в определен-

ном порядке с помощью чисто химических методов (технология рекомбинантных

ДНК, или генная инженерия). То есть все названные манипуляции проводят вне орга-

низма, in vitro (в пробирке). В результате получается генетическая конструкция, кото-

рая содержит один или несколько генов (точнее, фрагментов ДНК, кодирующих по-

следовательность аминокислот протеинов — продуктов генов), а также все необходи-

мые регуляторные элементы, обеспечивающие активность этих генов (трансгенов) по-

сле их переноса в организмы. Такие генетические конструкции далее соединяют с ДНК

так называемого вектора для клонирования. В качестве вектора чаще

всего используют

плазмиды — небольшие кольцевые молекулы ДНК, имеющиеся у большинства бакте-

рий. Создание конструкции «клонирующий вектор—встроенная ДНК» необходимо

для эффективного переноса и активности трансгенов (репликации и трансляции) в

живых организмах.

Следующий этап — перенос трансгенов в отдельные живые клетки (процесс

трансформации, или, как принято его называть в последнее время, «генетической мо

дификации»), где они могут реплицироваться и передаваться дочерним клеткам, обра-

зовавшимся при делении трансформированных клеток. В случае, если все описанные

процедуры прошли нормально, из одной трансформированной клетки при культиви-

ровании возникает множество клеток, которые содержат привнесенную искусственную

генетическую конструкцию, и при этом образуются протеины — продукты трансге-

нов. Биосинтез новых для

организма протеинов является основой для проявления у не-

го нового селекционного признака, например толерантности к гербицидам, антибио-

тикам, устойчивости к насекомым-вредителям и т.д.

Для одноклеточных организмов процесс генетической модификации заканчива-

ется, как правило, внедрением в них рекомбинантной плазмиды и последующим от-

бором трансформированных клеток. Лишь в отдельных случаях для

более высокой

стабильности трансформантов добиваются включения трансгенов в бактериальную

хромосому. В случае же высших многоклеточных организмов встраивание трансгенов в

ГЛАВА ВТОРАЯ

генетический материал клетки (ДНК хромосом или клеточных органелл — хлоропла-

стов, митохондрий) является обязательным. Более того, необходимо из одной или не-

скольких трансформированных клеток восстановить целый организм. А это весьма не-

простая задача, которая была решена (правда, не для всех видов организмов в полной

мере) сравнительно недавно. В частности, первые растения, регенерированные из от-

дельных клеток, были получены в начале 60-х годов прошлого века, что стало возмож-

ным благодаря разработке эффективных методов культивирования изолированных

растительных клеток на специальных питательных средах. Добавка в питательные сре-

ды определенных регуляторов роста (фитогормонов) позволяет управлять процессами

деления клеток в культуре in vitro, a также, что самое главное, индуцировать у них

морфогенез, т.е. «заставлять» их образовывать отдельные органы (стебли, корни) или

даже целые зародыши (процесс эмбриогенеза), из которых в дальнейшем можно полу-

чить целое растение.

Рассмотрим подробнее, каким образом осуществляют перечисленные манипуля-

ции.

2.2. Методы создания рекомбинантных молекул ДНК

Технологию рекомбинантных ДНК можно использовать для манипуляций с

фрагментами ДНК, выделенными из живых организмов или синтезированными ис-

кусственно. Эта технология позволяет также вносить определенные изменения в

структуру естественных генов и их регуляторных элементов, комбинировать их в про-

извольной последовательности. Для того чтобы проводить названные манипуляции,

необходимо иметь возможность разрезать молекулы ДНК

на отдельные определенные

фрагменты, а затем сшивать их в нужном сочетании. Для реализации первой из на-

званных задач используют наборы ферментов — рестриктаз.

Первые рестриктазы, пригодные для генно-инженерных целей, были выделены в

1970 году Г. Смитом (США), обнаружившим, что бактерия Haemophilias influenzae быстро

расщепляет ДНК фагов. В результате проведенных исследований Г. Смит установил,

что нуклеазная активность (способность разрезать молекулы нуклеиновых кислот ДНК

и РНК), характерная для живых бактерий, сохраняется и в бесклеточном экстракте, по-

лученном из них. Выяснилось, что нуклеазная активность обусловлена присутствием в

экстракте фермента — рестриктазы, получившего название HindII. Было установлено,

что выделенный и очищенный фермент способен узнавать последовательности нук-

леотидов:

ГТПи ↓ ПуАЦ,

ЦАПу ↑ ПиТГ,

где Пи — любое пиримидиновое основание, а Пу — пуриновое основание, и прово-

дить расщепление молекулы ДНК (место расщепления указано стрелками). Интерес-

но, что рестриктаза HindII способна разрезать ДНК из различных источников, в том

числе хорошо нам известной бактерии Escherichia coli (E.coli), не повреждая при этом

ДНК бактерии

, из которой она выделена.

В дальнейшем было выделено несколько сотен рестриктаз из разных бактерий,

способных узнавать и расщеплять специфические последовательности нуклеотидов

(сайты узнавания) в молекуле ДНК. Некоторые из этих ферментов узнают группы из

четырех нуклеотидов, другие — из шести и даже более нуклеотидов. Понятно, что ре-

стриктазы, распознающие группы из четырех нуклеотидов, вносят в молекулу ДНК,

выделенную из какого-либо организма, больше разрывов, чем те, которые узнают

шесть и более нуклеотидов.

Для целей генной инженерии наибольшее значение имело выделение рестриктаз,

которые дают фрагменты с так называемыми «липкими» (комплементарными) конца-

КАК ПОЛУЧАЮТ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ ОРГАНИЗМЫ

ми. В случае их использования разрывы ДНК происходят в местах, расположенных на-

искось: на концах каждого из полученных фрагментов остаются короткие одноцепо-

чечные «хвосты» из нескольких нуклеотидов (табл. 2.1). Если объединить в одной про-

бирке фрагменты ДНК любого происхождения, полученные с помощью одной и той

же рестриктазы, дающей «липкие» концы, то эти фрагменты соединятся между собой.

Однако водородные связи между комплементарными азотистыми основаниями недос-

таточно прочны, чтобы стабильно удерживать два объединенных фрагмента ДНК. Для

воссоединения фосфодиэфирных связей между концами сшиваемых фрагментов ДНК

необходим фермент ДНК-лигаза. Этот фермент впервые выделен в 1967 году из куль-

туры E. coli, инфицированной бактериофагом Т4, при изучении энзимологии процесса

репликации ДНК (то есть еще до того, как научились «разрезать» ДНК).

Таблица 2.1.

Нуклеотидные последовательности, распознаваемые некоторыми ферментами рестрикции,

и характер получаемых концов ДНК (по Глик, Пастернак, 2002)

Рестриктаза Сайт узнавания Характер получаемых концов ДНК

ЕсоRI Г ↓ А-А-Т-Т-Ц «Липкие» концы с 5’-фосфатной группой

Ц-Т-Т-А-А ↑ Г

BamHI Г ↓ Г-А-Т-Ц-Ц То же

Ц-Ц-Т-А-Г ↑ Г-

PstI Ц-Т-Г-Ц-A ↓ Г »

Г ↑ А-Ц-Г-Т-Ц

Sau3AI ↓ Г-А-Т-Ц »

Ц-Т-А-Г↑

NotI Г↓ Ц-Г-Г-Ц-Ц-Г-Ц »

Ц-Г-Ц-Ц-Г-Г-Ц ↑ Г

PvuII Ц-А-Г ↓ Ц-Т-Г «Тупые» концы

Г-Т-Ц ↑ Г-А-Ц

HpaI Г-Т-Т ↓ А-А-Ц То же

Ц-А-А ↑ Т-Т-Г

HaeIII Г-Г ↓ Ц-Ц »

Ц-Ц ↑ Г-Г

Для целей генной инженерии большое значение имеет использование еще одного

фермента — концевой трансферазы из тимуса теленка, который катализирует присое-

динение нуклеотидов к 3’-концам цепей ДНК. Благодаря этому «тупой» конец ДНК

несложно превратить в «липкий». Если к обоим 3’-концам двухцепочечного фрагмен-

та присоединить несколько расположенных друг за другом адениновых нуклеотидов

(поли

-А), а к другому фрагменту ДНК присоединить поли-Т, то при смешивании этих

двух фрагментов они соединятся между собой, поскольку их концы комплементарны

друг другу (рис. 2.1).

В современных генно-инженерных работах часто используют еще один метод

произвольного сшивания фрагментов ДНК, основанный на применении так называе-

мых линкеров — искусственных сайтов рестрикции. Линкеры представляют собой ко-

роткие фрагменты ДНК (олигонуклеотиды), состоящие из 8—10 нуклеотидных пар. Их

синтезируют искусственно. При этом состав и последовательность нуклеотидов в них

соответствует сайту рестрикции одной из рестриктаз, образующей «липкие» концы и

использованной при выделении фрагмента ДНК, который предполагается «пришить»

к какому-то определенному фрагменту ДНК. Линкеры «пришивают» к последнему

фрагменту ДНК с помощью ДНК-лигазы, а затем расщепляют их рестриктазой. В ре-

ГЛАВА ВТОРАЯ

зультате данный фрагмент приобретает «липкий» конец нужной нам конфигурации

(рис. 2.2).

Концевая трансфераза

ДНК-лигаза

ковалентно

соединяет

фрагменты

AA(A)

TT(T)

AA(a)

AA―OH

HO―TT(T)

5’

3’

5’

3’

5’

3’ 5’

3’

5’

3’

5’

3’

Рис. 2.1. Лигирование двух концов ДНК с «тупыми» концами путем присоединения к ним poly-dA

или poly-dT (по Уотсон и др., 1986)

Одна какая-либо рестриктаза вносит строго определенное количество разрывов в

определенных местах молекулы ДНК какого-либо анализируемого организма. В этом

можно убедиться, если образовавшиеся после обработки ферментом фрагменты ДНК

разделить с помощью гель-электрофореза.

Рис.2.2. Линкеры: олигонуклеотиды, содержащие сайт рестрикции. Их можно добавить

с помощью ДНК-лигазы к «тупым» концам фрагмента ДНК. После обработки соответ-

ствующей рестриктазой фрагмент ДНК будет иметь «липкие» концы, совместимые с

концами ДНК, разрезанной той же самой рестриктазой.

жеродная ДНК

Линкер

ДНК-лигаза

Рест

иктаза EcoRI

НК с концами EcoRI

КАК ПОЛУЧАЮТ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ ОРГАНИЗМЫ

Принцип этого распространенного аналитического метода, используемого для

исследования белков и нуклеиновых кислот, заключается в следующем. Компоненты

смеси разделяют путем пропускания ее через гель — полужидкую среду с сетчатой

пространственной структурой, которую получают методом полимеризации агара, ага-

розы, сополимеризации акриламида и бисакриламида и др. Обычно гели готовят в ви-

де тонких пластинок, имеющих у одного края лунки для нанесения препарата. Нахо-

дящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают электрическим зарядом. Ко-

гда через гель с нанесенным раствором пропускают электрический ток, то компоненты

смеси начинают перемещаться в электрическом поле. Фрагменты ДНК или отдельные

протеины, содержащиеся в анализируемой смеси, имеют разную длину, а следова-

тельно, и размеры. Скорость миграции компонентов смеси в геле пропорциональна их

размерам: более мелкие фрагменты перемещаются быстрее. В результате по оконча-

нии электрофореза наиболее «быстрые» компоненты смеси достигнут противополож-

ного края гелевой пластинки, а остальные равномерно распределятся по ее длине в со-

ответствии со своими размерами. После их окрашивания специальными красителями

можно наблюдать на геле спектр четко различимых полос, расположенных одна за

другой, каждая из которых соответствует отдельному компоненту смеси (рис. 2.3).

Рис. 2.3. Электрофоретический спектр рестрикционных фрагментов ДНК (по Уотсон и др., 1986)

Электрофоретические спектры рестрикционных фрагментов для какой-либо ре-

стриктазы и для ДНК какого-либо организма строго специфичны. Сколько бы раз мы

ни выделяли ДНК, например, вируса SV40, сколько бы раз ни обрабатывали ее рест-

риктазой, например Hind II, в любом случае при электрофорезе мы получим один и

тот же спектр, состоящий из 11 специфических полос. На основании этого правила

строят так называемые рестрикционные карты молекул ДНК, на которые наносят в ус-

тановленной последовательности сайты рестрикции различных рестриктаз. Такие кар-

ты используют в молекулярной генетике для характеристики отдельных ДНК и в ген-

ной инженерии для подбора рестриктаз при выделении отдельных генов.

Исключительно важной особенностью электрофоретического разделения

рест-

рикционных фрагментов ДНК является то, что при электрофорезе эти фрагменты не

разрушаются и их можно выделить (элюировать) из геля в виде биологически актив-

ных двухцепочечных молекул. Понятно, что фрагменты ДНК, выделенные из одной

какой-либо полосы, будут строго идентичны друг другу. Далее их можно анализиро-

вать на предмет определения

последовательности нуклеотидов, использовать в качест-

ве материала для построения генетических конструкций и т.д.

Технологию получения рекомбинантных молекул ДНК по праву считают цен-

тральным звеном генетической инженерии. Поэтому можно сказать, что годом рожде-

ния генетической инженерии является 1972-й, когда появились первые публикации со-

трудников лаборатории П. Берга (США). В них сообщалось о получении кольцевой

молекулы ДНК вируса SV40 путем последовательного ее разрезания рестриктазой RI и

сшивания ДНК-лигазой [Mertz, Davis, 1972], а также о возможности с помощью этих

ферментов встраивать в такую молекулу гены других организмов, например фага-λ

(фаги — это вирусы бактерий), и галактозный оперон (набор генов, ответственных за

расщепление молочного сахара лактозы) бактерии E.coli [Jackson, Symons, Berg, 1972]