Буценко Л.М., Красінько В.О. Технології мікробного синтезу лікарських засобів: Лабор. практикум

Подождите немного. Документ загружается.

Для ідентифікації і тестування чутливості мікроорганізмів до антибіотиків

можна використовувати мікробіологічні аналізатори, зареєстровані і дозволені до

використання в Україні

Біотехнологія отримання хлортетрацикліну (початок).

Приготування поживного середовища. Актиноміцетам для розвитку

потрібні певні співвідношення вуглецю та азоту в середовищі. Вони чутливі до

сольового складу і наявності стимуляторів росту.

Джерелом вуглецю під час культивування S. aureofaciens є крохмаль,

борошно, цукор, гліцерин. Як джерело азоту використовують NH

чи

(NH

)

Кукурудзяний екстракт покриває нестачу органічного азоту і ростових

речовин. До складу поживного середовища входять сіль і крейда.

Варіанти середовищ наведено в таблиці 2.1.

Розчин роданистого бензилу готують так: наважку 5 мг розчиняють у 25 мл

стерильної олії і по 0,5 мл вносять у стерильне поживне середовище.

Для кожного варіанта готують 250 мл поживного середовища. Спочатку зважують

кукурудзяний екстракт і розчиняють у 30 – 40 мл киплячої водопровідної води,

вносять наважки солей (останньою – крейду). Об'єм доводять до 130 – 150 мл і

нагрівають до кипіння, після чого добавляють джерело вуглецю (борошно чи

крохмаль попередньо змішують з 50 мл води і при постійному перемішуванні

вливають киплячу рідину до повної клейстеризації крохмалю). Потім об'єм

середовища після охолодження до 40 ºС доводять до 260 мл (враховуючи

розширення при 40 ºС). Відразу після перемішування поживне середовище

розливають по 100 мл у колби місткістю 750 мл і готують до стерилізації.

Визначення рН середовища. У поживному середовищі, що залишилося,

визначають рН потенціометрично. рН середовища повинно бути 6,6. Якщо рН

середовища відрізняється від вказаної величини, добавляють 1 н. розчин NaOH чи

1 н. розчин HCl .

Підготовка й стерилізація посуду. Стерилізація поживного середовища.

Для першого заняття слід мати стерильний бюкс для наважки роданистого

бензилу, шпатель, ложку для засівання, мірну колбу на 25 мл, піпетку на 1 мл

(градуйовану), колбу з олією.

Всі перелічені предмети та посуд повинні бути чисті й сухі. Потім кожен

предмет окремо загортають у папір.

Колбу з олією закривають ватно-марлевою пробкою і зверху папером.

Колби з поживним середовищем закривають ватно-марлевими пробками та

папером, на якому простим олівцем пишуть номер варіанта і прізвище студента.

Підготовлений посуд і поживні середовища завантажують в автоклав. Поживне

середовище і посуд стерилізують під тиском 0,1 мПа протягом 30 хв.

Засів середовища та внесення стимулятора. Перш ніж зробити засів,

готують розчин стимулятора. В стерильний бюкс стерильним шпателем беруть

наважку роданистого бензилу в кількості 5 мг і переносять у стерильну мірну

колбу на 25 мл, розчиняють у стерильній олії і доводять олією до риски.

Засів проводять удвох, попередньо підготувавши все для стерильної роботи:

1. У кожну колбу з середовищем вносять піпеткою по 0,5 мл олії зі

стимулятором, дотримуючись правил асептики.

2. Відбирають із флакона стерильною ложкою п’ять – шість зерен

пшона і вносять у колбу з середовищем. Ложку обпалюють над полум'ям і

засівають іншу колбу.

Засіяні колби закривають пробками, підписують і ставлять на качалку при

температурі 28 ºС.

Таблиця 2.1

Варіанти середовищ для отримання хлортетрацикліну

Варі-

ант

Кукурудзяний

екстракт

(за СР)

Вміст компонентів, % *

Крохмаль

Глюко-

за

Гліце-

рин

Мальто-

за

Цукроза NaCl NH

CaCO

(NH

)

картоп-

ляний

кукуру-

дзяний

1 0,5 2,5 - - - - - 0,2 - 0,5 0,5

2 0,5 2,0 - - - - - 0,4 0,5 0,2 -

3 0,5 - 4,0 - - - - 0,8 0,7 0,5 -

4 0,5 - - 8,0 - - - 0,8 0,7 0,5 -

5 0,5 - - - 5,0 - - 0,4 0,4 0,8 -

6 0,5 - - - - 3,0 - 0,3 0,5 0,5 -

7 0,5 - - - - - 5,0 0,3 0,7 0,5 -

_______________

* Роданистого бензилу для всіх варіантів – 0,0001 %.

Контрольні запитання

1. Яким чином розраховують вміст антибіотика в сухому препараті при

аналізі його розчину біологічним методом?

2. Охарактеризуйте основні етапи промислового виробництва

антибіотиків.

3. Значення джерел вуглецю, азоту і мікроелементів в утворенні

антибіотиків.

4. Охарактеризуйте продуцент хлортетрацикліну?

5. Яке значення має роданистий бензил в процесі біосинтезу

антибіотика?

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА 3.

БІОТЕХНОЛОГІЯ ОТРИМАННЯ ХЛОРТЕТРАЦИКЛІНУ

(ЗАКІНЧЕННЯ).

Хлортетрациклін є препаратом виключно сільськогосподарським. На його

основі випускають препарат Біоміцин (табл. 3.1). Застосування біоміцину

викликає зміни у мікрофлорі шлунково-кишкового тракту, зменшується вміст

токсино-утворюючих бактерій. Введення невеликих доз біоміцину в кормовий

раціон покращує ріст тварин. Препарат ветеринарного призначення для

лікування та профілактики захворювань сільськогосподарських тварин і птахів.

Таблиця 3.1.

Основні характеристики готового препарату Біоміцин.

Найменування показників Значення

Масова частка вологи % не більше

( за ГОСТ 13496.3-80)

Масова частка залишків після просіювання

на ситі з шовкової тканини №21 % не більше

№27 % не більше

Масова частка ХТЦ, г/кг:

фізико-хімічним методом

мікробіологічним методом

Масова частка вітаміну В

, мкг/г не менше 8

Не шкідливість при тест-дозі на одну мишу ,

мг

100

Зовнішній вигляд однорідний,

сипучий

порошок

Колір від світло-

коричневого до

коричневого

Про закінчення процесу ферментації свідчать наступні показники:

1 накопичення хлортетрацикліну до 5000 мг/см

і більше;

1 остаточний вміст ЗРР культуральної рідини – 0.2%;

1 остаточний вміст аміачного азоту – 0.001%;

1 морфологічний стан міцелію продуцента;

1 збільшення рН культуральної рідини до 6.3-6.5;

1 зупинення накопичення хлортетрацикліну.

Після ферментації культуральна рідина надходить на стадію відділення

міцеліальної маси, яку потім знімають з фільтрів і висушують на парових

сушарках. За другим способом культуральну рідину без фільтрації висушують

на розпилюючій сушарці. Більша частина ХТЦ знаходиться в міцелії. ХТЦ,

який знаходиться в культуральній рідині, можна осадити при простому

підкисленні при рН 7,5-8,0. Товарний препарат одержують висушуванням

вологого осаду, який надходить з фільтрпресів.

ХТЦ витримує температуру 100 ºС, тому для його отримання в сухому

вигляді сушіння триває 3,5-4години і значення кінцевої вологості препарату

6%. Сушильним агентом є повітря (40-50ºС в стрічкових сушарках, в

розпилювальній сушарці температура до 200ºС).

Завдання для виконання студентами

Аналіз культуральної рідини після культивування

Культивування триває на качалці протягом 72 год. Накопичення ХТЦ

відбувається в міцелії поступово і досягає максимум на 66–72 год

культивування.

Відбір проби для визначення активності антибіотика. Для визначення

активності антибіотика ХТЦ проводять стерильний відбір проби,

дотримуючись усіх правил асептики (10–15 мл разом із міцелієм). До відібраної

проби добавляють по краплях стерильний 2 н. розчин соляної кислоти і

перевіряють рН універсальним індикатором. Добавлення продовжують доти,

поки рН розчину не досягатиме значення 2–2,5.

Пробу після підкислення закривають і залишають на 20 хвилин. За цей

час відбувається перехід антибіотика з міцелію, після чого культуральна рідина

готова до визначення антибіотичної активності.

Визначення рН культуральної рідини. рН культуральної рідини

визначають потенціометрично.

Визначення активності хлортетрацикліну (біоміцину).

а) Колориметричний метод визначення хлортетрацикліну (біоміцину) –

див. лабораторну роботу 1.

б) Біологічний метод визначення біоміцину визначають мікробіологічним

методом з Escherichia coli 113-3 у якості тест-мікроорганізму

Матеріали та обладнання: ФЕК з набором кювет, рефрактометр, рН-

метр, лакмусовий папір, технічні ваги, реактиви для виконання аналізу вмісту

редукуючих речовин за Бертраном (див. дод.), азоту амінокислот мідним

способом (див. дод.), ХТЦ колориметричним методом. Крім того, на кожну

бригаду дві стерильні качалочні колби об’ємом 250 мл, одна пробірка з

культурою продуцента ХТЦ S. aureofaciens , вирощеною на скошеному

агаризованому середовищі, одна чашка з МПА.

Контрольні запитання

1. Хімічна будова хлортетрацикліну.

2. На чому ґрунтується біологічна дія хлортетрацикліну?

3. Сфери використання антибіотика хлортетрацикліна.

4. Дайте характеристику технології одержання біоміцину кормового.

5. Охарактеризуйте динаміку споживання компонентів поживного

середовища.

6. Які методи технологічного контролю застосовуються в одержанні

біоміцину?

7. Які принципи лежать в основі методів визначення активності ХТЦ?

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА 4.

ВИЗНАЧЕННЯ АКТИВНОСТІ ФЕРМЕНТІВ. АНАЛІЗ

ФАРМАЦЕВТИЧНИХ ФЕРМЕНТНИХ ПРЕПАРАТІВ.

ПОВЕРХНЕВЕ КУЛЬТИВУВАННЯ ДЛЯ ОДЕРЖАННЯ ФЕРМЕНТІВ

(ПОЧАТОК).

Деякі ферменти містять специфічні хімічні структури, що можуть бути

ідентифіковані за допомогою хімічних або спектрофотометричних методів.

Однак таких ферментів дуже мало.

В більшості випадків кількість ферментів визначають за наслідками їх дії

– шляхом вимірювання швидкості реакції, що каталізується досліджуваним

ферментом. У такому випадку кількість ферменту не можливо виразити в

абсолютних одиницях – грамах або молях, тому зазвичай кількість ферментів

виражають в умовних одиницях активності. За одиницю активності ферменту

(позначають Е в україномовній та російськомовній літературі, U в англомовній

літературі) приймають кількість ферменту, яка каталізує перетворення одного

мкмоль субстрату за одну хвилину у заданих стандартних умовах (Enzyme

Nomenclature Recommendations, 1964).

Часто кількість субстрату неможливо виразити числом мкмоль, оскільки

невідома точна маса молекули, наприклад, за дії ферменту на крохмаль, білок,

пектин, целюлозу. В таких випадках враховують мікроеквіваленти задіяних

реакцією груп. Так, у разі гідролізу білка враховують не кількість молекул, що

гідролізуються, а число вільних карбоксильних або аміно груп, тобто число

розщеплених пептидних зв’язків.

Крім цього активність ферментів може бути виражена в таких одиницях,

як катал (Enzyme Nomenclature Recommendations, 1972). Катал – це така

каталітична активність, яка збільшує швидкість реакції на 1 моль/с в певній

тест-системі.

1 мкмоль/хв. = 1 Од. акт. = 16,67 нкат

Активність ферментних препаратів. Вміст ферменту в препараті

виражають у стандартних одиницях активності ферменту на 1мл ферментного

розчину або 1г препарату.

Питома активність ферментних препаратів – це величина, яка показує

співвідношення між активним і загальним білком в препараті. Це кількість

одиниць активності ферменту, що припадає на 1 мг білка. Ферментативна

активність визначається за стандартним методом для даного ферменту, а

кількість білка визначається за методом Лоурі (або іншим методом визначення

кількості білка).

4.1. Ферменти амілолітичного комплексу

Всі ферменти амілолітичного комплексу належать до класу гідролаз,

другого підкласу – ферментів, які каталізують гідроліз глікозидних сполук, і

підпідкласу глікозидаз.

У комплекс ферментів амілолітичної дії входять - і  -амілази,

глюкоамілаза і комплекс ферментів, який називається декстриназою.

-амілаза (-1,4-глюкан-глюканогідролаза), (КФ 3.2.1.1) каталізує розрив

внутрішніх -1,4-глікозидних зв’язків крохмалю, тому її називають

ендоамілазою. Під дією -амілази відбувається розрідження крохмалю

внаслідок накопичення декстринів і деякої кількості мальтози.

-амілаза (-1,4-глюкан-мальтогідролаза), (КФ 3.2.1.2) є ферментом

екзодії і гідролізує -1,4-глікозидні зв’язки та передостанні зв’язки у лінійних

ділянках амілози і амілопектину, послідовно відщеплюючи залишки мальтози із

нередукуючого кінця ланцюга. При цьому шляхом інверсії утворюється  -

мальтоза.

Глюкоамілаза або екзо-1,4-глюкозидаза (-1,4-глюкан-глюкогідролаза),

(КФ 3.2.1.3) також є екзоферментом, гідролізує крохмаль, відщеплюючи

послідовно залишки глюкози із нередукуючого кінця ланцюга. Фермент

споріднений не тільки до -1,4-глікозидних зв’язків, а й до -1,6-зв’язків, які

гідролізуються із значно меншою швидкістю.

Декстриназа – комплекс ферментів, котрі діють на розгалужені субстрати

із великою кількістю -1,6-зв’язків.

Визначення амілолітичної активності колориметричним методом

Метод базується на гідролізі крохмалю ферментами амілолітичного

комплексу до декстринів різної молекулярної маси. Кількість

прогідролізованого крохмалю встановлюють за зміною його забарвлення з

йодом в результаті дії амілаз. Інтенсивність забарвлення з йодом вихідного

крохмалю та одержаних в результаті гідролізу декстринів вимірюють на

фотоколориметрі.

За одиницю амілолітичної активності (АС) взято таку кількість ферменту,

яка в стандартних умовах каталізує гідроліз 1 г розчинного крохмалю до

декстринів різної молекулярної маси. При цьому кількість прогідролізованого

крохмалю має становити не більш як 30 % вихідного.

Активність препарату (амілолітична здатність) виражається числом

одиниць активності в 1 г препарату.

Прилади, посуд, реактиви

Фотоелектроколориметр; пробірки великі; піпетки мірні;

ультратермостат; колби конічні місткістю 100 мл;

1%-й розчин крохмалю (субстрат): наважку розчинного крохмалю (1 г з

урахуванням вологості), вміщують у мірну колбу місткістю 100 мл, добавляють

25 мл води і перемішують. Потім добавляють ще 25 мл води і вміщують колбу в

киплячу водяну баню, де витримують 25 хв, безперервно перемішуючи до

повного розчинення крохмалю. Після охолодження додають 10 мл буфера

(ацетатного з рН 4,7 – для аналізу грибних препаратів або фосфатного з рН 6,0

– для аналізу бактеріальних препаратів) і об’єм рідини доводять дистильованою

водою до мітки.

Перевіряють оптичну густину субстрату: до 100 мл розчину крохмалю в

пробірці додають 5 мл дистильованої води, добре перемішують і 0,5 мл

одержаного розчину переносять у конічну колбочку з 50 мл робочого розчину

йоду. Забарвлений розчин колориметрують на фотоелектроколориметрі з

червоним світлофільтром у кюветі з довжиною грані 1 см. Оптична густина має

становити не менш як 0,7;

Буферні розчини: ацетатний буфер рН 4,7. Готують 1 н. розчини: 1 н.

розчин оцтової кислоти: 57,25 мл (60,12 г) льодяної оцтової кислоти на 1 л;. 1

н. розчин ацетату натрію: 136,09 кристалічного оцтовокислого натрію або 86 г

безводного на 1 л. Для одержання буферного розчину з рН 4,7 нормальні

розчини кислоти та солі перемішують у співвідношенні 1 : 1 (рН перевіряють

на потенціометрі); фосфатний буфер рН 6,0, для приготування якого

використовують двозаміщений фосфорнокислий натрій – 11,876 г на 1 л та

однозаміщений фосфорнокислий калій – 9,078 г на 1 л. Наважки солей

розчиняють у дистильованій воді і об’єм розчинів доводять у мірних колбах до

1 л. Для одержання буфера з рН 6,0 вихідні розчини перемішують у

співвідношенні 1 : 9 (рН перевіряють на потенціометрі);

Основний розчин йоду: наважку 0,5 г металічного йоду і 5,0 г йодистого

калію вміщують у бюкс з притертою кришкою і добавляють 2 мл дистильованої

води. Після повного розчинення йоду розчин переносять у мірну колбу на 200

мл з притертою пробкою і об’єм розчину доводять до мітки дистильованою

водою. Основний розчин йоду зберігають у темряві і використовують протягом

1 міс;

Робочий розчин йоду: в мірній колбі розводять 2 мл основного розчину

йоду 0,1 н. розчином соляної кислоти до 100 мл. Перед використанням

перевіряють оптичну густину на ФЕК з синім світлофільтром у кюветі з

довжиною грані 1 см. Оптична густина має бути 0,160. У разі відхилення цю

величину доводять до потрібної додаванням декількох крапель 0,1 н. розчину

соляної кислоти або основного розчину йоду.

Техніка визначення

Ферментну реакцію гідролізу крохмалю здійснюють у стандартних

умовах: температура 30 ºС, рН середовища 6,0 – для бактеріальних препаратів

та 4,7 – для грибних, тривалість реакції 10 хв, концентрація субстрату – 1 %,

об’єм реакційної суміші 15 мл (10 мл субстрату та 5 мл ферментного розчину).

Для аналізу беруть дві великі пробірки, наливають у кожну по 10 мл 1%-

го розчину крохмалю і ставлять в ультратермостат з температурою 30 ºС на 10 –

15хв, щоб розчини набули температури 30 ºС.

Потім у першу пробірку наливають 5 мл дистильованої води

(контрольний зразок), у другу – 5 мл ферментного розчину (дослідна проба).

Суміші швидко перемішують і витримують в ультратермостаті 10 хв для

перебігу ферментативної реакції. Пробірки виймають з термостата, з кожної

відбирають по 0,5 мл реакційної суміші і переносять у конічні колбочки, в які

попередньо налито по 50 мл робочого розчину йоду, приготованого на 0,1 н.

розчині соляної кислоти. Вміст колб перемішують – одночасно відбувається

інактивація ферменту та йод-крохмальна реакція.

Розчини набувають забарвлення: одержаний із контрольної проби – синє,

одержаний із дослідного розчину – фіолетове різної інтенсивності, залежно від

ступеня гідролізу крохмалю.

Оптичні густини одержаних забарвлених розчинів визначають на

фотоелектроколориметрі, застосовуючи кювети з довжиною грані 1 см та

світлофільтр з довжиною світлової хвилі 656 нм (червоний світлофільтр).

Вимірювання проводять проти води за інструкцією, доданою до кожного

приладу. Отримують два значення оптичної густини: D

– контрольного

розчину, яка характеризує кількість крохмалю, взятого на ферментативну

реакцію (значення D

має бути не менш як 0,7) та D

– дослідного розчину, яка

характеризує кількість крохмалю та декстринів у реакційній суміші.

Кількість прогідролізованого крохмалю, г,

1,0







(1)

Якщо кількість прогідролізованого крохмалю менш як 0,02 або більш як

0,7, то аналіз повторюють відповідно з більшим або меншим розведенням

вихідного ферментного розчину. Амілолітичну активність визначають з

рівнянь, одержаних в результаті математичного опрацювання

експериментальних даних з вивчення залежності між кількістю взятого на

аналіз ферменту та ступенем гідролізу крохмалю (в коефіцієнти введено

перерахунок на 1 год дії ферментів).

У разі різниць ферментних комплексів препаратів грибного та

бактеріального походження і специфічності їх дії розрахунок активності

проводиться за рівняннями, які характерні тільки для аналізу даного роду

ферментних препаратів.

Рівняння для розрахунку амілолітичної активності мають такий вигляд:

для ферментних препаратів грибного походження

100

03766,0C264,7





од./г, (2)

для ферментних препаратів бактеріального походження

100

001671,0C885,5





од./г, (3)

де С – кількість крохмалю, прогідролізованого в період реакції, г; n –

кількість ферментного препарату, взятого на аналіз, мг.

Для вираження амілолітичної активності в міжнародних одиницях

одержану величину АС слід помножити на 103 стандартні міжнародні одиниці

розмірністю мікромоль/хв.

Приклад розрахунку. Для аналізу взято препарат амілоризин П10х.

Приготовлено його розчин 0,1 г препарату на 100 мл води. Із цього вихідного

розчину виготовлено робочий розчин – 2мл вихідного розчину розведено до

200 мл водою. Тоді в 5 мл робочого розчину, які використовують для

проведення ферментативної реакції, буде вміщуватись 0,05 мг препарату або n.

Одержані значення оптичної густини:

=0,745 і D

=0,463.

Кількість прогідролізованого крохмалю

03785,01,0

745,0

463,0745,0

C 





г.

Тоді активність даного препарату буде

5,4741000

05,0

03766,003785,0264,7

AC 





од./г.

Визначення амілолітичної активності крапельним методом

Амілолітична активність визначається крапельним методом візуальним

спостереженням за зміною забарвлення крохмалю з йодом під дією на крохмаль

амілаз. Вона характеризує властивість каталізувати гідроліз крохмалю до

незабарвлених йодом декстринів, зумовлену в основному наявністю у препараті

-амілази. За наявності у препараті -амілази і глюкоамілази цим методом

визначають сумарну дію всіх амілолітичних ферментів.

За одиницю амілолітичної активності взято таку кількість ферменту, яка

каталізує розщеплення 1 г розчинного крохмалю до продуктів, не забарвлених

йодом, за 1 год при температурі 30 ºС у строго визначених умовах.

АС визначається числом одиниць у 1 г препарату, культури або 1 мл

розчину. АС показує , скільки грамів крохмалю може бути прогідролізовано до

не забарвлених йодом продуктів 1 г препарату, культури або 1 мл розчину за 1

год (в умовах, аналогічних умовам визначення).

Методика визначення АС залежить від гідролізу 1 %-го забуференого

розчину крохмалю; кінець реакції контролюють візуально за йодною пробою.

Чутливість методу визначається мінімальною кількістю часу, за який

можна візуально визначити зміну забарвлення йоду.

Допускають, що швидкість ферментативної реакції прямо пропорційна

кількості застосованого ферменту і залишається сталою від 5 хв до 1 год, тобто

реакція підпорядковується закону реакції нульового порядку.