Буценко Л.М., Красінько В.О. Технології мікробного синтезу лікарських засобів: Лабор. практикум

Подождите немного. Документ загружается.

Рибофлавін - 6,7-диметил – 9 (D-1-рибитил) ізоалоксазин

Він кристалізується у вигляді помаранчево-жовтих голок з температурою

плавлення 282С з розкладанням. Рибофлавін нерозчинний у жирах та

органічних розчинниках, розчинний у воді.

У теперішній час вітамін В

одержують двома шляхами: хімічним

синтезом та біосинтезом. Продуцентами рибофлафіну в природі є вищі

рослини, дріжджі, міцеліальні гриби та бактерії. Більшість мікроорганізмів

утворює вільний рибофлавін та дві його коферментні форми – ФМН та ФАД.

Найбільш активними продуцентами, що синтезують 2000-6000 мг/л

рибофлавіну є представники аскоміцетних дріжджів Eremothecium ashbyii та

Ashbyii gossypii. Інші продуценти (Candida flaveri, Mycocandida riboflavina,

Mycobacterium smegmatis, Clostridium acetobutylicum), утворюють від 100 до 600

мг/л цього вітаміну.

Біотехнологічне одержання вітаміну В

шляхом глибинного

культивування Eremothecium ashbyii включає, аналогічно іншим біотехнологіям

такі етапи:

1. Одержання посівного матеріалу.

2. Приготування поживного середовища, його стерилізація та

засів.

3. Виробнича ферментація:культивування продуцента у робочих

ферментерах за постійної аерації та перемішування.

Біосинтез рибофлавіну у деяких дріжджів може змінюватися під впливом

іонів металів, проте детальні механізми такого впливу не з’ясовані. Іони

кобальту стимулюють флавіногенну активність P. guilliermondii. Дефіцит іонів

магнію зумовлює підвищення синтезу рибофлавіну у Aspergillus niger. За

наявності іонів цинку підвищується синтез рибофлавіну у дріжджів роду

Candida. Чимало видів дріжджів синтезують значні кількості рибофлавіну лише

за культивування на середовищах з низьким вмістом заліза. Незначне

утворення флавінів за високого вмісту заліза у середовищі засвідчує

функціонування ефективних механізмів, які обмежують синтез флавінів у

клітинах. Одним із таких механізмів є ретроінгібування гуанозинтрифосфат-

циклогідролази, виявлене у дріжджів Pichia guilliermondii.

У всіх досліджених мікроорганізмів синтез рибофлавіну стимулюють

пурини, проте їх вплив залежить від виду мікроорганізму. Гліцин – попередник

пуринів, стимулює синтез рибофлавіну у дріжджів роду Candida. У A. gossypii

спостерігали підвищення синтезу РФ за внесення у середовище різних

попередників рибітолу, пуринів, гліцину.

У гриба A. gossypii процес надсинтезу флавінів залежить від температури

культивування. Флавіногенна активність була найвищою за температури 26–28

°С, а при 38 °С надсинтезу рибофлавіну не спостерігали.

Подальше проведення технологічного процесу залежить від вигляду

кінцевої продукції. У випадку одержання кристалічної форми культуральну

рідину передають у цех хімічного очищення, де рибофлавін виділяють шляхом

адсорбції або осадження з наступною перекристалізацією.

Вихідний посівний матеріал – культура Eremothecium ashbyii , вирощена

на скошеному сусло-агарі. Вирощування культури проводять 5-7 діб у

термостаті за температури 29С.

Колби з поживним середовищем заданого складу засівають п’яти-семи

добовою культурою Eremothecium ashbyii, вирощеною на вирощеною у

пробірках з сусло-агаром.

Завдання для виконання студентами.

Аналіз вмісту вітамінів

1. Визначити наявність рибофлавіну та цианкобаламіну у

фармацевтичних препаратах.

2. Проаналізувати вміст аскорбінової кислоти в лікарських рослинах

(цвіт бузини, листя кропиви, плоди шипшини, хвоя та ін.) та харчових

продуктах (картопля, цитрусові, яблука та ін.). Результати узагальнити в

таблиці.

Таблиця 7.1.

Результати визначення вмісту аскорбінової кислоти в рослинній сировині

№ бригади Назва рослинної сировини Вміст аскорбінової

кислоти

3. Визначити вміст аскорбінової кислоти в фармацевтичних

препаратах. Узагальнити та проаналізувати отримані результати.

Біотехнологія отримання рибофлавіну (початок).

1. Приготування поживного середовища

Основним фактором, який визначає рівень біосинтезу рибофлавіну є склад

поживного середовища. Слід вказати на особливу важливість підбору

вуглеводного компонента середовища для біосинтезу рибозної та азотистої

частин ізоалоксазинової структури молекули рибофлавіну

Як джерело вуглеводного живлення для біосинтезу рибофлавіну

рекомендується використовувати мальтозу, галактозу, сахарозу та левульозу.

Меляса як вуглеводний інгредієнт середовища має переваги перед іншими

джерелами внаслідок багатого вмісту у ній сахарози, моносахаридів, азоту і

солей.

Вміст заліза в середовищі не повинно перевищувати 10 мг на 100 мл

поживного середовища, але у разі повної відсутності іонів заліза у середовищі

утворення рибофлавіну затримується.

Для успішного утворення рибофлавіну культурою Eremothecium ashbyii

необхідно підтримувати слабокислу реакцію середовища (рН 5,8 - 6,5).

Кожна бригада студентів готує 500 мл поживного середовища заданого

варіанту. рН середовища встановлюють у межах 5,8 - 6,5 за індикаторним

папером. Поживне середовище розливають по 150 мл у конічні колби на 750 мл

(по 2 колби на бригаду).

Таблиця 7.2.

Склад поживного середовища для тримання рибофлавіну

№ Компоненти

середовища

Варіант і вміст компоненту, %

1 2 3 4 5

1 Глюкоза 3,0 1,5 - - -

2 Меляса - - 2,0 - -

3 Гідрол - 1,5 - 6,0 -

4 Дріжджовий

автолізат

8,0 8,0 - 8,0 -

5 Кукурудзяний

екстракт

- - 3,0 - -

6 MgSO

0,05 0,05 0,05 0,15 -

7 KH

0,15 0,15 0,05 0,15 -

8 NaNO

- - 0,6 - -

9 Сусло - - - - 8Ве*

*густина у градусах Балінга. Градус Балінга – ваговий відсоток

екстракту, виражений в грамах екстрактивних речовин, які містяться в 100

г розчину.

2. Підготовка посуду та стерилізація.

Колби з поживним середовищем закривають ватно-марлевим пробками і

зверху паперовим ковпачком, на якому олівцем пишуть прізвище і номер

варіанту. Колби завантажують у автоклав и проводять стерилізацію впродовж

20 хв.

3. Засів поживного середовища

Після закінчення стерилізації колби виймають з автоклаву, охолоджують

середовище до 30-35°С і здійснюють посів. Як посівний матеріал

використовують п’яти-семи добову культуру Eremothecium ashbyii, змиту зі

скошеного агаризованого середовища стерильною водопровідною водою (в

одну колбу переносять культури з однієї пробірки). Засів проводять з

дотриманням правил асептики.

Після посіву колби, закриті ватно-марлевими пробками, підписують та

встановлюють на качалки з 180-220 обертами за хвилину. Вирощування

культури проводять упродовж 3-5 діб за температури 29-30 °С.

4. Аналіз поживного середовища

У поживному середовищі, що залишилось, визначають рН

потенціометрично. Вміст амінного азоту визначають мідним способом (див.

дод.)

Контрольні запитання

1. Охарактеризуйте промислове одержання вітамінів.

2. Дайте характеристику біологічних агентів, які використовуються для

біотехнологічного одержання вітамінів.

3. Які параметри мають технологічні процеси біотехнологічного одержання

вітамінів? Які методи контролю при цьому застосовуються?

4. Що таке синтез Рейхштейна? Які фактори впливають на окиснення D-

сорбіту в L-сорбозу?

5. Охарактеризуйте біологічну дію, галузі застосування та хімічні

властивості вітаміну С.

6. Які принципи лежать в основі методів кількісного визначення

аскорбінової кислоти у лікарських рослинах, фармацевтичних препаратах і

харчових продуктах?

7. Які властивості притаманні рибофлавіну?

8. Назвіть джерела отримання вітаміну В

9. Охарактеризуйте мікроорганізми-продуценти рибофлавіну?

10.Які умови культивування забезпечують надсинтез рибофлавіну у

мікроорганізмів?

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА 8.

МЕТОДИ ВИЗНАЧЕННЯ ЖИРОРОЗЧИННИХ ВІТАМІНІВ.

БІОТЕХНОЛОГІЯ ОТРИМАННЯ РИБОФЛАВІНУ (ЗАКІНЧЕННЯ).

8.1 Визначення жиророзчинних вітамінів

Кількісне визначення вітаміну D

Визначення базується на утворенні жовтувато-рожевого забарвлення при

реакції вітаміну D з трихлористою сурьмою. Інтенсивність забарвлення

пропорційна концентрації вітаміну D і визначається за допомогою

фотоколориметру.

Реактиви та обладнання. Молочний жир, 96% етиловий спирт, 50%

розчин гідроксиду калію, хлороформ, 23% розчин SbCl

у хлороформі,

диетиловий ефір, свіжеприготовлений сульфат натрію, ацетилхлорид,

спиртовий розчин вітаміну D (10 мг кальциферолу розчиняють в 100 мл

етанолу, що відповідає 400000 Од. вітаміну D). Фотоелектроколориметр,

конічна колба з притертою пробкою, водяна баня, ваги, піпетки, розділяючі

воронки.

Техніка визначення. В конічну колбу з оборотним холодильником

вносять 10 г молочного жиру, 40 мл етанолу, 8 мл розчину гідроксиду калію.

Колбу поміщають у водяну баню температурою 85 – 90 С. Через 40 – 50 хв

вміст колби переносять в розподільчу воронку та тричі екстрагують

диетиловим ефіром (порціями по 25 мл). Отриманий ефірний екстракт

переносять в іншу розподільчу воронку та додають 7 г сульфату натрію.

Висушують до повної прозорості, фільтрують та відганяють залишок ефіру.

Сухий залишок розчиняють в 5 мл хлороформу. Потім до 1 мл розчину додають

3 краплини ацетилхлориду і 6 мл розчину трихлористої сурьми. Через 5 хв.

Інтенсивність забарвлення вимірюють на фотоколориметрі за довжини хвилі

500 нм проти суміші 1 мл хлороформу, 3 краплини ацетилхлориду і 6 мл

розчину трихлористої сурьми.

Концентрацію вітаміну D в досліджуваній речовині визначають за

калібрувальним графіком. Для побудови якого готують серію розчинів

кальциферолу в хлороформі, що містять від 200 до 1000 Од вітаміну D в мл.

Кольорову реакцію проводять як описано вище.

Реакції, що дозволяють визначити вітамін А

Принцип методу. Хлороформний розчин вітаміну А за наявності

трихлороцтової сурьми зафарбовується в специфічний синій колір. Вітамін А в

бензольному розчині з концентрованою сірчаною кислотою утворює комплекс,

що має синє забарвлення, а при реакції з сульфатом заліза (ІІ) в кислому

середовищі утворює червоно-рожеву сполуку.

Техніка визначення.

1) Реакція з трихлороцтовою сурьмою. В суху пробірку до 1-2 краплин

розчину вітаміну А у хлороформі приливають 4 – 5 краплин розчину

трихлороцтової сурьми. З ’являється синє забарвлення.

2) Реакція з сульфатом заліза (ІІ). В пробірку до 2 – 3 краплин масляного

розчину вітаміну А доливають 5 – 10 краплин льодяної оцтової кислоти

насиченої сульфатом заліза (ІІ), 1 – 2 краплини концентрованої сірчаної

кислоти.

З ’являється блакитне забарвлення, яке поступово змінюється на червоно-

рожеве. Каратиноїди в такій реакції дають зелене забарвлення.

Реактиви. Хлороформний розчин трихлороцтової сурьми (33%),

хлороформ, розчин вітаміну А, концентрована сірчана кислота, льодяна оцтова

кислота насичена сульфаром заліза (ІІ).

Каротиноїди є джерелом збагачення організму вітаміном А. Для

промислового одержання -каротину використовуються гетероталічні мукорові

гриби Blakeslea trispora. При сумісному вирощуванні різностатевих штамів цих

грибів на спеціально підібраних середовищах вихід каротину складає близько 3

– 4 г/л середовища.

Визначення β-каротину методом хроматографії на колонці

Розділення вітамінів та інших супутніх їм в екстракті речовин на

адсорбентах основано на різниці сил молекулярної взаємодії речовин, що

хроматографуються, з адсорбентами і розчинниками. Наявність

функціональних груп так збільшує адсорбційну здатність сполук:

СН = СН <ОСН

< СОО < С = О < СНО < SH < NH

< OH < COOH.

Під час хроматографування відбувається безперервний процес сорбції і

десорбції розчинених речовин на поверхні адсорбента.

Відповідно до енергії адсорбції відбувається концентрація речовин у

певному шарі колонки. Якщо речовини забарвлені, то на колонці з’являється

декілька зон, забарвлених у різні кольори.

Для повного розділення речовин необхідно промити колонку

свіжоприготовленим розчинником. Промита хроматограма може бути

використана для виділення адсорбованих речовин. Для цього стовпчик

адсорбента видаляють із колонки, розрізають на забарвлені зони і елюють

адсорбовані речовини відповідним розчинником. Повторне хроматографування

в інших умовах, виділених з первинної хроматограми речовин, часто дозволяє

здійснити їх подальше розділення.

Хід визначення. Головною частиною приладу є скляна трубка довжиною

30–35 см. Адсорбційну трубку через гумову пробку закріплюють у колбу

Бунзена, яка з‘єднана з насосом для створення вакууму.

Колонку заповнюють адсорбентом (оксид алюмінію), який

суспендований у розчиннику (петролейний эфір, Т

кип

= 40–70°С). Суспензію

вносять в адсорбційну трубку поверх шару вати, накритого клаптиком

фільтрувального паперу. У міру протікання розчинника частинки адсорбента

осідають. Для прискорення фільтрації розчинника під час заповнення колонки

можна застосувати вакуум. Трубку заповнюють оксидом алюмінію приблизно

до висоти 4–5 см. Оксид алюмінію злегка ущільнюють плоским інструментом..

Колонка весь час повинна бути покрита розчинником. За постійного вакууму

екстракт пігментів у петролейному ефірі наливають у колонку і промивають

невеликою кількістю петролейного ефіру. При цьому каротин швидко

проходить через колонку в елюат, а супутні йому пігменти повністю

адсорбуються на оксиді алюминію. Останні краплини розчинника, що витікає,

повинні бути безбарвні. Зазначають обєм елюата в циліндрі, вимірюють

оптичну щільність розчину каротину при синьому світлофільтрі та довжині

хвилі 440 нм. За стандартною кривою визначають концентрацію каротину в 1

мл.

Вміст каротину, мкг/г, розраховують за формулою



де С

– вміст каротину, знайдений за калібрувальною кривою, мкг/мл; v –

об‘єм елюату, мл; А - маса речовини, взятої для визначення, у перерахунку на

сухі речовини, г.

Визначення β-каротину фотометричним методом.

Сутність методу полягає в екстракції каротину органічним розчинником

(петролейний ефір, бензин, ацетон) і визначенні оптичної густини забарвлених

розчинів. Інтенсивність забарвлення залежить від вмісту каротину.

Приготування реактивів

Оксид алюмінію 10%-ї вологості. До 900 г безводного оксиду алюмінію

додають 100 мл дистильованої води і ретельно перемішують. Реактив

зберігають у герметично закритій судині з притертою пробкою і

використовують для аналізу наступного дня.

Основний (стандартний) розчин біхромату калію: 0,720 г біхромату

калію, зваженого з похибкою не більше 0,001 г, розчиняють у дистильованій

воді в мірній колбі ємністю 1000 мл, додають води до мітки і ретельно

перемішують. Оптична густина отриманого розчину відповідає оптичній

густині розчину каротину концентрації 4,16 мкг/мл. Термін збереження розчину

— 1 рік.

Розчини порівняння. У мірні колби ємністю 100 мл з бюретки доливають

10, 20, 30, 40, 50 мл (щоразу від нуля) основного розчину біхромату калію і

додають до мітки дистильованої води, ретельно перемішують. Термін

збереження розчинів порівняння — не більш 3 міс.

Побудова калібрувального графіка. Оптичну густину розчинів порівняння

вимірюють за довжини хвилі 450 нм проти дистильованої води в кюветах з

довжиною оптичного шляху 5, 10 чи 20 мм. Будують графік залежності

оптичної густини розчинів порівняння від об’єму основного розчину біхромату

калію, узятого для їх приготування.

Проведення досліду й обробка результатів. Беруть наважку масою 0,5 –

2,5 г (у залежності від очікуваного вмісту каротину) з похибкою не більше 0,05

г, переносять у порцелянову ступку, додають 3 г піску, 7,5 г сульфату натрію,

бікарбонат натрію на кінчику шпателя. Суміш ретельно розтирають не менш 3

– 4 хв. Добре розтертий і знезводнений зразок кількісно переносять у колбу

ємністю 100 мл, доливають 50 мл органічного розчинника, обмивши ступку і

товкачик його мінімальною кількістю. Додають у колбу 5 г оксиду алюмінію

10%-ї вологості і 0,5 г розтертого до порошкоподібного стану оксиду кальцію,

перемішують скляною паличкою, щільно закривають колбу пробкою.

Щільно закриту колбу вміщують на 30 хв. у попередньо нагрітий до 35°С

термостат. Потім проби прохолоджують до кімнатної температури. З метою

безпеки роботи треба стежити за строгим дотриманням температури під час

термостатування. Перед роботою необхідно переконатися в справності

термостата і правильності показань термометра.

Після термостатування, не змучуючи, відбирають шприцем прозорий

відстояний розчин і переносять у кювету фотоелектроколориметра.

Вимірювання оптичної густини екстрактів каротину проводять проти

органічного розчинника.

За оптичної густини розчину більше 0,7 у мірну колбу ємністю 50 мл

вносять 25 мл аналізованої витяжки, доводять до мітки органічним

розчинником, перемішують і знову колориметрують. Отримані результати

подвоюють.

Вміст каротину (X, мг/кг) у зразку натуральної вологості обчислюють за

формулою:

1000

V00416,0

X 





де V — об’єм основного розчину, знайдений за графіком, мл; т — маса

наважки, г; 0,00416 — коефіцієнт перерахунку оптичної густини біхромату

калію у кількість каротину.

8.2 Біотехнологія отримання рибофлавіну (закінчення).

У ході ферментації Eremothecium ashbyii упродовж перших 30-40 год

майже повністю розходуються вуглеводи, після чого відзначається інтенсивний

біосинтез рибофлавіну з накопиченням його у культуральній рідині.

Накопичення рибофлавіну у культуральній рідині співпвдвє за часом з

початком автолізу культури. У глибинній культурі Eremothecium ashbyii вміст

рибофлавіну упродовж перших двох діб приблизно однаковий як у міцелії, так і

в культуральній рідині. Починаючи з третьої доби, переважна кількість

рибофлавіну знаходиться у культуральній рідині, а вміст його у міцелії різко

падає.

Слід відмітити, що рибофлавін присутній у культуральній рідині у вільній

формі. У клітинах Eremothecium ashbyii він зустрічається у вигляді

флавінаденіндинуклеотиду і вільного вітаміну, розташованого у вигляді жовтих

кристалів у вакуолях.

Одержання технічного кристалічного рибофлавіну. Для одержання

кристалічного РФ культуральну рідину, одержану після культивування E.

аshbyii, нагрівають до температури 95–100 °С. За таких умов весь рибофлавін

виходить з клітин. Далі здійснюють центрифугування розчину, одержаний

супернатант охолоджують до 18–20 °С, доводять рН до 4,5–5,0 і осаджують

рибофлавін з розчину за допомогою гідросульфіту. Після декантації осад

промивають, центрифугують, висушують і подрібнюють.

Визначення процентнтного вмісту в кристалічному препараті

Точну наважку препарату в кількості 0,01 г переносять у мірну колбу

ємністю 250 мл, розчиняють у воді при нагріванні і доводять водою до мітки. З

отриманого розчину відбирають 1 мл в мірну колбу ємністкою 100 мл і

доводять водою до мітки.‹У к’ювету флуорометра переносять 10 мл отриманого

розчину і вимірюють інтенсивність його флуоресценції у порівнянні зі

стандартним розчином.

Вміст рибофлавіну у відсотках у продукті (х) обчислюють за формулою:

де А

- показання флуорометра для дослідного розчину;

250 - перше розведення в мл;

100 - друге розведення в мл;

0,4 - концентрація стандарту в γ;

100 - перерахунок у%;

А - показники флуорометра для стандартного розчину;

0,01 - наважка у г;

1 - кількість розчину, взята для другого розведення, в мл;

1000 - перерахунок у мг;

1000 - перерахунок у г.

Визначення процентнтного вмісту в технічному продукті

Зразки рибофлавіну можуть бути забруднені флуоресцентними домішками.

Обробкою гідросульфітом натрію рибофлавін відновлюють у лейкофлавін,

який втрачає здатність до флуоресценсії, тоді як домішки не

відновлюються.‹По різниці в інтенсивності флуоресценції оброблених і

необроблених гідросульфітом розчинів судять про кількість рибофлавіну.

Точну наважку випробуваного продукту в кількості 0,01 г переносять у

мірну колбу ємністю 250 мл, розтворюють у воді і доводять водою до

мітки.‹Якщо отриманий отриманий розчин має інтенсивну флуоресценцію,

проводять друге розведення.‹Для цього відбирають 1 мл розчинити у мірну

колбу ємністю 100 мл і доводять об'єм розчину до мітки водою.‹З отриманого

розчину відбирають дві проби:

а) 8 мл розчину переносять в кювету для вимірювання флуоресценції і

доводять водою до 10 мл.‹Вміст цієї кювети надходить безпосередньо на

вимірювання інтенсивності флуоресценції;

б) 8 мл переносять у конічну колбу ємністю 50-100 мл, туди ж по краплях

додають 4% розчин перманганату калію до появи незникаючого розового

забарвлення.‹Після цього вміст колби залишають на 10 хвилин і потім

надлишок внесеного перманганату видаляють, додаючи по краплях 3% розчин

. До вмісту колби додають 0,2 мл розчину хлористого олова і 0,1 мл

розчину гідросульфіту натрія, після чого вміст колби енергійно струшують

протягом 20 хвилин, а потім кількісно переносять у мірну колбу чи точно

градуйований циліндр і доводять водою до‹обсягу 10 мл.‹Отриманий розчин

фільтрують в к’ювету флуорометра.

Вміст обох кювет надходить на вимірювання флуоресценції.

Примітка. Якщо при окисленні перманганатом розчин у другій колбі від

додавання 1 краплі перманганату забарвлюється в рожевий колір, що заважає

вимірюванню флуоресценції домішок у дослідному розчині не міститься, тоді

при розрахунку приймають до уваги показання флуорометра для першої

кювети, вміст, якої не піддавалося окисненню.

Вміст рибофлавіну у відсотках (х) обчислюють за формулою:

де 100 - друге розведення в мл;

10 - третє розведення в мл;

0,01- наважка у г;

8 - кількість розчину, взята на окислення, в мл;

Інші позначення див. вище.

Визначнння в драже і таблетках

Близько 1 г порошку розтертих драже або таблеток (точна наважка)

розчиняють при нагріванні у воді, переносять у мірну колбу ємністю 250 мл,

охолоджують, доводять до мітки водою і фільтрують.‹З фільтрату відбирають 5

мл у мірну колбу ємністю 250 мл, доводять об'єм до мітки водою і

перемішують.‹У дві кювети флуорометра переносять 8-10 мл випробуваного і

стандартного робочого розчину для вимірювання флуоресценції.‹Одночасно в

інші дві кювети переносять 8-10 мл випробуваного і стандартного робочого

розчину, додають близько 0,1 г бікарбонату натрію і гідросульфіту натрію для

гасіння флуоресценції рібофлавіну як у звичайному, так і у випробуваному

розчині, де залишається флуоресценція тільки сторонніх‹флуоресціюючих

речовин.

Результат вимірювання порівнюють з показанням флуорометра для

стандартного робочого розчину рибофлавіну.

Вміст рибофлавіну в 1 шт.‹драже або таблеток у міліграмах (х)

обчислюють за формулою:

де А - показання флуорометра для випробуваного розчину;

В - показання флуорометра для випробуваного розчину після гасіння;

- показання флуорометра для робочого стандартного розчину;

- показання флуорометра для стандартного розчину після гасіння;

0,4 - концентрація стандартного розчину рибофлавіну в γ;

А - наважка у г;