Ермишин А.П. Биотехнология. Биобезопасность. Биоэтика

Подождите немного. Документ загружается.

ГЛАВА ВТОРАЯ

2.3. Клонирование: генов

По большому счету объединение разных молекул ДНК с помощью методов, опи-

санных в предыдущем параграфе, само по себе бесполезно, если полученные реком-

бинантные ДНК не внести в живую клетку, не заставить их там реплицироваться. Но

самое важное — заставить привнесенные гены работать: синтезировать мРНК, транс-

лировать ее в рибосомах с образованием протеина — продукта трансгена.

Первая функционально активная молекула рекомбинантной ДНК была получена

в 1973 году. Г. Бойер и С. Коэн (США) сумели «пришить» к плазмиде E.coli фрагмент

ДНК плазмиды другой бактерии и обнаружили, что такая химерная плазмида могла

успешно функционировать в клетках E.coli, размножаться и передаваться другим клет-

кам как естественным путем, так и с помощью человека [Cohen et al., 1973]. Это означа-

ло, что таким образом можно получать многочисленные копии любых генов, т.е. кло-

нировать гены, нарабатывать достаточные объемы генетического материала для по-

следующего изучения и возможных манипуляций с ними.

Выбор плазмиды американскими учеными в качестве вектора для клонирования

оказался весьма удачным. Именно плазмидные векторы в

настоящее время используют

в генетической инженерии чаще всего. То же относится к бактерии E.coli, которую

обычно используют в качестве «места» клонирования. Попытаемся разобраться, что

лежит в основе их успеха.

Оказывается, для того чтобы рекомбинантная ДНК имела возможность реплици-

роваться в живой клетке, она должна содержать ту часть естественной молекулы ДНК,

которая «ответственна» за начало, инициацию этого процесса. Вероятность того, что

она окажется в случайных рестрикционных фрагментах ДНК, ничтожна. В то же время

сайт начала репликации имеется в любой бактериальной плазмиде (его обозначают

как ori). Поэтому, если в плазмиду встроить нужный нам фрагмент ДНК, она обеспе-

чит репликацию как своей собственной ДНК, так и встроенного фрагмента ДНК.

Плазмиды — это внехромосомные автономно реплицирующиеся двухцепочечные

кольцевые молекулы ДНК. Они присутствуют в клетках практически всех бактерий.

Размеры плазмид от менее 1 до более 500 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.). Они могут

быть представлены в клетке одной, несколькими или многими (10—100) копиями. На

их долю приходится до 5% суммарной клеточной ДНК. Малокопийные плазмиды реп-

лицируются с той же скоростью, что и бактериальная хромосома, многокопийные

плазмиды способны реплицироваться независимо.

Функции плазмид весьма разнообразны. Есть плазмиды, так называемые F-

факторы (F-плазмиды), «отвечающие» за прохождение полового процесса у бактерий

(конъюгацию), при котором осуществляется перенос плазмид из одной бактериальной

клетки в другую, а также части генетической информации, находящейся на бактери-

альной хромосоме. Имеются плазмиды, которые определяют устойчивость бактерий к

антибиотикам (R-плазмиды) или их способность утилизировать, перерабатывать не-

обычные вещества, например нефтепродукты, пестициды и другие загрязнители ок-

ружающей среды (плазмиды деградации). Расположение таких генов именно на плаз-

мидах, а не на хромосоме неслучайно. Высокая копийность плазмид обеспечивает

клетке возможность синтеза большого количества ферментов, способных нейтрализо-

вать антибиотики или расщеплять пестициды.

Некоторые плазмиды, называемые эписомами, могут обратимо включаться в бак-

териальную хромосому (к ним относятся упомянутые выше F-факторы). Если две

плазмиды не могут сосуществовать в одной клетке, то их относят к одной группе несо-

вместимости. Плазмиды из разных групп несовместимости могут находиться в одной

клетке независимо от числа копий. Отмечены случаи, когда у бактерий обнаруживали

КАК ПОЛУЧАЮТ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ ОРГАНИЗМЫ

до 8—10 разных групп плазмид, выполняющих свои функции и представленных ха-

рактерным для каждой группы числом копий.

Плазмиды могут передаваться от одной бактериальной клетки к другой, в том

числе и неродственной. Чтобы интенсифицировать процесс внедрения плазмид в бак-

териальные клетки, в экспериментах используют специальные приемы, например,

подвергают клетки высокотемпературному воздействию и обрабатывают их хлори-

стым кальцием (СаС12).

Каждая плазмида обязательно содержит сайт инициации репликации (ori). Одна-

ко у одних он строго специфичен, т.е. плазмиды с таким сайтом способны реплициро-

ваться только в клетках одного вида бактерий. У других плазмид этот сайт менее спе-

цифичен, и они способны реплицироваться в самых разных бактериальных клетках.

Соответственно различают плазмиды с узким и широким спектром хозяев. Существо-

вание последней группы плазмид имеет, можно сказать, зловещее значение, поскольку

лежит в основе быстрой передачи генов устойчивости к антибиотикам к ранее чувст-

вительным к ним болезнетворным микроорганизмам.

В качестве векторов клонирования используют специально отобранные и генети-

чески модифицированные плазмиды. Основные требования к вектору следующие: 1)

небольшой размер, поскольку эффективность клонирования чужеродной ДНК в Е. coli

значительно снижается при общей длине привнесенной рекомбинантной плазмиды

более 15 т.п.н.; 2) наличие уникального сайта рестрикции, в который может быть осу-

ществлена вставка; 3) наличие одного или нескольких селективных генетических мар-

керов для идентификации трансформированных клеток (т.е. включивших привнесен-

ные гены). В качестве последних чаще всего используют гены устойчивости к антибио-

тикам или гербицидам.

Процедура клонирования фрагментов ДНК осуществляется следующим образом.

Первый этап включает разрезание кольцевой молекулы ДНК плазмиды, которую ис-

пользуют в качестве вектора клонирования. Плазмида, как правило, содержит два мар-

керных гена, например гены устойчивости к двум разным антибиотикам. Обычно ме-

сто расщепления плазмидной ДНК находится в пределах структурной последователь-

ности одного из ее маркерных генов. Такой же самой рестриктазой (желательно обра-

зующей «липкие» концы) разрезают ДНК, фрагменты которой предполагается клони-

ровать (донорной ДНК), и смешивают с «разрезанной» плазмидной ДНК. Поскольку

«липкие» концы этих двух ДНК взаимно комплементарны, они соединяются с образо-

ванием гибридных молекул. Процесс сшивки «закрепляют» путем добавления в рас-

твор фермента ДНК-лигазы фага Т4. В результате образуется смесь разных комбина-

ций плазмидной и донорной ДНК, а также такие нежелательные продукты, как слив-

шиеся фрагменты только донорной ДНК или восстановленные кольцевые молекулы

плазмидной ДНК. Их количество уменьшают с помощью специальных химических ме-

тодов (рис. 2.4).

Рекомбинантные плазмиды, содержащие встроенные фрагменты донорной ДНК,

далее вводят в клетку-хозяина, обычно E.coli. Для этого бактерии смешивают с раство-

ром плазмид, в который добавляют хлористый кальций, подвергают клетки нагрева-

нию. Тем не менее, эффективность трансформации (внедрения чужеродной ДНК в

клетку) остается невысокой: порядка одной клетки на тысячу. Что получается в резуль-

тате? Большинство бактериальных клеток остаются интактными. Небольшое количе-

ство клеток содержит различные рекомбинантные плазмиды. Могут также быть клет-

ки, содержащие те самые нежелательные продукты из предыдущего этапа: интактные

векторные плазмиды или фрагменты донорной ДНК. Судьба последних очевидна.

Бактерии быстро избавляются от чужеродной ДНК. Чужеродная ДНК, не имеющая

ГЛАВА ВТОРАЯ

сайта инициации репликации, не может реплицироваться в бактериальной клетке и

разрушается под действием эндонуклеаз.

Рис.2.4 Создание рекомбинантной плазмиды

Таким образом, задача сводится к тому, чтобы разделить первые три типа бакте-

риальных клеток. Для этого их последовательно высевают на питательные среды, со-

держащие антибиотики, являющиеся селективными агентами в нашем эксперименте.

Нетрансформированные клетки чувствительны к обоим антибиотикам, клетки с ин-

тактными плазмидами, напротив, устойчивы к обоим антибиотикам, а клетки с

реком-

бинантными плазмидами устойчивы только к тому антибиотику, ген устойчивости к

которому не поврежден в результате рестрикции и вставки фрагмента донорной ДНК.

Поскольку рекомбинантная плазмида содержит все необходимое для инициации реп-

ликации, то она может реплицироваться в бактериальных клетках, т.е. осуществлять

клонирование своей, а также встроенной в нее донорной ДНК.

Помимо бактериальных плазмид для целей клонирования генов применяют и

другие векторные системы: фаги (в них можно клонировать более длинные, нежели в

плазмидах, фрагменты донорной ДНК: до 20 т.п.н), плазмиды-космиды, содержащие

cos-участок генома фага, участвующий в упаковке ДНК в фаговую головку (в них мож-

но клонировать фрагменты ДНК до 40 т.п.н), а также так называемые искусственные

КАК ПОЛУЧАЮТ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ ОРГАНИЗМЫ

хромосомы на основе фага Р1 (можно клонировать фрагменты ДНК длиной 100—300

т.п.н.), на основе F-плазмиды E.coli (ВАС — бактериальная искусственная хромосома,

емкость 150—300 т.п.н.), дрожжей (YAC — дрожжевая искусственная хромосома, в ней

можно клонировать фрагменты эукариотической ДНК длиной порядка 800 т.п.н и бо-

лее). В качестве клеток-хозяев для клонирования генов кроме E.coli используют также

Bacillus subtilis, дрожжи Saccharomyces cerevisiae и др.

2.4. Выделение генов

С помощью набора разных рестриктаз получают многие тысячи фрагментов

ДНК, содержащих самые разнообразные гены. Каким образом в этой смеси найти и

выделить один-единственный фрагмент, который кодирует нужный нам ген, а также

регуляторные последовательности, необходимые для его функционирования в клетке?

Это один из наиболее сложных и дорогостоящих этапов генетической инженерии. Для

решения проблемы идентификации генов разработаны и успешно применяются мно-

гие методы, без которых эта задача оставалась бы практически неразрешимой. Так,

ученые научились определять последовательность аминокислот в белковых молекулах

и последовательность нуклеотидов в нуклеиновых кислотах ДНК и РНК. Разработаны

методы получения молекул ДНК, комплементарных определенным молекулам мРНК.

Более того, в настоящее время вполне рутинной процедурой стал химический синтез

отдельных генов! Большинство названных методов, а также радиоавтография, хеми-

люминесцентное маркирование, различные варианты гель-электрофореза, полиме-

разная цепная реакция и т.д. в полной мере используются для выделения и идентифи-

кации отдельных генов. В основе же самой процедуры идентификации генов лежит

хорошо известный нам принцип комплементарности нуклеотидов ДНК. Рассмотрим

подробнее, каким образом все это используется на практике.

Возможны два основных подхода в выделении гена: либо его синтезируют, либо

выбирают среди рестрикционных фрагментов геномной ДНК тот из них, который со-

держит нужный нам ген. Чаще всего эти подходы используют в различных сочетаниях

с учетом конкретной ситуации. А ситуации могут быть самые разнообразные. Есть ге-

ны и протеины — продукты генов, которые изучены очень хорошо, а есть такие, о ко-

торых практически ничего не известно. Прокариотические гены выделять в общем

проще, чем эукариотические, особенно в тех случаях, когда они расположены на плаз-

мидах: поле поиска намного уже. Большое

значение при выделении генов имеют сте-

пень и характер их экспрессии: проще выделять те из них, которые активно транскри-

бируются в каких-то определенных тканях, благодаря чему в клетках этих тканей пре-

обладает мРНК искомого гена. В любом случае выделение генов — сложный творче-

ский процесс, требующий от исследователя глубоких знаний

и владения широким ар-

сеналом современных методов.

2.4.1. Искусственный синтез генов. Чтобы синтезировать ген искусственно, необ-

ходимо знать его последовательность нуклеотидов. Понятно, что эта последователь-

ность должна соответствовать последовательности аминокислот в протеине, который

кодирует этот ген (продукте гена). Белки — продукты многих генов хорошо известны и

изучены, в том числе на предмет последовательности аминокислот в их молекулах.

Зная эту последовательность и имея под рукой таблицу генетического кода (см. табл.

1.1), можно определить последовательность нуклеотидов в мРНК и в ДНК, которая

должна при трансляции обеспечить синтез белковой молекулы именно с такой после-

довательностью аминокислот. Безусловно, искусственный ген не будет идентичен на-

туральному по той простой причине, что генетический код вырожденный: одной ами-

нокислоте может соответствовать несколько сочетаний из трех нуклеотидов. Следует

также иметь в виду, что гены высших организмов содержат некодирующие участки —

ГЛАВА ВТОРАЯ

интроны. Тем не менее важен результат: наш искусственный ген, если его заставить

работать, будет образовывать мРНК, с которой при трансляции будет синтезирован

протеин, идентичный натуральному.

Замечу, что все написанное выше не из области научной фантастики, а вполне

объективная реальность. Современные «автоматы-геносинтезаторы» способны при-

соединять один нуклео-

тид к синтезируемой

цепочке ДНК в течение

10-минутного цикла,

синтезируя фрагменты

ДНК длиной более ста

пар нуклеотидов. Таким

методом был синтези-

рован, в частности, хо-

рошо известный ген

проинсулина человека,

а также ряда других

протеинов — продуктов

современной биотехно-

логии.

Второй способ ис-

кусственного синтеза

гена основан на исполь-

зовании в качестве мат-

рицы его мРНК. В от-

дельных случаях мРНК

некоторых генов можно

выделить непосредст-

венно из клеток, в кото-

рых они могут быть в

большом количестве.

Так, например, в эрит-

роцитах млекопитаю-

щих содержится боль-

шое количество мРНК

α- и β-глобинов.

Соответствующие

мРНК выделяют, тща-

тельно очищают и ис-

пользуют для синтеза

комплементарной ДНК

с помощью фермента обратной транскриптазы, или ревертазы. Этот фермент был вы-

делен из РНК-содержащих онкогенных вирусов. Для начала полимеразной цепной ре-

акции ферменту нужна «затравка» (праймер) в виде небольшого отрезка двухцепочеч-

ной молекулы. Эукариотические мРНК содержат, как правило, на своем 3’-конце так

называемый поли-А хвост, последовательность, состоящую из остатков аденина (см.

главу 1). Если к мРНК добавить искусственно синтезированные короткие олигонуклео-

тиды, состоящие из остатков тимина (поли-Т), они будут в силу комплементарности

соединяться (гибридизоваться) с поли-А, образуя двойную цепочку, которая и необхо-

дима для инициации ферментативной реакции полимеризации ДНК нуклеотидов. В

Рис.2.5. Получение кДНК с РНК-матрицы с помощью фермента обрат-

ной транскриптазы (по Уотсон и др., 1986). А - к эукариотической

мРНК, содержащей поли-А хвост, добавляют праймер поли-Т (Poly-dT).

комплементарный поли-А; Б - праймер соединяется с поли-А; В - в при-

сутствии фермента обратной транскриптазы происходит синтез моле-

кулы ДНК, комплементарной мРНК

; Г - РНК удаляют с помощью рас-

твора щелочи; Д - шпилька служит праймером для синтеза комплемен-

тарной нити ДНК в присутствии фермента ДНК полимеразы I; E -

шпильку удаляют с помощью фермента S1-нуклеазы: получают к ДНК.

Poly-dT

Обратная

транскриптаза

NaOH

Шпилька

ДНК-полимераза I

S1-н

клеаза

мРНК

Праймер

мРНК

ДНК

кДНК

КАК ПОЛУЧАЮТ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ ОРГАНИЗМЫ

результате образуется гибридная двухцепочечная РНК-ДНК молекула. Далее мРНК

отщепляют от указанной молекулы с помощью NaOH (причем нить ДНК не поврежда-

ется). После этого остается одноцепочечная молекула ДНК, на конце которой имеется

так называемая «шпилька» (короткий отрезок двухцепочечной ДНК), служащая «за-

травкой» для синтеза второй цепи ДНК под действием фермента ДНК-полимеразы I.

«Шпильку» удаляют с помощью фермента S1-нуклеазы, деградирующей одноцепо-

чечные ДНК. В конце концов, получается двухцепочечная молекула ДНК. Одна из ни-

тей ее комплементарна исходной мРНК. Такую ДНК называют кДНК (комплементар-

ная ДНК), и она, в общем, соответствует структурному гену, с которого транскрибиро-

валась мРНК. Разумеется, она не будет содержать интроны, которые могли быть у на-

турального гена (рис. 2.5).

Полученную кДНК с помощью технологии рекомбинантных ДНК можно соеди-

нить с соответствующими регуляторными элементами, встроить в векторную плазми-

ду и перенести в клетки бактерий, где они будут реплицироваться и экспрес-

сироваться. По их продукту можно будет окончательно убедиться, ту ли, нужную нам,

мРНК мы выделили. Гены, синтезированные описанным способом, были использованы

при создании генно-инженерных промышленных микроорганизмов, вырабатываю-

щих инсулин, соматотропин (гормон роста), интерфероны, иммуноглобулины и дру-

гие протеины, необходимые для производства различных фармацевтических препара-

тов.

2.4.2. Выделение генов из смеси рестрикционных фрагментов геномной ДНК. Для

выделения нужного гена из смеси рестрикционных фрагментов используют меченые

зонды — фрагменты ДНК, комплементарные искомым генам или отдельным их час-

тям. Зонды метят с помощью радиоактивного фосфора или хемилюминесцентных ме-

ток. В основе метода лежит свойство одноцепочечных молекул ДНК соединяться (гиб-

ридизоваться) в случае их комплементарности.

Чтобы перевести молекулу ДНК в одноцепочечную форму, ее подвергают тепло-

вому воздействию или обработке щелочью. В этих условиях водородные связи между

основаниями разрываются и цепи расходятся (процесс денатурации ДНК). Если теперь

медленно снизить температуру, то произойдет их восстановление (ренатурация). Од-

нако если при этом в растворе присутствует одноцепочечный ДНК-зонд, он тоже будет

ренатурировать с ДНК, специфически связываясь с комплементарными участками.

Нужный ген может быть выделен до процедуры клонирования смеси рестрикци-

онных фрагментов геномной ДНК или после нее. В первом случае фрагменты ДНК,

полученные после обработки рестриктазами, разделяют в соответствии с их размерами

с помощью электрофореза в агарозном геле (см. выше). Поскольку проводить описан-

ные выше процедуры гибридизации ДНК с зондами в геле невозможно, ДНК после

электрофореза переносят на более подходящие для этих целей носители: нитроцел-

люлозную или нейлоновую мембрану. Фрагменты ДНК прочно связываются с ней и не

могут изменять свое положение, например, из-за диффузии. Процедуру переноса

фрагментов ДНК с агарозного геля на нитроцеллюлозные мембраны и проведения

гибридизации с зондами разработал Э. Саузерн [Southern, 1975]. Благодаря простоте и

высокой эффективности этот метод нашел исключительно широкое применение в

генно-инженерных исследованиях. Его название — Саузерн-блоттинг, можно сказать,

стало нарицательным. Два других аналогичных метода, в которых используются РНК

и белки, получили названия соответственно нозерн-блоттинг (северный блоттинг) и

вестерн-блоттинг (западный блоттинг), что является игрой слов (Саузерн (southern) —

южный).

Саузерн-блоттинг проводят следующим образом (рис. 2.6). Двунитчатую ДНК на

агарозном геле денатурируют, чтобы образовались однонитчатые молекулы, с помо-

ГЛАВА ВТОРАЯ

щью NaOH. Затем агарозный гель помещают на влажную губку, расположенную в кю-

вете с раствором щелочи, сверху кладут нитроцеллюлозный фильтр, потом несколько

слоев сухой фильтровальной бумаги и весь этот сэндвич прижимают грузом. Сухая

фильтровальная бумага начинает «втягивать» влагу из расположенных ниже слоев.

Создается поток щелочи снизу вверх из губки через гель, нитроцеллюлозную мембра-

ну к фильтровальной бумаге. Этим потоком фрагменты ДНК вымываются из геля и

закрепляются на нитроцеллюлозе именно в той последовательности, как они располо-

жились после электрофореза. Однонитчатые фрагменты ДНК фиксируют на нитро-

целлюлозной мембране с помощью нагревания. На ней и проводят гибридизацию с

меченым ДНК-зондом.

Рис.2.6. Блоттинг ДНК по Саузерну.

В случае, если зонд «находит» комплементарный ему фрагмент ДНК, происходит

их связывание. Местоположение связавшегося зонда определяют, приложив к нитро-

целлюлозной мембране рентгеновскую пленку, в которой под действием радиоактив-

ного излучения из бромида серебра образуется металлическое серебро. Засвеченные

участки, соответствующие радиоактивным зонам, наблюдаются визуально после про-

явления пленки. При использовании хемилюминесцентных

меток их местоположение

определяют в ультрафиолетовом или лазерном свете.

Теперь, чтобы выделить нужный нам фрагмент ДНК, повторно проводят элек-

трофорез рестрикционных фрагментов ДНК или берут второй гель, если электрофо-

рез проводился одновременно в двух гелях. Этот гель, который не подвергался ДНК-

ДНК гибридизации, имеет интересующий нас сегмент в том же

месте, что и в проана-

лизированном с помощью ДНК-зонда геле. Сегмент вырезают из геля и извлекают из

него ДНК, которую можно далее клонировать, как описано выше.

2.4.3. Выделение генов из клонотеки. ДНК-ДНК гибридизацию применяют и для

выделения искомых фрагментов ДНК после того, как они были клонированы. Этот

подход получил

название «дробовик» (shortgun), его суть состоит в создании и изуче-

нии так называемой геномной библиотеки, или клонотеки генов. Библиотека пред-

ставляет собой чашки Петри с большим количеством колоний бактерий, клетки кото-

рых содержат рекомбинантные плазмиды со встроенными в них разными рестрикци-

онными фрагментами ДНК. В данном случае электрофорез и Саузерн-блоттинг

не

требуются, поскольку фрагменты ДНК разделены пространственно по разным коло-

ниям бактерий-хозяев. Эти колонии переносят непосредственно на нитроцеллюлоз-

ный фильтр, размещая их в определенном порядке. При подготовке проб к анализу

Груз

Сухая фильтровальная

бумага

Нитроцеллюлозный

фильтр

Агарозный гель

Губка

Кювета с раствором

щелочи

Направление движения раствора

щелочи с фрагментами ДНК

КАК ПОЛУЧАЮТ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ ОРГАНИЗМЫ

проводят лизис бактериальных клеток и денатурацию содержащейся в них ДНК. Затем

осуществляют гибридизацию с меченым зондом и определяют, таким образом, в какой

колонии клонирован интересующий нас фрагмент ДНК. Описанный метод получил

название дот-блоттинга (dot—точка, пятнышко).

При выделении генов как из клонотек, так и из смеси разделенных с помощью

электрофореза рестрикционных фрагментов ДНК следует иметь в виду, что положи-

тельный гибридизационный сигнал может быть получен для нескольких клонов (или

полос электрофоретического спектра). Объяснить это несложно: рестриктаза могла

внести несколько разрезов по длине гена, или в результате частичного гидролиза обра-

зовались фрагменты ДНК, содержащие искомый ген, разной длины. В связи с этим не-

обходимо определить, какой именно клон или фрагмент ДНК содержит ген целиком.

С помощью гель-электрофореза и картирования каждого выделившегося фраг-

мента ДНК (вставки) идентифицируют аналогичные фрагменты или фрагменты с пе-

рекрывающимися последовательностями. Проводят сшивку отдельных коротких

фрагментов и клонирование полученных последовательностей с тем, чтобы составить

полный ген. Если вставка анализируемой ДНК в каком-либо из клонов достаточно ве-

лика и вполне может содержать весь ген, осуществляют ее секвенирование (т.е. опреде-

ляют последовательность нуклеотидов), чтобы найти старт- и стоп-кодоны и убедиться

в наличии полноразмерной нуклеотидной последовательности, кодирующей искомый

белок. Результаты этого анализа позволяют также наметить план дальнейшей моди-

фикации выделенного фрагмента ДНК. Ведь для целей генетической инженерии важ-

но иметь фрагмент ДНК, не содержащий «лишних» последовательностей, которые не

имеют отношения к нужному нам гену.

2.4.4. Создание зондов. При создании зондов наибольшую трудность представляет

подбор нужного фрагмента ДНК или РНК. Наиболее простой метод состоит в исполь-

зовании ранее клонированных и идентифицированных генов, можно даже близкород-

ственных видов (гетерологичный зонд). В последнем случае условия гибридизации

нужно подбирать таким образом, чтобы она могла происходить при существенном

расхождении в последовательности искомой ДНК и зонда.

Зонд можно получить с помощью химического синтеза, основываясь на известной

аминокислотной последовательности протеина — продукта искомого гена. Выбирают

небольшую часть белковой молекулы длиной 5—6 аминокислот. В соответствии с по-

следовательностью этих аминокислот определяют все возможные последовательности

нуклеотидов в том участке мРНК, который кодирует данную область белковой моле-

кулы. Затем из радиоактивно меченных нуклеотидов синтезируют соответствующие

олигонуклеотиды длиной не менее 16 звеньев, один из которых будет полностью ком-

плементарен участку искомого гена.

Для зонда можно также использовать препараты мРНК или кДНК, полученные

описанным выше способом. Вообще получение большого количества разнообразных

кДНК, создание клонотек кДНК, их изучение имеет в генетической инженерии боль-

шое значение. По сравнению с клонотеками рестрикционных фрагментов, большин-

ство из которых может и не содержать отдельных генов или содержать только их части,

библиотеки кДНК имеют несомненное преимущество. Ведь в случае с кДНК речь, по

сути, идет о последовательностях, кодирующих, образно говоря, гены в чистом виде,

без посторонних нежелательных примесей.

Главная задача — идентифицировать эти гены. Наиболее надежный способ ре-

шения задачи — добиться экспрессии (т.е. транскрипции и образования протеина —

продукта гена) клонированной кДНК в клетке-хозяине. Для этих целей используют

специальные клонирующие векторные плазмиды (экспрессирующие векторы), у кото-

рых место встраивания клонируемой ДНК расположено непосредственно за промото-

ГЛАВА ВТОРАЯ

ром, захватывая лишь несколько нуклеотидов прокариотического гена. Как указыва-

лось выше, бактерии в природе не могут экспрессировать эукариотические гены. Но в

случае с данными плазмидами эукариотический ген становится как бы частью прока-

риотического гена со своим промотором. В результате активности такого гибридного

гена в бактерии образуется рекомбинантный эукариотический белок, имеющий лишь

несколько аминокислот, кодируемых прокариотическим геном.

Для идентификации же эукариотического протеина используют метод, анало-

гичный дот-блоттингу, в котором в качестве зонда применяют меченые антитела оп-

ределенных известных белков (метод получил название вестерн-блоттинг).

2.5. Методы переноса генов в живые клетки

Выше в общих чертах описана методика введения рекомбинантных плазмид в

клетки бактерий Е.coli для клонирования генов. Однако клетки животных и особенно

растений существенно отличаются от бактериальных по своей способности поглощать

чужеродную ДНК. Так, растительные клетки имеют жесткие целлюлозные оболочки,

преодолеть которые весьма непросто. В связи с этим вопросы разработки методов пе-

реноса генов в живые клетки всегда были и остаются в центре внимания специалистов

в области генетической инженерии. Несмотря на весьма впечатляющие достижения в

их решении, остается много проблем, касающихся, например, сайт-специфического

встраивания трансгенов в ДНК высших организмов, повышения эффективности пере-

носа трансгенов для многих видов и т.д. Ниже описаны основные методы переноса ге-

нов в живые клетки, которые в настоящее время применяют в генно-инженерных ра-

ботах.

2.5.1. Перенос генов в клетки бактерий. Чтобы обеспечить проникновение в клет-

ки бактерий рекомбинантных ДНК, бактерии обрабатывают ледяным раствором

СаСl

, а затем выдерживают 1,5 минуты при 42° С. В результате, происходит локальное

разрушение клеточной стенки и чужеродная ДНК получает возможность попасть

внутрь клетки. Максимальная частота трансформации при использовании этого мето-

да около 10

-3

, т.е. 1 клетка на 1000, что соответствует образованию 107— 108 трансфор-

мантов на 1 мкг добавленной ДНК. Клетки, способные поглощать чужеродную ДНК,

называют компетентными. Долю компетентных клеток можно повысить, используя

специальные питательные среды или варьируя условия культивирования бактерий.

Впрочем, существуют некоторые виды бактерий, которые обладают этим свойством

изначально. Но есть и такие, которые не

реагируют на химические индукторы компе-

тентности. Поэтому приходится использовать другие методы повышения компетент-

ности. Один из них — электропорация.

Электропорация — воздействие на клетки бактерий электрическим током, в ре-

зультате которого в клеточной стенке образуются временные поры, через которые

ДНК может проникать внутрь клетки. Условия ее различаются для разных видов бак-

терий. При

работе с E.coli клеточную суспензию и ДНК помещают в сосуд с погружен-

ными в него электродами и дают единичный импульс постоянного тока длительно-

стью 4,5 мс. После такой обработки эффективность трансформации E.coli повышается

до 109 трансформантов для мелких плазмид (около 3 т.п.н.) и до 106 — для больших,

например BACs (около 135 т.п.н.).

Для трансформации низкокомпетентных видов бактерий иногда используют ес-

тественные механизмы переноса генов, в частности конъюгацию — «половой» процесс,

сопровождающийся переносом генов от одной бактерии к другой при их физическом

контакте. Для этого в клетки бактерий, несущие нужные нам рекомбинантные плаз-

миды, вводят плазмиду, повышающую их конъюгативную способность.

КАК ПОЛУЧАЮТ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ ОРГАНИЗМЫ

Рис. 2.7. Два способа интеграции клонированного в плазмиде гена в бактериальную хромосому (по Глик,

Пастернак, 2002). А – ген встроен в середину клонированного в плазмиде сегмента ab, гомологичного

сегменту a’b’ хромосомной ДНК. В результате двойного кроссинговера клонированный ген оказывается

в составе хромосомы. Б – ген встроен вблизи клонированного в плазмиде сегмента с, гомологичного сег-

менту

с’ хромосомной ДНК. В результате одиночного кроссинговера (х) происходит интеграция в хро-

мосому всей плазмиды вместе с включенным в нее геном

При получении промышленных генно-инженерных микроорганизмов трансгены

обычно вводят в составе клонирующих векторных плазмид, способных самостоятельно

реплицироваться в бактериальной клетке. Число копий таких плазмид на клетку мо-

жет достигать 100 и более. Это обеспечивает суперпродукцию протеина — продукта

введенного гена. Однако надо иметь в виду, что такие многокопийные плазмиды тре-

буют много

энергии, что не выгодно клетке-хозяину. В результате часть клеток в про-

цессе роста популяции может «терять» рекомбинантные плазмиды. Клетки, лишив-

шиеся плазмид, обычно растут быстрее тех, у которых они сохранились, и в конечном

итоге их доля в популяции становится преобладающей. Понятно, что все эти процессы

неблагоприятно сказываются на эффективности производства

продукта трансгена.