Ермишин А.П. Биотехнология. Биобезопасность. Биоэтика

Подождите немного. Документ загружается.

ГЛАВА ВТОРАЯ

Кардинально решить эту проблему можно путем встраивания трансгена в хромо-

сому бактериальной клетки с помощью методов генетической инженерии. Для этого в

хромосоме бактерии выбирают последовательность, которая может быть повреждена

без ущерба для жизненно важных функций клетки. В нее и встраивают нужный нам

ген со всеми необходимыми для его работы регуляторными элементами. Чтобы осуще-

ствить встраивание трансгена именно в это место, будущий сайт интеграции выделяют

из хромосомной ДНК и клонируют (для интеграции в нужный сайт вводимый ген

должен содержать не менее 50 нуклеотидов хромосомной ДНК). Затем фрагменты ука-

занной ДНК этого сайта переносят в векторную плазмиду, которую конструируют для

переноса нужного нам трансгена таким образом, чтобы она располагалась впереди и

сзади трансгена, как говорят генетики, фланкировала его. Векторная плазмида в дан-

ном случае несколько отличается от тех, которые используются доя клонирования ге-

нов. Она не должна обладать способностью самостоятельно реплицироваться в клетке-

хозяине.

После трансформации бактерии такой рекомбинантной плазмидой, несущей

нужный нам трансген, фланкированный последовательностями ДНК хромосомного

сайта интеграции, происходит спаривание этих последовательностей с гомологичны-

ми последовательностями бактериальной хромосомы. Далее благодаря естественному

процессу генетической рекомбинации (процесс кроссинговера) под действием соответ-

ствующих ферментов клетки-хозяина происходит включение фрагмента ДНК, содер-

жащего трансген, в бактериальную хромосому (рис. 2.7).

Число копий встроенного в хромосому бактерии трансгена можно увеличить с

помощью методов традиционной селекции микроорганизмов. Как показали экспери-

менты, десяток копий трансгена, встроенного в бактериальную хромосому, мог обес-

печивать более высокую выработку протеина — продукта трансгена, чем 20— 40 копий

этого гена в составе многокопийной плазмиды.

2.5.2. Перенос генов в клетки животных. Ученые уже достаточно длительное вре-

мя используют в своих исследованиях культивируемые in vitro дифференцированные

клетки (полученные из разных тканей) человека и животных. Введение в них чужерод-

ной ДНК ненамного сложнее, чем в клетки бактерий. Но поскольку в настоящей книге

речь идет прежде всего о методах создания генно-инженерных организмов, то методы

введения генов в культивируемые клетки животных рассматриваться не будут, так как

получить из них живой трансгенный организм невозможно в принципе.

Первый успех в трансформации животных относится к 1980 году [Gordon et al.,

1980], когда была продемонстрирована возможность введения и интеграции чужерод-

ной ДНК в геном мышей. Важно, что интеграция была стабильной и трансгены сохра-

нялись у потомства, правда, не экспрессировались. Уже через два года были получены

трансгенные мыши с активным чужеродным геном гормона роста [Palmitier et al.,

1982]. В этих первых экспериментах и во многих последующих использовался метод

микроинъекции ДНК в пронуклеус (ядро) эмбриона на стадии одной клетки (зиготы).

Метод весьма сложный и деликатный. Он требует наличия сложнейшей микроскопи-

ческой техники и микроманипуляторов. Эмбриональную клетку закрепляют в микро-

капилляре, чей внешний диаметр немного меньше диаметра клетки. Затем с помощью

другого микрокапилляра протыкают оболочку клетки и ядра и впрыскивают в него

трансгенную ДНК (рис. 2.8). Эмбриональную клетку имплантируют в матку суррогат-

ной матери, где происходит развитие эмбриона.

С помощью описанного метода получены генно-инженерные крысы, кролики,

овцы, свиньи, козы, телята и другие млекопитающие. Однако этот метод не только

очень сложный, но и дорогостоящий. Его эффективность для всех перечисленных жи-

КАК ПОЛУЧАЮТ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ ОРГАНИЗМЫ

вотных, особенно жвачных, намного ниже, чем для мышей. Использовать его для мас-

сового производства трансгенных животных экономически невыгодно.

Рис.2.8 Схема трансгеноза животных с помощью микроинъекций ДНК

Микроинъекции чужеродной ДНК в пронуклеусы птиц сильно затруднены из-за

их непрозрачности. То же касается и большинства низших позвоночных, например

рыб. Поэтому для этих видов проводят инъекцию ДНК в цитоплазму эмбриональных

клеток, что резко снижает эффективность метода из-за разрушающего действия эндо-

нуклеаз на введенные гены. Тем не менее, с помощью данной разновидности метода

микроинъекций ДНК удалось получить трансгенные генотипы у кур, нескольких ви-

дов рыб, некоторых морских беспозвоночных.

Несколько лет назад получены первые обнадеживающие результаты в примене-

нии альтернативного подхода в трансформации животных, основанного на использо-

вании не одноклеточных эмбрионов, а половых клеток (гамет). Инкубация изолиро-

ванных сперматозоидов в

растворе чужеродной ДНК с последующим использованием

их для оплодотворения in vivo или in vitro позволила получить генно-инженерные ор-

ганизмы у нескольких видов животных [см. Houdebine, 2001]. Однако результативность

этого метода оказалась очень низкой. Более того, отмечены случаи модификации или

дезактивации вводимых трансгенов под действием эндонуклеаз.

Для повышения эффективности этого метода предлагается использовать обра-

ботку

сперматозоидов детергентами, которые повреждают их мембраны. В результате

ДНК легко проникает в сперматозоиды, что позволяет повысить степень ее включения

в геном. Правда, сперматозоиды после такой обработки теряют способность оплодо-

творять яйцеклетки, поэтому приходится применять их инъекцию в цитоплазму ооци-

тов. В целом подход недостаточно эффективен для многих видов.

2.5.3. Перенос генов

в клетки растений. Характерной особенностью растительных

клеток является наличие вокруг них жесткой целлюлозной оболочки, которую не про-

ткнешь никакими микрокапиллярами. Поэтому для их трансформации используют

специфические методы. И все же с целью обеспечения возможности применения

обычных для микробов и животных клеток методов трансформации разработаны эф-

Микрокапилляр с

раствором ДНК

Микрокапилляр

ля удерживания

яйцеклетки

Деление клетки

Перенос трансформированной

яйцеклетки приемной матери

Развитие трансформированной яйце-

клетки и рождение детенышей

Оценка детенышей на

наличие т

ансгена

ГЛАВА ВТОРАЯ

фективные способы ферментативного растворения целлюлозных оболочек. В резуль-

тате получают так называемые протопласты, способные при определенных воздейст-

виях (химических и электрических) сливаться между собой, а также интегрировать чу-

жеродную ДНК.

Для трансформации растительных протопластов применяют хорошо известные

по бактериям методы стимуляции этого процесса с помощью СаСl

, а также полиэти-

ленгликоля. Очень эффективным методом оказалась и электропорация. Весьма пер-

спективной рассматривается методика введения чужеродной ДНК в протопласты с

помощью микроинъекций. Созданы даже компьютерные системы, соединенные с

микроскопом, обеспечивающие достаточно легкое обнаружение, прикрепление и пе-

ремещение отдельных протопластов и микрокапилляров, через которые вводят ДНК в

клетку.

Однако основная

проблема в трансформации протопластов растений — возмож-

ность использовать ее лишь для ограниченного числа видов растений, для которых

разработаны эффективные методы выделения, культивирования протопластов и по-

лучения из них растений-регенератов (подробнее об этом ниже).

Среди методов прямого переноса генов в растительные клетки наибольшее рас-

пространение получил метод биологической баллистики (биолистики), или

, как его

еще называют, бомбардировки частицами (particle bombardment), генного дробовика

(gene gun technique). Суть метода заключается в том, что на мельчайшие частицы (диа-

метром 0,4—1,7 мкм) из вольфрама или золота напыляют рекомбинантные ДНК, со-

держащие предназначенные для переноса гены с необходимыми регуляторными эле-

ментами. Эти частицы разгоняют до огромной скорости (300—600 м/с) в специальном

пневматическом аппарате («генной пушке») и помещают на их пути растительные

ткани (меристемы, незрелые зародыши, колеоптили, протокормы, пыльцу) либо куль-

туры клеток (каллюс или суспензию клеток). В результате частицы проникают в клет-

ки, а чужеродная ДНК встраивается в ДНК хромосом или органелл (рис. 2.9). Несмотря

на ряд недостатков (нежелательная для трансформации растений многокопийность

вставок, разрушение части вносимых генных конструкций и др.), метод биолистики

является основным для получения трансгенных однодольных растений, среди которых

все злаковые культуры, а также многих двудольных растений, являющихся некомпе-

тентными или слабо компетентными для основного метода введения генов в расти-

тельные клетки — агробактериальной трансформации.

Агробактериалъная трансформация. Раскрытие природы агробактериальной

трансформации по праву считается одним из величайших открытий XX века. Оно дало

возможность использовать в генетической инженерии уникальный природный меха-

низм горизонтального переноса генов (т.е. переноса генов между отдаленными в сис-

тематическом отношении видами организмов). Учитывая большое значение агробак-

териальной трансформации при получении генно-инженерных растений, авторы на-

стоящей книги сочли необходимым подробно изложить современные представления о

механизме этого процесса (по Mlynarova, Nap, 1997; Zupan et al., 2000). Это также долж-

но способствовать лучшему пониманию генетических особенностей ГИО, полученных

с помощью данного метода, их отличий от исходных форм.

Онкологическое заболевание растений — корончатый галл — издревле известно

людям (его упоминание имеется еще в трудах Аристотеля). Этой болезни, имеющей

серьезные агрономические последствия из-за нарушения нормального роста растений,

подвержены многие двудольные растения: виноград, косточковые фруктовые деревья,

розы и др.

КАК ПОЛУЧАЮТ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ ОРГАНИЗМЫ

Рис. 2.9. Метод введения ДНК в клетки растений с помощью биолистики (по Helenius

et al., 2000). А - внешний вид «генной пушки» Helios™ Gene Gun фирмы BioRad. Б -

«обстрел» листьев из «генной пушки». В - результаты «обстрела»: пятна на листьях -

экспрессия репортерного гена gus в трансформированных клетках. Г - регенерация

растений из каллюса, полученного из обработанных листьев.

В начале прошлого века установлен возбудитель заболевания — почвенные бак-

терии из рода Agrobacterium: A.tumefaciens (вызывает у растений образование опухоли —

корончатого галла), A.rhizogenes (вызывает образование на стебле растений многочис-

ленных корней — hairy root), A.rubi (возбудитель галлов у тростника). Однако только в

1970-х годах удалось раскрыть механизм патогенеза. В 1974 году Van Lareke с сотр. и

Zaenen с сотр. установили, что у вирулентных штаммов почвенных бактерий в отличие

от невирулентных имеется большая плазмида, получившая название Ti (tumor inducing

— индуцирующая опухолеобразование) у A. tumefaciens и Ri (root inducing — индуци-

рующая образование корней) — у A.rhizogenes.

В ходе дальнейшего изучения этих плазмид выяснилось, что опухоль возникает в

результате необратимого переноса и включения определенного фрагмента (Т

-ДНК,

т.е. переносимой ДНК) плазмиды в хромосомную ДНК растительной клетки [Chilton et

al., 1977]. Причем гены, расположенные на Т-фрагменте ДНК бактериальной плазми-

ды, активно экспрессируются в растительной клетке, что выражается в синтезе боль-

шого количества специфических соединений опинов — октопинов и нопалинов при

заражении A. tumefaciens или агропинов при заражении A. rhizogenes. Помимо этих со-

единений в клетках образуются в повышенных концентрациях различные фитогормо-

ны, резко стимулирующие ростовые процессы, что приводит к образованию опухоли.

Опины, экскретируемые инфицированными клетками, служат источником азота, уг-

лерода и энергии для возбудителей заболевания — агробактерий, поскольку у них на

ГЛАВА ВТОРАЯ

Ti-плазмиде имеются гены, кодирующие ферменты, необходимые для катаболизма

этих соединений. Как видим, агробактерии создали для себя весьма уютную экологи-

ческую нишу, в которой у них практически нет конкурентов.

Процесс агробактериальной трансформации инициируется прежде всего повре-

ждением растения, например, механическим путем при вспашке, прополке и т.п. По-

раненные клетки выделяют в окружающую среду различные химические соединения,

которые привлекают агробактерий (положительный хемотаксис). Бактерии прикреп-

ляются к растениям в местах поранения с помощью целлюлозных фибрилл, что пре-

дохраняет их от смывания, например, при дожде. В генетическом контроле описанных

начальных этапов агробактериальной трансформации в основном задействованы ге-

ны, расположенные на хромосоме бактерии. Их активность определяет все многообра-

зие взаимодействий между бактерией и растением, включая распознавание растения-

хозяина (определенные штаммы агробактерий могут трансформировать определен-

ные виды растений) (рис. 2.10).

Однако в генетическом контроле собственно переноса Т-ДНК главными являются

гены, расположенные в vir-области Ti-плазмиды (vir-гены плазмиды). Правда, некото-

рые хромосомные гены могут влиять на активность плазмидных vir-генов. Она инду-

цируется сигнальными молекулами химических соединений, выделяемых растениями

при поранении: фенольными соединениями типа ацетосирингона и альфа-

гидрооксиацетосирингона (у табака), предшественниками лигнина, синапиновой ки-

слотой, кониферилалкоголем или некоторыми флавоноидами. Для индукции vir-генов

существенным является также наличие таких факторов, как кислая среда, легко ката-

болизируемые источники углерода, например сахароза или моносахариды, темпера-

тура ниже 30°С.

Плазмидные vir-гены расположены на одном регулоне размером около 40 т.п.н.,

который занимает место отдельно от Т-области. У октопиновых штаммов агробактерий

vir-регулон содержит не менее 10 идентифицированных vir-локусов, которые состоят

из нескольких генов, обозначаемых virA, virB и т.д. до virJ. У нопалиновых штаммов аг-

робактерий в аналогичном регулоне обнаружено семь локусов.

Индуцирующий сигнал соединений, выделяемых растениями при поранении,

воспринимается протеинами — продуктами генов virA и virG. Протеин VirA является

трансмембранным и имеет короткий периплазматический связывающий домен (место

прикрепления определенных молекул) — N-терминал, который воспринимает сигна-

лы от растительных фенольных соединений, и длинный цитоплазматический район

— так называемый С-терминал. С-терминал обладает автофосфорилирующей актив-

ностью и способен активировать путем фосфорилирования протеин VirG. Активиро-

ванный VirG является протеином, способным связываться с ДНК. Он распознает соот-

ветствующие регуляторные последовательности других плазмидных vir-генов и спосо-

бен активировать их транскрипцию.

Активация экспрессии vir-генов под действием VirG приводит к запуску ряда по-

следовательных взаимосвязанных событий, которые обеспечивают подготовку Т-ДНК к

переносу в растительную клетку. Первый этап включает сайт-специфическое выреза-

ние кодирующей нити Т-ДНК протеинами — продуктами генов virD. Полипептид

VirD2 в присутствии протеина VirD1 распознает специфические последовательности

Т-ДНК, состоящие из 25 п.н., расположенные в начале и конце Т-области, и производит

вырезание кодирующей нити ДНК. Эти последовательности получили название соот-

ветственно левый (LB) и правый (RB) края Т-области. Они играют исключительно важ-

ную роль в процессе переноса Т-ДНК из бактериальной клетки в растительную.

КАК ПОЛУЧАЮТ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ ОРГАНИЗМЫ

Рис. 2.10. Агробактериальная трансформация (по Mlynarova, Nap, 1997) (пояснения в тексте):

1 – vir-область Ti-плазмиды; 2 – Т-область Ti-плазмиды (Т-ДНК); 3 – Т-нить; 4 – Т-комплекс;

5 – продукты vir-генов бактериальной хромосомы

Вырезанная кодирующая нить Т-ДНК реплицируется, в результате чего образует-

ся однонитчатая ДНК (ssDNA), названная Т-нитью. Точно известно, что именно такая

однонитчатая Т-ДНК переносится в растительную клетку. После вырезания Т-ДНК

VirD2 остается ковалентно связанным с 5’-концом Т-нити и действует как направляю-

щий протеин при движении образовавшегося комплекса

из бактериальной клетки в

растительную, а также предохраняет 5-’конец от действия эндонуклеаз. Этот комплекс

включает также VirE2, который плотно покрывает Т-нить по всей длине, предохраняя

ее от деградации.

Перенос Т-комплекса через мембраны бактериальной и растительной клеток

происходит, как полагают, при участии протеинов — продуктов генов virB. Протеины

VirB формируют так называемый

трансмембранный поровый комплекс, который ус-

танавливает связь между наружной и внутренней мембранами бактериальной клетки

и через который происходит перемещение Т-комплекса. Протеины VirB4 и VirB11 яв-

ляются связанными с мембранами АТФазами, что говорит об активности процесса пе-

реноса Т-комплекса, который осуществляется с затратой энергии. Перемещение Т-

комплекса в цитоплазме растительной клетки к ядру также является активным процес-

сом. Предполагается, что протеины VirD2, а также, возможно, и VirE2 «узнаются» в ци-

топлазме растительной клетки специальными эндогенными протеинами, обеспечи-

вающими доставку Т-комплекса к ядру.

бактериальная хромосома

Ti плазми-

да

фенольные соединения

активация

индукция

ядерная пора

встроенная

Т-ДНК

яде

ная

НК

ядро

клеточная стенка

цитоплазма

растительная

клетка

Agrobacteriun tumefaciens

ГЛАВА ВТОРАЯ

Интеграция Т-ДНК в геном растения завершает процесс ее переноса. Анализ по-

следовательностей ДНК вокруг места вставки показал, что этот процесс не является

сайт-специфичным и не требует высокой степени гомологии. То есть встраивание Т-

ДНК происходит не в строго определенные места (сайты) растительного генома, а в

значительной степени случайно. Тем не менее, отмечено, что «вставки» чаще оказыва-

ются в области транскрипционно активного хроматина, в частности вблизи теломер

хромосом растений. Обычно встраивается одна или несколько копий Т-ДНК в одном

или нескольких местах растительного генома. Нередко встраивание Т-ДНК не проис-

ходит вообще.

Интеграция Т-ДНК в геном растения сопровождается делецией небольшого уча-

стка растительной ДНК (10—100 п.н.). Это говорит о том, что 5’- и З’-концы Т-ДНК

располагаются в процессе встраивания недалеко друг от друга и данный процесс

предполагает участие ферментов эксцизионной репарации. Механизмы встраивания

разных концов Т-ДНК в растительный геном различаются. Вставка 5’-конца обеспечи-

вается протеином VirD2. По-видимому, этот протеин создает благоприятный субстрат

для лигаз клеток растений. Интеграция же 3’-конца в значительной степени аналогич-

на процессу незаконной рекомбинации. После встраивания концов Т-ДНК в одну из

нитей ДНК растения происходит дупликация комплементарной нити Т-ДНК.

В случае если встраивание Т-ДНК прошло без осложнений, гены, расположенные

на ней, стабильно экспрессируются. Так называемые onc-гены (онкогенные) определя-

ют сверхпродукцию фитогормонов индолилуксусной кислоты (ауксина) и цитокини-

нов, что вызывает неконтролируемый рост и деление трансформированных клеток. В

результате образуется корончатый галл. Интересно, что клетки корончатого галла спо-

собны расти в культуре in vitro на питательной среде без фитогормонов, поскольку они

способны обеспечить ими себя самостоятельно. Активность другой группы генов, рас-

положенных на Т-ДНК, связана с образованием опухолеспецифичных метаболитов —

опинов (октопинов, нопалинов, агропинов).

Как видно из представленного описания агробактериальной трансформации, ни

онкогены, ни гены, кодирующие образование опинов, в самом процессе переноса Т-

ДНК из агробактерии в клетку растений активной роли не выполняют. В этом процес

се существенную роль играет лишь крайне незначительная часть Т-ДНК, представлен-

ная левым и правым краями из 25 п.н. Если удалить ту часть Т-ДНК, которая располо-

жена между ее краями, и встроить туда нужные нам гены с соответствующими регуля-

торными элементами, то они могут быть перенесены и встроены в

геном растения с

помощью агробактерии точно так же, как она делает это со своими собственными ге-

нами. Именно на этом принципе построено использование агробактериальной транс-

формации в генетической инженерии растений.

Существует два основных типа векторных систем на основе агробактерии. Первая

система основана на применении так называемых cis- или коинтегративных векторов.

Их создают путем вставки нужных нам генов в Т-область Ti-плазмиды Agrobacterium с

помощью гомологичной рекомбинации. Вторая система основа на использовании так

называемых trans- или бинарных векторов. Эти векторы не имеют гомологии с Т-ДНК.

Они обязательно содержат сайт начала репликации (ori) от плазмиды с широким кру-

гом хозяев либо ori-сайты как Agrobacterium, так и E.coli, благодаря чему способны авто-

номно реплицироваться в обоих этих микроорганизмах (рис. 2.11).

При создании современных трансгенных сортов растений в основном используют

бинарные векторные системы. Сам вектор представляет собой плазмиду, которая со-

держит сайт начала репликации (ori), а также по 25 п.н. левого и правого краев Т-ДНК,

между которыми расположены нужные нам гены с соответствующими регуляторными

элементами. Конструируют их исключительно методами технологии рекомбинантных

КАК ПОЛУЧАЮТ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ ОРГАНИЗМЫ

ДНК, описанными выше (встраивание нужных фрагментов ДНК между левым и пра-

вым краями осуществляют с помощью полилинкеров). Методы традиционной селек-

ции микроорганизмов, основанные на гомологичной рекомбинации, практически не

используются. Такие плазмиды можно клонировать в E.coli, где они способны автоном-

но реплицироваться.

Рис. 2.11. Пример плазмидного бинарного вектора (по APHIS-USDA, 1994). Вектор pMON10117 использо-

ван при создании томатов с удлиненным сроком созревания благодаря пониженному уровню этилена –

фитогормона, регулирующего процесс созревания плодов (встраивание гена, кодирующего фермент

АСС-деаминазу; этот фермент играет важную роль в биосинтезе этилена). По внешнему периметру

плазмиды отмечены сайты рестрикции соответствующих рестриктаз, а также

номера последовательно-

стей нуклеотидов, начиная с правого края (Right border). По внутреннему периметру – последователь-

ность генетических элементов, содержащихся на плазмиде. В ДНК трансгенных растений включена

часть плазмиды, ограниченная левым и правым краями (Left and Right borders), – Т-ДНК. Ori-322 и ori-V-

сайты начала репликации плазмиды соответственно в E.coli и A. tumefaciens

После клонирования, изучения и отбора нужных нам конструкций генов ото-

бранные бинарные векторы переносят в специальные штаммы, созданные на основе

высоковирулентных штаммов Agrobacterium (как правило, A.tumefaciens). Характерной

особенностью этих штаммов является то, что они имеют так называемую разоружен-

ную vir-плазмиду. Последняя представляет собой Ti-плазмиду, которая содержит ин-

тактную

vir-область, но у которой полностью отсутствует Т-область.

Привнесенный в Agrobacterium бинарный вектор способен в ней автономно реп-

лицироваться благодаря наличию ori-сайта от плазмиды с широким кругом хозяев.

Вследствие же наличия разоруженной vir-плазмиды он может успешно переноситься и

встраиваться в геном клеток растений.

Как видим, при разработке бинарных векторных систем использована такая важ-

нейшая особенность механизма агробактериальной трансформации, согласно которой

vir-область Ti-плазмиды лишь обеспечивает перенос Т-области из бактерий в растения,

но сама при этом в растения не попадает. С другой стороны, в процессе переноса Т-

ГЛАВА ВТОРАЯ

области существенным является присутствие очень небольшой части Т-ДНК: по 25 п.н.

ее левого и правого краев. Остальная часть Т-ДНК, в том числе все онкогены и гены,

кодирующие образование опинов, для процесса переноса Т-ДНК несущественны. Они

выполняют в нем пассивную роль и могут быть безболезненно заменены любыми дру-

гими генами.

В бинарных векторных системах в отличие от естественных штаммов Agrobacterium

основные «участники» процесса агробактериальной трансформации — vir- и chv-гены,

которые обеспечивают перенос Т-ДНК, и переносимая Т-ДНК (точнее говоря, ее левый

и правый края со вставленными между ними нужными генами) — разделены физиче-

ски. Chv-гены расположены на бактериальной хромосоме, а vir-гены и Т-ДНК — на

разных плазмидах. Это очень удобно для целей генетических манипуляций с бинар-

ным вектором, поскольку существенно увеличивает емкость вектора.

Безусловно, агробактериальная трансформация — наиболее эффективная техно-

логия введения трансгенов в клетки растений. Однако она имеет ограничения, связан-

ные с кругом хозяев агробактерий. Специально отобранные штаммы Agrobacterium с

широким кругом хозяев могут инфицировать приблизительно половину двудольных

видов растений, а также некоторые из голосеменных. Многие двудольные и голосе-

менные и практически все однодольные растения устойчивы к агробактериям и нико-

гда не образуют опухолей. Тем не менее, совершенствование этого метода продолжает-

ся. В результате разработаны протоколы для агробактериальной трансформации риса

[Hiei et al., 1994], кукурузы [Ishida et al., 1996], пшеницы [Cheng et al., 1997]. Выделены

симбиотичные с растениями микроорганизмы, отличные от агробактерий (Rhizobium,

Sinirhizobium, Mesorhizobium), которые после соответствующей генетической модифика-

ции способны к горизонтальному переносу генов [Broothers et al., 2005].

2.6. Экспрессия трансгенов

Как отмечалось выше, каждый ген имеет сложную систему регуляции своей ак-

тивности, в отсутствие которой он просто не будет функционировать. Только для

транскрипции гена (образования мРНК) обязательно наличие, помимо кодирующей

области, также промотора, последовательности, обеспечивающей присоединение к

мРНК поли-А хвоста, и последовательности, указывающей место окончания транс-

крипции. В придачу к этим обязательным элементам генетические конструкции могут

содержать также регуляторные элементы, определяющие, например, место и время ак-

тивности переносимого гена (трансгена), другие гены (с соответствующими генетиче-

скими элементами), например так называемые селективные гены, с помощью которых

выделяют трансформированные клетки реципиентного организма среди преобла-

дающей массы нетрансформированных клеток.

Такие генетические конструкции «собирают» из фрагментов ДНК, которые могут

принадлежать совершенно разным организмам, относящимся к весьма отдаленным

систематическим группам, и даже с участием фрагментов ДНК, синтезированных ис-

кусственно. Например, в плазмиду почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens (A.

tumefaciens) встраивают ген, выделенный из ДНК рыбы (ген холодоустойчивости от

камбалы), промотор у этого гена от вируса мозаики цветной капусты, последователь-

ности присоединения поли-А хвоста и окончания транскрипции (терминальные по-

следовательности) от A. tumefaciens, селективный ген устойчивости к канамицину из

транспозона (подвижный генетический элемент) E.coli, промотор и терминальные по-

следовательности у этого гена те же, что и у гена холодоустойчивости. И вся эта гене-

тическая конструкция предназначена для переноса в растительный организм.

Выбор промотора при создании трансгенных конструкций имеет особое значе-

ние. Существует общая закономерность: прокариотические промоторы могут обеспе-

КАК ПОЛУЧАЮТ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ ОРГАНИЗМЫ

чить активность любого гена, в том числе и эукариотического, только в прокариотиче-

ском организме (у бактерий, синезеленых водорослей). В эукариотическом организме

может функционировать только ген, имеющий эукариотический промотор. Поэтому

при переносе генов от одного вида растений к другому можно использовать гены с их

собственными промоторами. Но если в растение переносится бактериальный ген, то

промотор у него должен быть заменен на растительный.

В последнем случае часто используют промоторы от растительных вирусов, в ча-

стности промотор вируса мозаики цветной капусты CaMV35S. Вирусы по своей приро-

де — существа исключительно активные. Ничто или практически ничто не может их

остановить после того, как они нашли свою жертву (хозяина). Попав в клетку хозяина,

вирусная ДНК интенсивно размножается и, используя «строительный материал и тех-

нику» (рибосомы и молекулы, необходимые для трансляции) клетки хозяина, активно

воспроизводит себе подобных. Это происходит в силу того, что в процессе эволюции

вирусы получили очень сильные промоторы, способные функционировать в любом

генетическом окружении. Для генетической инженерии такое свойство вирусных про-

моторов очень ценно, поскольку обеспечивает активную работу привнесенного в ор-

ганизм трансгена. Чтобы усилить активность трансгена, иногда перед ним помещают

сразу два промотора (генно-инженерные томаты с удлиненным сроком созревания).

Правда, с другой стороны, регулировать активность такого гена очень сложно: он ра-

ботает постоянно и с одинаковой интенсивностью. Во многих случаях это как раз то,

что и требуется.

Если исследователь ставит более сложные задачи в плане регулирования активно-

сти трансгенов, то в его распоряжении имеется в настоящее время достаточно широ-

кий выбор промоторов и других регуляторных элементов, комбинирование которых

позволяет достичь более тонкой регуляции активности трансгенов в пространстве (в

определенных тканях растения) и времени (в определенный период развития). В каче-

стве примеров тканеспецифических промоторов можно назвать промотор PSsuAra из

Arabidopsis thaliana, который обеспечивает экспрессию находящихся под ним трансге-

нов исключительно в зеленых тканях (листьях, стебле); промотор РТА29 из табака

Nicotiana tabacum, который обеспечивает экспрессию находящихся под ним трансгенов

в пыльниках. Промотор rbsSгена малой субъединицы рибулозобифосфаткарбоксила-

зы-оксигеназы A. thaliana — светочувствительный: экспрессия расположенных под ним

трансгенов на свету (например, в листьях) в сто и более раз выше, чем в темноте (на-

пример, в корнях, клубнях).

Для того чтобы сделать возможным эффективное включение протеинов — про-

дуктов трансгенов в метаболизм клетки, трансгенные конструкции могут содержать,

например, такие генетические элементы, которые кодируют образование транзитного

пептида, обеспечивающего доставку трансгенного фермента EPSPS к хлоропластам —

месту синтеза ароматических аминокислот (генно-инженерная соя, устойчивая к гер-

бициду глифосату).

Как указывалось выше, добиться эффективной экспрессии трансгенов у бактерий

намного проще, чем у высших организмов. Трансформация бактерий чаще всего огра-

ничивается включением в их клетки рекомбинантных плазмид, способных самостоя-

тельно в них реплицироваться. Чем больше копий таких плазмид образуется в клетке,

тем больше протеина — продукта привнесенного гена в ней вырабатывается. В случае

с растениями ситуация намного сложнее. Трансгены встраиваются в генетический ма-

териал клетки и их наследование в поколениях ГИО происходит в соответствии с зако-

нами классической генетики. Поэтому важно, чтобы характер наследования трансге-

нов был предельно простым и предсказуемым (желательно, чтобы они наследовались