Буценко Л.М., Красінько В.О. Технології мікробного синтезу лікарських засобів: Лабор. практикум

Подождите немного. Документ загружается.

таких як світло, звук, тощо;

4) імобілізація та/чи модифікація ферментів полегшує цілеспрямовану

зміну властивостей каталізатора, включаючи специфічність, залежність

каталітичної активності від рН, іонного складу та інших параметрів середовища.

Методи іммобілізації:

адсорбція ферментів на нерозчинних носіях;

іммобілізація ферментів шляхом включення в гель;

іммобілізація ферментів в напівпроникні структури (мікрокапсулювання

та включення ферментів в ліпосоми);

іммобілізація шляхом утворення ковалентного зв’язку між ферментом та

носієм.

Найбільш простий метод іммобілізації ферментів - це адсорбція на

нерозчинному носії. Процедура іммобілізації полягає у змішуванні за певних

умов ферменту та носія, інкубації та відокремленні нерозчинного

компоненту суміші від розчинного центрифугуванням або фільтруванням.

Головним недоліком цього методу є те, що фермент може зв'язуватися з

носієм недостатньо міцно. Наприклад, оскільки адсорбція ферментів на

такому носії, як ДЕАЕ-сефадекс, здійснюється переважно за рахунок

множинних сольових зв'язків, на такого роду зв'язки впливають навіть

незначні зміни експериментальних умов: рН, іонної сили, температури та

природи розчинника, – що може призвести до десорбції ферменту з носія.

Десорбцію ферменту може викликати також субстрат. Крім сольових зв'язків у

взаємодії ферменту з носієм можуть брати участь і інші слабкі сили,

наприклад водневі чи Ван-дер-вальсові.

Матеріали, які використовуються для адсорбції ферментів: оксид

алюмінію, бентоніт, карбонат кальцію, гель фосфату кальцію, вугілля, целюлоза,

глина, колаген, конканавалін А-сефароза, пористе скло, гідроксиапатит,

іонообмінні смоли, каолін, фенольні полімери, силікагель.

У ідеальному випадку іммобілізація ферментів не повинна призводити до

втрати каталітичної активності. Активність іммобілізованих ферментів можна

визначати практично всіма відомими методами. При аналізі іммобілізованих

ферментних препаратів необхідно постійно перемішувати реакційну суміш,

тому що можливе осідання частинок носія і зменшення активності. Для

зупинки ферментативної реакції при аналізі можна використовувати відділення

ферменту від реакційної суміші фільтруванням або центрифугуванням.

Завдання для виконання студентами.

1. Приготувати розчини амілолітичного або протеолітичного ферментів

1% концентрації.

2. Очистити розчин від сторонніх домішок (фільтруванням або

центрифугуванням).

3. Визначити активність ферменту (методи див. вище).

4. Наважку носія (силікагель) 1 г залити 20 мл розчину ферменту.

5. Витримати суміш 30-60 хв при кімнатній температурі періодично

перемішуючи.

6. Відділити носій від ферментного розчину фільтруванням через

паперові фільтри та промити його дистильованою водою (100 мл).

7. Висушити носій з ферментом за температури 40 С.

8. Визначити активність імобілізованого ферменту.

Під час визначення активності замість розчину ферменту вносити в

реакційну суміш 50-100 мг імобілізованого ферментного препарату і

дистильовану воду в об’ємі рівному об’єму ферментного розчину за

методикою.

9. Розрахувати вихід активності при імобілізації:

В = А

імоб.

/А

вих.

*100%, де

А – загальна кількість одиниць активності ферменту на носії, А – загальна

кількість одиниць активності ферменту в розчині, що використовувався для

імобілізації.

10. Результати роботи звести у таблицю:

Назва

ферментного

препарату

Активність

нативного

препарату

Активність

імобілізованого

препарату

Вихід ферменту

при імобілізації

Контрольні запитання.

1. Назвіть переваги іммобілізованих ферментів.

2. Охарактеризуйте носії для іммобілізації ферментів.

3. Які методи використовують для іммобілізації ферментів?

4. Які особливості визначення активності іммобілізованих

ферментів?

5. Наведіть приклади використання іммобілізованих ферментних

препаратів в медицині.

6. Які методи дозволяють уникнути втрат ферменту під час

іммобілізації?

7. Як може змінюватися активність ферменту при іммобілізації?

8. Які недоліки іммобілізації ферментів сорбцією на твердому носії?

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА 7.

МЕТОДИ ВИЗНАЧЕННЯ ВОДОРОЗЧИННИХ ВІТАМІНІВ.

БІОТЕХНОЛОГІЯ ОТРИМАННЯ РИБОФЛАВІНУ (ПОЧАТОК).

Вітаміни – це низькомолекулярні органічні речовини, здатні у дуже

низьких концентраціях спричиняти сильну і різноманітну біологічну дію.

Вітаміни у невеликій кількості необхідні для забезпечення нормального обміну

речовин і фізіологічних функцій, не синтезуються в організмі і є

обов’язковими компонентами харчових продуктів. За фізико-хімічними

властивостями вітаміни поділяються на дві групи: водорозчинні (вітаміни

групи В, вітаміни С, N, Р) і жиророзчинні (вітаміни А,Е, D, F, К).

У природі джерелом вітамінів є головним чином рослини та

мікроорганізми. Менахінони та кобаламіни синтезуються виключно

мікроорганізмами. Мікробіологічним шляхом одержують ергостерин, вітамін

, вітамін В

, а також β-каротин – попередник вітаміну А (табл. 7.1).

В останні роки з’явились повідомлення про отримання рекомбінантного

штаму Escherichia coli – продуцента вітаміну В

. Цей штам, трансформований

генами, що кодують синтез пантотенової кислоти, стійкий до саліцилової і/або

інших кислот, продукує 65 г/л вітаміну В

з глюкози з використанням β-аланіну

як попередника. Отримано також рекомбінантний штам Serratia marcescens,

здатний до біосинтезу біотину з глюкози.

Крім того, мікроорганізми використовуються для здійснення окремих

реакцій трансформації у процесі одержання ряду водорозчинних вітамінів

Таблиця 7.1.

Вітаміни мікробного походження

Вітаміни Продуценти

(ціанкобаламін) Propionibacterium shermanii,

Eubacterium limosum (Butyribacterium rettgerii),

Nocardia rugosa,

Micromonospora purpureae,

Methnosarcina barkeri,

Clostridium thermoaceticum,

Pseudomonas denitrificans,

Bacillus circulans,

Rhodobacter capsulatus,

Rhodospirillum rubrum,

(рибофлавін) Eremothecium ashbyii,

Ashbyii gossypii,

Candida flaveri,

Mycocandida riboflavina,

Mycobacterium smegmatis,

Clostridium acetobutylicum,

Ергостерин (вихідний

продукт для одержання

вітаміну D

)

Saccharomyces carlsbergensis,

Saccharomyces ellipsoideus,

Rhodotorula glutinis,

Candida utilis,

Candida guilliermondii,

Candida tropicalis,

-каротин (попередник

вітаміну А)

Blakeslea trispora,

Choanephora conjuncta,

Rhodosporidium diobovatum,

Mycobacterium rubrum,

Якісні реакції на водорозчинні вітаміни, що отримують мікробним

синтезом

Реакція відновлення рибофлавіну

Реакція базується на відновленні рибофлавіну воднем, який утворюється

при додаванні металевого цинку до концентрованої соляної кислоти. При цьому

жовтий рибофлавін відновлюється в родофлавін (сполука має червоне

забарвлення), а потім в безбарвний лейкофлавін.

Обладнання і реактиви.

Концентрована соляна кислота, металевий цинк, 0,025% розчин вітаміну

, пробірки, піпетки.

+Zn +2HCl= + ZnCl

Окислена форма Відновлена форма

Техніка визначення.

В пробірку наливають 1 мл розчину рибофлавіну, 0,5 мл концентрованої

соляної кислоти і занурюють шматочок металевого цинку. Водень, що

утворюється, відновлює рибофлавін і рідина поступово забарвлюється в

рожевий колір, а потім знебарвлюється. Після збовтування безбарвний розчин

лейкофлавіну знову окислюється киснем повітря і розчин набуває жовтого

забарвлення.

Визначення загальної кількості рибофлавіну

Наважку випробуваного матеріалу ретельно розтирають у ступці з

невеликою кількістю фосфатного буферара (рН =7-8).‹Розтерту масу

переносять в колбу з допомогою буферного розчину з таким розрахунком, щоб

загальне розведення відповідало відношенню 1:15 або 1:20.‹Суміш витримують

на киплячій водяній бані в протягом 40 хвилин, охолоджують до 30 °С,

перевіряють рН і в разі зсуву в кислу зону, що часто спостерігається при роботі

з кислими об'єктами, знову доводять до 7,8-8,0, після чого‹до суміші додають

ферментний препарат (трипсин, панкреатин, клараза та ін) з розрахунку 30 мг

препарату на 1 г сухої речовини наважки.

Суміш поміщають у термостат і витримують в протягом 12-20 годин при

37 °С.‹У цих умовах відщеплюється міцно зв’язана з білком форма

рибофлавіну. Суміш доводять водою до певного об'єму з таким розрахунком,

щоб загальне розведення відповідало відношенню 1:25 або 1:30, і фільтрують

через складчастий фільтр.‹З фільтрату відбирають у колбу 5 мл, додають 5 мл

20% розчину трихлороцтової кислоти, поміщають у киплячу водяну баню і

витримують 10 хвилин.

Обробка трихлороцтової кислотою звільняє рибофлавін з його

нуклеотидних форм.‹Витяжку охолоджують і додають 1/4 обсягу 4 М розчину

НРО

з метою доведення рН до 6,0.‹Потім до витяжки додають по краплях 4%

розчин КМnО

до тих пір, поки червонувате забарвлення розчину не перестане

зникати (зазвичай це відповідає 0,2-0,5 мл).‹Витяжку залишають на 10 хвилин у

спокої, після чого до неї додають по краплях 3% розчин Н

до зникнення

забарвлення витяжки.‹До витяжки додають 0,2 мл робочого розчину SnCI

і 0,1

мл 2,5% розчину гідросульфіту натрію.‹Енергійно струшують протягом 20

хвилин.‹Обсяг витяжки доводять до 15 мл і в разі необхідності фільтрують.

Фільтрат надходить на вимірювання флуоресценції.

Витяжку і стандартний робочий розчин рібофлавіну, приготовлений на

трихлороцтовоій кислоті,поміщують у кювети флуорометра та інтенсивність

флуоресценції визначають за шкалою гальванометра.‹Потім в обидві пробірки

додають по 0,1 г NaНСО

і близько 0,1 г Na

і знов проводять вимірювання

флуоресценції.‹Флуоресценція рибофлавіну гаситься до нуля.‹У досліджуваних

витяжках залишається невелика флуоресценція, що викликана сторонніми

флуоресціюючими речовинами, які збереглися у витяжках, незважаючи на

вказану обробку.‹Гасіння флуоресценції рекомендується проводити 2-3 рази,

тому що в деяких випадках воно протікає дуже повільно. Для цього до проб

повторно додають гідросульфіт і знову вимірюють флуоресценцію розчинів.

Вміст рибофлавіну на 1 г речовини (х) визначають за формулою:

де А - показання флуорометра для випробуваного розчину (1-й відлік);

В - надання флуорометра для дослідного розчину після гасіння (2-й відлік);

с - показання флуорометра для стандартного розчину, що містить 0,4 γ

рибофлавіну, в мл;

0,4 - концентрація стандартного розчину рибофлавіну в γ;

а - наважка у г;

V - обсяг розведення в мл.

Реакція на цианкобаламін

При сплавленні вітаміну В

з гідросульфітом калію (KHSO

) або за дії

сильного окисника відбувається його руйнація. Кобальт, що є в його складі,

вивільняється і його можна визначити за реакцією з -нітрозо--нафтолом, з

яким кобальт утворює комплексну сполуку помаранчево-червоного кольору.

Комплексна сіль -нітрозо--нафтолу

Матеріали і реактиви.

Препарат вітаміну В

12,

концентровані азотна і соляна кислоти, 1 %

ацетоновий розчин -нітрозо--нафтолу, 10% розчин гідрофосфату натрію

(Na

HPO

), лакмус піпетки, газовий пальник, фарфоровий тигель.

Техніка визначення.

Половину вмісту ампули препарату вітаміну В

переносять у

фарфоровий тигель, випарюють досуха і проколюють на невеликому вогні.

Після охолодження доливають 1 мл концентрованої азотної кислоти і 3 мл

концентрованої соляної кислоти та кип’ятять у витяжній шафі до повного

випаровування води. Після охолодження розчиняють осад в одній краплині

води. Додають одну краплину ацетонового розчину -нітрозо--нафтолу і

краплями розчин гідрофосфату натрію до слабколужної реакції (за лакмусом).

За наявності іонів Co

спостерігають буро-червоне забарвлення, у разі

відсутності іонів Co

спостерігається жовто-зелене забарвлення.

Аскорбінова кислота

Вітамін С був виділений у 1928 р., проте зв’язок між захворюваністю на

цингу і недостачею вітаміну С було доведено лише у 1932 р. Вітамін С є γ-

лактоном, близьким за структурою до глюкози. Його молекула містить два

асиметричні атоми вуглецю (С4 і С5) і чотири оптичних ізомери. Біологічно

активна лише L-аскорбінова кислота

Синтез Рейхштейна. У 1933 р. було вперше здійснено хімічний синтез

аскорбінової кислоти. І вже у 1934 р. у хімічний синтез вітаміну С з глюкози

було введено одну біохімічну реакцію, здійснювану оцтовокислими бактеріями

– високоселективне дегідрування D-сорбіту у L-сорбозу.

Синтез Рейхштейна включає пять стадій:

1) отримання D-сорбіту з D-глюкози методом каталітичного відновлення

воднем при температурі 135-140С;

2) отримання L-сорбози з D-сорбіту шляхом біохімічного окислення

оцтовокислими бактеріями. Крім бактерій Gluconobacter suboxydans, для

перетворення D-сорбіту на L-сорбозу використовують також Acetobacter

xylinum і A. suboxydans.

3) отримання диацетон-L-сорбози з L-сорбози шляхом обробки ацетоном

в присутності каталізатора сірчаної кислоти, відгонка ацетону та виділення

диацетонсорбози лугом;

4) окислення диацетон-L-сорбози в гідрат диацетон-2-кето-L-гулонової

кислоти перманганатом калію в лужному середовищі з виділенням гідрату

диацетон-2-кето-L-гулонової кислоти соляною кислотою;

5) енолізація і лактонізація гідрату диацетон-2-кето-L-гулонової кислоти

в аскорбінову кислоту в середовищі хлороформу в присутності каталізатора.

Процес перетворення D-сорбіту на L-сорбозу. Процес здійснюють в

аеробних умовах у ферментаторах з перемішуванням. Середовище містить

сорбіт, джерело азоту та крейду. Початкова концентрація сорбіту у середовищі

становить 10–20 % сорбіту з наступним його внесенням до кінцевої

концентрації 28–35 %. Як джерело азоту найчастіше використовують

кукурудзяний екстракт (0,1–0,3 %). рН середовища доводять до 5,0–6,0.

Для одержання інокуляту бактерії вирощують у середовищі з 20 %

сорбіту упродовж 20 год. Кількість посівного матеріалу становить 3–10 % від

об’єму середовища у виробничому ферментаторі.

Виробничу ферментацію здійснюють при температурі 30–35 °С у

періодичних умовах з інтенсивною аерацією (8–10 г О

/л∙год). Якщо замість

повітря для аерації використовують кисень (за підвищеного тиску), тривалість

ферментації скорочується. Проте такий прийом неприйнятний для A.

melanogenum, ріст якого інгібується за підвищених концентрацій кисню.

Тривалість ферментації становить 24 год. Вихід L-сорбози досягає 93 %.

Виділення L-сорбози. Культуральну рідину, що містить L-сорбозу,

знебарвлюють активованим вугіллям, фільтрують (двічі) на фільтр-пресі,

фільтрат концентрують у вакуумі до сиропоподібної маси, яку піддають

кристалізації при температурі 15 °С. Кристали відділяють центрифугуванням,

промивають льодяною водою і висушують.

Далі у синтезі Рейхштейна відбувається конденсація L-сорбози з

ацетоном. При цьому утворюється діацетонсорбоза, яка окиснюється до 2-кето-

L-гулонової кислоти (2-КЛГ) за присутності каталізатора (платини). Наступна

енолізація та лактонізація супроводжуються утворенням аскорбінової кислоти з

виходом 50 %.

Кількісне визначення аскорбінової кислоти

Досліджуваний матеріал

За допомогою цього методу можна визначати вміст аскорбінової кислоти

в харчових продуктах та рослинній сировині (суха шипшина, хвоя, картопля,

цитрусові, смородина).

Реактиви

Натрієва сіль 2,6-дихлорфеноліндофенолу, 0,001 н. розчин, соляна

кислота, 10% розчин.

Устаткування

Терези технічні, наважки, .мірні циліндри на 25 мл, . піпетки на 1,2 і 5 мл,

порцелянові ступки з товкачиками, мікробюретки на 4 мл, конічні колби на 25-

50 мл, хімічні склянки на 100 мл, ножиці, скальпель, пісок.

Принцип методу визначення вмісту аскорбінової кислоти (вітаміну С)

полягає у його здатності відновлювати 2,6 - дихлорфеноліндофенол (2,6-

дихлорфеноліндофенол у лужному середовищі має синє забарвлення, у

кислому – червоне, а при відновленні знебарвлюється).

Кількісне визначення вітаміну С проводять, титруючи досліджуваний

підкислений соляною кислотою розчин лужним розчином 2,6-

дихлорфеноліндофенолу. Поки в розчині, що титрується, міститься вітамін С,

лужний розчин 2,6-дихлорфеноліндофенолу, що доливається, буде

знебарвлюватися за рахунок утворення відновленої форми. Як тільки вся

кількість вітаміну С, що міститься в досліджуваному розчині, окислиться,

розчин, що титрується набуває рожевого забарвлення за рахунок утворення 2,6-

дихлорфеноліндофенолу (у кислому середовищі).

L-аскорбінова 2,6-дихлорфеноліндофенол

кислота

Дегідроаскорбінова 2,6-дихлорфеноліндофенол

кислота

Визначаючи кількість вітаміну С в харчових продуктах, можна дати їх

порівняльну характеристику щодо вмісту цього вітаміну. Вміст вітаміну С в

овочах і фруктах, рослинній фармацевтичній сировині залежить від умов

вирощування і збереження їх.

Визначення вмісту вітаміну С у сухій шипшині

Відважують на технічних вагах 1 г сухої шипшини, подрібнюють його

товкачиком в порцеляновій ступці з 2 мл дистильованої води і 0,1 г піску,

кількісно переносять у мірну колбу на 25 мл, поступово доливаючи

дистильовану воду до мітки.

Отриману суміш залишають на 10 хвилин. Витяжку фільтрують через

паперовий фільтр.

Для титрування беруть по 2 мл фільтрату, додають дві-три краплі 10%

розчину соляної кислоти і 2–3 мл дистильованої води (титрування проводять у

конічних колбочках). Вміст колбочок титрують 0,001 н. розчином 2,6-

дихлорфеноліндофенолу до появи рожевого забарвлення, що не зникає

впродовж 30 секунд.

Розрахунок. Кількість мілілітрів 2,6-дихлорфеноліндофенолу, витрачена

на титрування досліджуваного розчину, еквівалентне вмісту вітаміну С в

рідині: Якщо на титрування пішло А мл 0,001 н. розчину , то у зразку міститься

така ж кількість мілілітрів аскорбінової кислоти такої самої нормальності.

Грам-еквівалент аскорбінової кислоти 176:2=88, тобто у 1 мл 0,001 н. розчину

міститься 0,088 мг аскорбінової кислоти. Розрахунок проводиться за

формулою:

10025А088,0







де Х – вміст аскорбінової кислоти, мг %; А – кількість розчину 2,6-

дихлорфеноліндофенолу, мл, витрачена на титрування; 1 – кількість речовини,

г, взята для титрування; 25 – загальна кількість витяжки; 100 – кількість грамів

шипшини, взята для обчислення процентного вмісту.

Визначення вмісту вітаміну С у хвої

На технічних вагах відважують 1 г хвої розтирають її товкачиком у

порцеляновій ступці для руйнування оболонки, доливають поступово 25 мл

дистильованої води, перемішують і відфільтровують отриману витяжку.

Для титрування відмірюють у конічну колбочку 10 мл фільтрату,

підкислюють 2–3 краплями 10% розчину соляної кислоти і титрують 0,001 н.

розчином 2,6-дихлорфеноліндофенолу до рожевого кольору, що не зникає

впродовж 30 секунд. Розрахунок наведений вище.

Визначення змісту вітаміну С в картоплі

Відважують 5 г картоплі, подрібнюють її і розтирають у порцеляновій

ступці, доливаючи туди три краплі 10% розчину соляної кислоти і 15 мл

дистильованої води (поступово). Отриману масу зливають у конічну колбочку

(не фільтруючи). Ступку споліскують водою і воду зливають по скляній

паличці в колбочку. Титрують 0,001 н. розчином 2,6-дихлорфеноліндофенолу.

Визначення вмісту аскорбінової кислоти в фармацевтичних

препаратах.

Техніка визначення. Точну наважку порошку, драже, таблеток, з вмістом

приблизно 0,1 г аскорбінової кислоти, розтирають у порошок, кількісно

переносять водою в мірну колбу об'ємом 100 мл, доводять об'єм розчину водою

до риски, перемішують і фільтрують. Перші 10 мл відкидають. 10 мл фільтрату

вміщують у конічну колбу на 100 мл, додають 1 мл 2% розчину HCI, 0,5 мл 1%

розчину калій йоду, 2 мл 0,5% розчину крохмалю, воду до загального об'єму 20

мл і титрують розчином калій йоду 0,00167 моль/л до появи світло-синього

забарвлення. Паралельно проводять контрольний дослід. Для цього в конічну

колбу вміщують 1 мл 2% розчину HCI, 0,5 мл 0,5%-го розчину крохмалю, води

до загального об'єму 20 мл і титрують 0,01 н. розчину калій йодату (0,00167

моль/л) до появи світло-синього забарвлення.

1 мл розчину калій йодату (0,00167 моль/л) віповідає 0,0008806 г кислоти

аскорбінової C

Реактиви: препарат аскорбінової кислоти; 2 % розчин HCI; 1 % розчин

калію йодиду; 0,00167 моль/л розчин калію йодату; 0,5% розчин крохмалю.

7.2 Процес біосинтез для отримання рибофлавіну

Рибофлавін був вперше виділений з кисломолочної сироватки.

Синтезований Р. Куном у 1935 р.

Вітамин В

(рибофлавін) входить до складу ряду ферментних систем,

регулюючих окисні процеси у клітинах, бере участь у синтезі білків та жирів,

каталізує процеси дегідратації -амінокислот, альдегідів, моноцукрів тощо.

Вітамін В

бере участь в процесах росту, пластичному обміні;

регуляторно впливає на стан центральної нервової системи, процеси в рогівці,

кришталику ока, забезпечує світловий і кольоровий зір.

Входить до складу жовтих пігментів флавінів, які слугують

коферментами. Важливий для підтримки нормальної функції ока. Рибофлавін

входить до складу зорового пурпуру, захищаючи сітківку ока від шкідливої дії

ультрафіолетових променів. Вітамін B

інтенсифікує процеси обміну речовин в

організмі, беручи участь у метаболізмі білків, жирів і вуглеводів. Рибофлавін

необхідний для утворення червоних кров'яних тілець і антитіл, для дихання і

росту клітин. Він полегшує поглинання кисню клітинами шкіри, нігтів і

волосся. Він поліпшує стан органа зору, беручи участь, поряд з вітаміном A, у

процесах адаптації до сутінок, знижує втому очей і відіграє велику роль у

запобіганні катаракти. Вітамін B

впливає на слизові оболонки травного тракту.

Рибофлавін зводить до мінімуму негативний вплив різних токсинів на дихальні

шляхи. Рибофлавін необхідний для метаболізму триптофану, що

перетворюється в організмі на ніацин. Однією з найцінніших якостей

рибофлавіну є його здатність прискорювати в організмі перетворення

піридоксину— вітаміну B

— на його активну форму.

Молекула рибофлавіну складається з гетероциклічного

ізоалоксазинового ядра, до якого приєднаний у 9-му положенні спирт рибітол

(похідне D-рибози).