Буценко Л.М., Красінько В.О. Технології мікробного синтезу лікарських засобів: Лабор. практикум

Подождите немного. Документ загружается.

V - об'єм, в якому розчинена наважка, в мл;

- об'єм, взятий для розведення в мл;

- об'єм, взятий після розведення, в мл;

d - середня вага однієї ‹таблеток чи драже у г;

а - наважка у г;

1000 - перерахунок у мг.

Завдання для виконання студентами.

Методи визначення жиророзчинних вітамінів

1. Підготувати сировину для отримання каротиноїдів. Провести екстракцію.

2. Здійснити виділення каротиноїдів з рослинної сировини: моркви, перцю,

гарбуза, абрикосів, шпинату, селери.

3. Визначити вміст каротинів у рослинній сировині. Результати узагальнити

в таблиці. Проаналізувати отримані дані.

Біотехнологія отримання рибофлавіну (закінчення)

Відокремлення біомаси продуцента.

Клітини Eremothecium ashbyii відокремлюють фільтруванням У випадку,

якщо культуральна рідина погано фільтрується внаслідок глибокого лізісу

клітин продуцента, біомасу відокремлюють центифугуванням.

Визначення рН і амінного азоту у фільтраті культуральної рідини.

У фільтраті або фугаті культуральної рідини визначають рН

потенціометрично та вміст амінного азоту мідним способом (див. дод.).

Отримані дані порівнюють з початковими значеннями рН і вмісту

амінного азоту у культуральній рідині.

Мікробіологічний контроль процесу вирощування культури

Eremothecium ashbyii.

За умови глибинного вирощування культури Eremothecium ashbyii

показовим є контроль мікроскопіюванням процесу вирощування.

Для порівняння морфологічних ознак культури продуцента у різні

періоди його розвитку відбирають проби культуральної рідини на другу та

п’яту добу вирощування. Готують не зафарбовані препарати, розглядають їх під

мікроскопом і відмічають морфологічні особливості культури (форму та

розміри клітин, наявність спор, їх форму та розташування, утворення асків,

тощо).

Особливу увагу слід звернути на вміст рибофлавіну в клітинах, жовті

кристали якого добре видимі під мікроскопом. За нормального розвитку гриба

Eremothecium ashbyii у початковий період росту (дводобова культура) основна

маса вітаміну знаходиться у клітинах, у старій культурі (п’яти –шестидобова

культура) клітини, в основному, вже не містять кристалів вітаміну, який вже

майже повністю переходить у культуральну рідину.

Найпоказовішим є мікроскопіювання гриба Eremothecium ashbyii на

різних стадіях розвитку в ультрафіолетовому світлі (люмінесцентна

мікроскопія). Завдяки здатності рибофлавіну до флуоресценції розташування

його кристалів чітко видно.

Визначити вміст рибофлавіну в культуральній рідині (методику див.

вище). Узагальнити та проаналізувати отримані результати. Зробити висновик

щодо впливу умов культивування на біосинтез рибофлавіну.

Контрольні запитання.

1. Які реакції дозволяють ідентифікувати вітамін А?

2. Принцип методу визначення вітаміну D?

3. Дайте характеристику промислового одержання каротиноїдів.

4. Які фактори впливають на процес екстракції вітамінів?

5. Які принципи лежать в основі методів визначення вмісту каротиноїдів у

досліджуваних об’єктах?

6. Охарактеризуйте основні етапи одержання рибофлавіну.

ДОДАТКИ

ВИЗНАЧЕННЯ ВМІСТУ ВУГЛЕВОДІВ ЗА БЕРТРАНОМ

Методика дає добрі результати при вмісті вуглеводів 10–90 мг/мл.

Принцип методу. Вуглеводи, що мають вільні альдегідні чи кетонні

групи, мають здатність у процесі кип‘ятіння відновлювати лужні розчини міді

до закису, що враховується об'ємним методом.

Реактиви. Розчин CuSO

5H

O (Фелінг 1): 69,27 г чистої сірчанокислої

міді розчиняють у 1 л дистильованої води. У разі потреби розчин фільтрують

через паперовий фільтр;

розчин сегнетовой солі (Фелінг 2): 346 г сегнетової солі та 100 г NaOH

розчиняють у дистильованій воді й об’єм доводять до 1 л. У разі помутніння

розчин повинен бути відфільтрований через скляний фільтр і по можливості

швидко;

розчин крохмалю: 1 г розчинного крохмалю розмішують у невеликій

кількості холодної дистильованої води і отриману суспензію вливають у

киплячу воду (загальний об’єм – 100 мл). Туди само додають кухонну сіль (до

насичення). Розчин фільтрують через паперовий фільтр;

розчин 2 н. соляної кислоти;

20%-й розчин H

: 110 мл концентрованої H

змішують з 890 мл

дистильованої води;

KI кристалічний ("чда" чи "хч");

0,1 н. розчин тіосульфату Na

 5H

O : 24,6 г тіосульфату і 0,2 г

бісульфіту натрію розчиняють у дистильованій, прокип'яченій воді і об’єм

доводять до 1 л. Воду для приготування розчину тіосульфату натрію кип'ятять

1,5–2 год, потім охолоджують до кімнатної температури, використовуючи

трубку з натронним вапном.

Визначення поправки до титру розчину тіосульфату. У колбу

Ерленмейєра з притертою пробкою місткістю 250 мл вносять 20 мл 0,1 н.

розчину двохромовокислого калію, 2 г йодистого калію і 5 мл концентрованої

соляної кислоти. Суміш закривають пробкою, колбу ставлять на 10 хв у темне

місце і потім титрують приготовленим 0,1 розчином тіосульфату. У момент

ослаблення забарвлення розчину до солом'яно-жовтого додають три краплі

індикатора (1%-й розчин крохмалю) і титрують до зникнення синього

забарвлення (розчин здобуває зеленого кольору від тривалентного хрому, але

він повинен бути прозорий).

Поправку обчислюють за формулою

К 

де 20 – об’єм 0,1 н. розчину двохромовокислого калію, мл; V – об’єм

розчину тіосульфату, витраченого на титрування, мл.

Техніка визначення

0,5–1 мл культуральної рідини з клітинами вносять у пробірку і додають

відповідно 0,5–1 мл 2 н. соляної кислоти. Пробірки прогрівають при 70 °С

упродовж 10 хв (для гідролізу сахарози).

Після закінчення гідролізу пробу кількісно переносять у колбу

Ерленмейєра, додають відповідно по 9 мл дистильованої води, потім розчини

Фелінг 1 і Фелінг 2, по 10 мл кожного, після чого колбу спочатку кип'ятять

протягом 2 хв (точно), відраховуючи час від початку кипіння, а потім швидко

охолоджують у посуді з холодною водою. В охолоджену колбу вносять 2 г

йодистого калію і 15 мл 20%-й сірчаної кислоти і відразу ж після цього

проводять титрування йоду, що виділився, 0,1 розчином тіосульфату. У момент

ослаблення забарвлення розчину до солом'яно-жовтої додають три краплі

індикатора (1%-й розчин крохмалю), потім титрування доводять до кінця.

Кінець титрування визначають за зникненням синього забарвлення та за

знебарвленням розчину.

Паралельно проводять контрольний дослід, у якому замість проби беруть

10 мл дистильованої води. З контрольною пробою виконують ті самі операції,

що й з дослідною пробою після гідролізу і додавання води.

Розрахунок. Спочатку обчислюють значення X:

95,036,6К)ВА(Х 

де А – об’єм 0,1 н. розчину тіосульфату, витраченого на титрування в

контрольному досліді, мл; В – об’єм 0,1 н. розчину тіосульфату, витраченого на

титрування досліджуваної проби, мл; К – поправка титру розчину тіосульфату;

6,36 – коефіцієнт переходу від мілілітрів до міліграмів (1 мл 0,1 н. розчину

тіосульфату відповідає 6,36 мг міді); 0,95 – коефіцієнт перерахунку на сахарозу

(враховує приєднання молекули води при інверсії сахарози).

Далі за таблицею 2 для розрахованої величини Х знаходять значення С

(масу цукру в міліграмах).

Розраховують вміст сахарози, %:

1000

100С





Формула дана для об’єму досліджуваної проби 1 мл. Якщо об’єм проби

0,5 мл, результат множать на два.

Визначення вуглеводів за Бертраном.

Інвертний цукор

Цукор,

мг

Мідь,

мг

Цукор,

мг

Мідь,

мг

Цукор,

мг

Мідь,

мг

Цукор,

мг

Мідь,

мг

10 20,6 33 64,8 56 105,7 79 143,7

11 22,6 34 66,7 57 107,4 80 145,3

12 24,6 35 68,5 58 109,2 81 146,9

13 26,5 36 70,3 59 110,9 82 148,5

14 28,5 37 72,2 60 112,6 83 150,0

15 30,5 38 74,0 61 114,3 84 151,6

16 32,5 39 75,9 62 115,9 85 153,2

17 34,5 40 77,7 63 117,6 86 154,8

18 36,4 41 79,5 64 119,2 87 156,4

19 38,4 42 81,2 65 120,9 88 157,9

20 40,4 43 83,0 66 122,6 89 159,5

21 42,3 44 84,8 67 124,2 90 161,1

22 44,2 45 86,5 68 125,9 91 162,6

23 46,1 46 88,3 69 127,5 92 164,2

24 48,0 47 90,1 70 129,2 93 165,7

25 49,8 48 91,9 71 130,8 94 167,3

26 51,7 49 93,6 72 132,4 95 168,3

27 53,6 50 96,4 73 134,0 96 170,3

28 55,5 51 97,1 74 135,6 97 171,9

29 57,4 52 98,8 75 137,2 98 173,4

30 59,3 53 100,6 76 138,9 99 175,0

31 61,1 54 102,3 77 140,5 100 176,5

32 63,0 55 104,0 78 142,1

ВИЗНАЧЕННЯ ФОСФОРУ ЗА НЕЙМАНОМ

Метод заснований на взаємодії ортофосфорної кислоти з молібдатом

амонію. Фосфомолібдат амонію, що утворюється при цьому, взаємодіє потім з

гідроксидом натрію і розкладається з утворенням дигідрофосфату натрію і

солей молібденової кислоти.

Реактиви

Концентрована сірчана кислота;

2,5%-й розчин молібдату амонію: 25 г чистого молібдату амонію

розчиняють у 300 мл води в мірній колбі на 1 л, приливають 500 мл 10 н.

розчину сірчаної кислоти, доводять об’єм до мітки дистильованою водою,

фільтрують;

0,1 н. розчин NaOH;

0,1 н. розчин H

Техніка визначення

Наважку матеріалів у кількості 2–5 г переносять у колбу К’єльдаля,

додають 20 мл сірчаної кислоти, каталізатор і спалюють. Потім уміст колби

охолоджують, переводять дистильованою водою в мірну колбу на 100 мл,

доводять об’єм до мітки при 20°C, закривають гумовою пробкою і

перемішують.

Для визначення вмісту фосфору відмірюють піпеткою 50 мл

досліджуваного розчину в хімічну склянку на 200 мл, додають 30 мл

дистильованої води і нагрівають до кипіння.

В іншу склянку на 100 мл наливають 25 мл розчину молібдату амонію,

нагрівають до 60 °C і відразу доливають його до аналізованого розчину.

Отриману суміш перемішують і витримують 3 год при температурі 15–20 °C.

Розчин фільтрують через фільтр, осад ретельно промивають до нейтральної

реакції. До промитого осаду доливають 20 мл 0,1 н. розчину гідроксиду натрію

до повного розчинення осаду. Потім фільтр промивають до зникнення лужної

реакції і розчин відтитровують 0,1 н. розчином сірчаної кислоти.

Вміст фосфору, % розраховують за рівнянням

= (v

– v

) ·0,000309v

· 100/ (av

де v

– об’єм 0,1 н. розчину NaOH, узятий на реакцію, см

; v

– об’єм 0,1 н.

розчину сірчаної кислоти, витраченого на зворотне титрування, см

; K

, K

–

поправочні коефіцієнти; 0,000309 – кількість фосфору, що відповідає 1 см

0,1 н. розчину NaOH, г; v

– об’єм, до якого розведено наважку продукту після

спалювання; v

– об’єм розведеного розчину, взятого на реакцію з молібдатом

амонію, см

; а – наважка речовини, взятої для визначення фосфору, г.

ВИЗНАЧЕННЯ ВМІСТУ АЗОТУ АМІНОКИСЛОТ (МІДНИМ

СПОСОБОМ)

Визначення амінного азоту мідним способом ґрунтується на здатності

амінокислот і різних пептидів утворювати комплексні розчинні сполуки з

міддю, яку потім визначають йодометрично.

Суть даного методу полягає у тому, що до визначеної кількості

досліджуваного розчину, який містить суміш амінокислот і пептидів,

приливають при слаболужній реакції надлишок суспензії суспензії

фосфорнокислої міді у боратному буфері, в результаті чого після збовтування у

розчин переходять мідні солі більшості амінокислот. Потім надлишок фосфату

міді відфільтровують і до прозорого розчину додають оцтову кислотуі

йодистий калій. При цьому відбувається реакція:

2Cu(CH

COO)

+ 4KI = 2CuI + I

+ 4СН

СООК

Йод, що виділився, відтитровують слабким розчином гіпосульфіту.

Кожен мілілітр 0,01 н. Na

відповідає 0,28 мг амінного азоту.

Реактиви

Розчин CuCl·2H

O: 27,3 г розчиняють у дистильованій воді в мірній колбі

1000 мл і доводять до мітки;

Розчин ортофосфату натрію Νа

ΡΟ

12Η

Ο: 64,5 г Νа

ΡΟ

·12Η

розчиняють у 500 мл свіжокип’яченої дистильованої води. Додають 7,2 г NaOH,

вливають у мірну колбу на 1000 мл і доводять до мітки;

Боратний буферний розчин: 57,21 г бури розчиняють у 1500 мл

дистильованої води, додають 100 мл 1 н. розчину HCl і доводять

дистильованою водою до об’єму 2000 мл;

Суспензія ортофосфату міді: змішують один об’єм розчину хлориду міді

(№ 1) з двома об’ємами ортофосфату натрію і додають два об’єми боратного

буферного розчину (суміш готують перед використанням);

1 н. розчин NaOH;

80%-ва оцтова кислота: 77,44 мл крижаної оцтової кислоти доводять

дистильованою водою до об’єму 100 мл;

Розчин тимолфталеїну: 0,25 г тимолфталеїну розчиняють у 100 мл

ректифікованого спирту;

Йодид калію;

0,01 н. тіосульфату натрію (готують перед використанням з 0,1 н.

розчину);

Розчин крохмалю: збовтують 1 г розчиненого крохмалю в 5 мл

дистильованої води; розчин вливають (невеликими порціями) у насичений

розчин KCl (80 мл) і кип’ятять упродовж 5 хв, охолоджують до кімнатної

температури, переводять у мірну колбу на 100 мл і доводять насиченим

розчином KCl до мітки. Розчин крохмалю повинен бути нейтральний (рН 7,0).

Техніка визначення.

1–2 мл (10, якщо це фільтрат культуральної рідини) розчину, доведеного

до нейтральної реакції, наливають у мірну колбу на 25 мл і додають одну–дві

краплі тимолфталеїну і по краплях 1 н. розчин NaOH до блідо-синього

забарвлення. Після цього у колбу додають 10–15 мл суспензії ортофосфату міді

у боратному буфері, потім доводять вміст колби до мітки дистильованою

водою. Добре збовтують і фільтрують через складчастий фільтр з

малопористого фільтрувального паперу або центрифугують.

Фільтрат повинен бути зовсім прозорий, бо за наявності частинок осаду

завищується кінцевий результат.

5–10 мл фільтрату відбирають у конічну колбу або у фарфорову чашку,

додають 0,25–0,5 мл 80 % оцтової кислоти, 0,2–0,4 г KI. Йод, що виділився,

відтитровують 0,01 н. розчином тіосульфату натрію Na

, додаючи в кінці

титрування одну–чотири краплі крохмалю до зникнення синього забарвлення.

Паралельно проводять контрольний дослід, де замість досліджуваного розчину

беруть дистильовану воду.

Результат обчислюють за формулою

28,0)ва(





де Х – вміст амонійного азоту, мг/л; а – кількість 0,01 н. розчину тіосульфату

натрію, витрачена на титрування дослідного зразка, мл; в – кільксть 0,01 н.

розчину тіосульфату натрію, витрачена на титрування контролю, мл; n –

кількість досліджуваного розчину, яку взята для аналізу, мл.

ВИЗНАЧЕННЯ БІЛКА МЕТОДОМ ЛОУРІ

Метод ґрунтується на реакції білків з реактивом Фоліна, яка дає синє

забарвлення.

Метод застосовують для визначення в розчинах білка з концентрацією від

10 до 100 мкг.

Реактиви

Розчин А: 2%-й розчин Na

в 0,1 н. розчині NaOH;

розчин В: 0,3%-й розчин CuSO

5H

O в 1%-му розчині двозаміщеного

виннокислого натрію або калію;

розчин С: дослідний розчин, який готують у день визначення (придатний

протягом 1 дня), змішуванням 50 мл розчину А і розчину В;

реактив Фоліна: 100 г вольфрамату натрію (Na

2H

O) і 25 г

молібдату натрію (Na

MoO

2H

O) розчиняють у 700 мл води, додають 50 мл

85%-го розчину ортофосфорної і соляної кислот. Суміш кип’ятять протягом 10

год із зворотним холодильником у витяжній шафі. Після цього в колбу додають

150 г сульфату літію, 50 мл дистильованої води і п‘ять крапель бромної води.

Суміш кип’ятять 15 хв. у витяжній шафі для видалення надлишку брому,

охолоджують і доводять до 1 дм

. Реактив фільтрують і зберігають у темній

склянці з притертою пробкою. Розчин повинен бути яскраво-жовтого кольору.

Розчин можна зберігати тривалий час;

розчин Д: реактив Фоліна, розбавлений водою у співвідношенні 1:1.

Техніка визначення

До 0,4 мл розчину білка додають 2 мл розчину С. Суміш перемішують і

через 10 хв. приливають до неї 0,2 мл робочого розчину Фоліна. Інтенсивність

забарвлення визначають на ФЕК-М з червоним світлофільтром (або на

спектрофотометрі з довжиною хвилі 750 нм) через 30 хв. Кількість білка

знаходять за калібрувальною кривою.

Побудова калібрувальної кривої.

Для побудови калібрувальної кривої 100 мг чистого білка (сироваткого -

глобуліну, кристалічного альбуміну і т.ін.) розчиняють в 100 мл

0,1 н. розчину

NaOH (1мл містить 1 мг білка). У дев‘ять мірних колб на 100 мл приливають

розчин білка у зростаючих кількостях: 0,5 мл, а потім від 1 до 8 мл. Розчин у

колбах доводять водою до мітки, перемішують і з кожної колби беруть по 0,4

мл для визначення концентрації білка калориметричним методом. За

одержаними даними креслять калібрувальну криву.

На рисунку наведено калібрувальну криву для визначення білку методом

Лоурі побудовану вимірюванням оптичної густини розчинів альбуміну при 750

нм в кюветі 10 мм.

0,2

0,4

0,6

0,8

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1

Вміст білку, мг/мл

Рис. 1 Залежність оптичної густини від вмісту білку

ВИЗНАЧЕННЯ ВОЛОГОСТІ НА ПРИЛАДІ ЧИЖОВОЇ

Суть метода полягає у висушуванні наважки досліджуваної речовини між

двома нагрітими металевими плитами. Загальний час визначення не перевищує

35-40 хвилин.

Техніка визначення:

Виготовляють пакети з цупкого паперу (2 шт. на 1 дослід). Нумерують їх

простим олівцем. Висушують пакети протягом 3 хвилин при температурі 165 -

170 °С. Після цього пакети на 5-6 хвилин лишають в ексикаторі для

охолодження, а потім зважують на технічних терезах з точністю до 0,01 г.

У сухі пакети зважують приблизно 5 г речовини для визначення вологості

середньої проби. За можливістю розміщують речовину у конверті рівним

шаром, потім пакет з вологою наважкою зважують і вкладають у прибор

Чижової, де пробу висушують при t = 165-170°С впродовж 7 хвилин. Після 5-6

хвилин охолодження в ексикаторі пакети з наважкою знов зважують.

Вологість розраховують за формулою:

100

ба

вa





де W- вологість, %;

а – маса пакета з наважкою до висушування, г;

б – маса сухого висушеного пакета, г;

в – маса пакета з наважкою після сушки, г.

З двох пакетів знаходять середнє значення вологості.

ПРИГОТУВАННЯ ВИХІДНИХ ФЕРМЕНТНИХ РОЗЧИНІВ

Для приготування основного розчину з поверхневої культури 5 г її

зважують у хімічній склянці на 50 мл, переносять у конічну колбу на 250 мл,

додають 90 мл дистильованої води і 10 мл ацетатного буферного розчину з рН

4.7. Суміш термостатують протягом 1 год при температурі 30°С при

періодичному перемішуванні і фільтрують. Витяжку можна зберігати протягом

1 доби при температурі від мінус 4 до плюс 2°С.

Робочий розчин готують розведенням основного згідно табл. 2. У цьому

досліді й надалі всі піпетки, які використовуються для розведення і дозування

реагентів повинні містити ватні тампони (для запобігання потраплянню слідів

слини, яка містить амілазу).

При приготуванні робочих розчинів глибинних культур їх міцелій

відділяють фільтруванням. Від 1 до 5 мл фільтрату (залежно від передбачуваної

активності) розводять дистильованою водою у мірній- колбі на 250 мл і

використовують одержаний розчин для проведення ферментативної реакції.

Для приготування основного розчину технічного (неочищеного) ФП до

наважки 1.00 г повітряно-сухого препарату додають 100 мл дистильованої води,

настоюють протягом 1 год при періодичному перемішуванні і фільтрують

одержану витяжку. Кількість витяжки, необхідна для приготування робочого

розчину (об'ємом 200 мл), залежно від передбачуваної активності препарату,

становить (у мл):

70-120 од./г......................... 10

120-250 од./г......................... 5

250-500 од./г......................... 2

Приготування розчинів очищених ФП. У хімічній склянці місткістю 25 мл

на аналітичній вазі зважують 0.1 г очищеного повітряно-сухого ФП. Наважку

ретельно розтирають скляною паличкою з невеликою кількістю води, кількісно

переносять її у мірну колбу на 100 мл, доводять об'єм розчину дистильованою

водою до мітки, перемішують і при небхідності фільтрують. Одержаний

основний розчин ФП зберігають не довше, ніж 1 доби при температурі від – 4 ºС

до + 2 ºС. Його кількість, необхідну для приготування робочого розчину

визначають з табл.3.

Таблиця 2.

Дані для приготування робочого розчину поверхневої культури

Передбачувана

активність

препарату, од/г

Кількість

препарату в 1 мл

робочого

розчину, мг

Об'єм основного

розчину,

необхідний для

повторного

розведення, мл

Загальний об’єм

розведеного

розчину, мл

5-15

16-50

51-100

101-150

151-300

37,5

10,0

2,5

1,25

0,625

15,0

4,0

1,0

0,5

100,0

200,0