Блюменфельд Л.А. Проблемы биологической физики

Подождите немного. Документ загружается.

5.2] ДЕНАТУРАЦИЯ БИОПОЛИМЕРОВ 81

получим

аж

— ^ |

Учитывая, что, по Вант-Гоффу,

АН

после несложных преобразований находим

ДЯЙ

= ДЯ, +

^-.

(5.13)

Вторая возможная ситуация заключается в том, что

регистрируется только первый переход, а спектральные

характеристики В и С неотличимы *). Тогда

а \

+С

% = *

* (

5Л4

)

~~ ° ~~'

+ -j-^-

ДЯ

(5.15)

Рассчитаем теперь получаемое в

результате

термохи-

мических измерений истинное значение энтальпии дена-

турации.

Пусть до начала процесса был 1

моль

формы А, а в

конце

образовались равновесные количества Ъ

формы В

формы С. Это означает, что превращению 1 (с моляр-

ным

тепловым эффектом АН-,) подверглось Ъ

+ с

молей

формы

А, а затем с

молей образовавшейся формы испыта-

ло превращение 2 (с молярным тепловым эффектом АН

Отсюда

Д#

ист

= (Ь

)АН

Из

(5.11), полагая а

= 1, получим

оригинальной работе Фореста

Стюртеванта

[10]

ошибочно

рассматривается нереальная ситуация, когда неотличимы характе-

ристики

А и С, т. е.

конечный продукт денатурации неотличим

по

рассматриваемому свойству

(в

данном случае спектрофотометри-

чески)

от

исходного нативного белка.

Для

кислотной денатурации

гемоглобина

(да,

по-видимому,

и во

всех других случаях)

это

явно

не

так:

ведь тогда практически доведенную

до

конца денатурацию

нельзя

быдо

бы

зарегистрировать.

82 СТРУКТУРНЫЕ

ИЗМЕНЕНИЯ

БИОПОЛИМЕРОВ [ГЛ. 5

откуда

АИ - Kid

Если

процесс идет почти до конца, т. е. если K

^> 1,

то,

естественно,

Д£Г

ИСТ

= АН

+ А#

(5.17)

= АЯ

, ДЯ<£

= АН, + Д#

(5.18)

Таким

образом, если при измерениях реализуют силь-

но

сдвинутое вправо равновесие, то при осуществлении

первой ситуации при расчете по Вант-Гоффу измеряемой

величиной

является тепловой эффект второй стадии (соп-

ровождающейся изменением свойства, по которому

ведет-

ся

регистрация), а при осуществлении второй ситуации

должны получить истинное значение энтальпии процесса.

При

определении константы равновесия для расчета вант-

гоффовской

энтальпии работают в широкой области со-

отношений

концентрацией денатурированного и нативного

белка (меняя степень денатурации с помощью рН или тем-

пературы), в том числе и при сильно сдвинутом вправо де-

натурационном равновесии. Поэтому вторая ситуация,

при

которой регистрируется только первый переход в

(5.9), по-видимому, противоречит экспериментальным дан-

ным

и может не обсуждаться. Действительно, калоримет-

рически

измеренное и вант-гоффовское значения энтальпии

не

только резко отличаются

друг

от

друга,

но при из-

менении

температуры

даже

смещаются в разные стороны.

Остается рассмотреть ситуацию, при которой первая

стадия в (5.9) не регистрируется, хотя сопровождается

тепловым эффектом. Если равновесие сильно сдвинуто в

сторону денатурированного состояния, то найденная по тем-

пературной зависимости кажущаяся энтальпия процесса,

согласно (5.18), должна равняться истинной энтальпии

второй стадии. Таким образом, в этом

случае

AHl

= +10

ккал/молъ,

A#f = 0,

(5.19а)

AH\

—120,5

ккал/молъ,

AH\

= +32

ккал/молъ.

(5.196)

Если

же измерять температурную зависимость кажущейся

константы

равновесия

K3i7K

в условиях, когда последняя

5.2] ДЕНАТУРАЦИЯ

БИОПОЛИМЕРОВ

близка к единице (т. е. при таких значениях рН, при ко-

торых концентрации денатурированной и неденатуриро-

ванной

форм сравнимы), то нетрудно показать, что экспе-

риментальные данные по

АЯ

каж

и A#

TCT

(АЯист равна

при

калориметрических измерениях АН

+ А^Г

) удов-

летворяются лишь при

A#f = 10 (1 + l/Kj)

ккал/молъ,

A#f =

—lO/i?

ккал/молъ,

(5.20а)

(5.206)

A#f = —lO/i?!

ккал/молъ,

АН? =

-120,5

(1 + l/Kj) ктл/молъ,

AHf = 32 +

120,5//?!

ккал/молъ.

Уравнения

(5.19)

(5.20)

совместны, если при обеих

температурах

->оо,

т.е. если равновесие А ;=* В в

(5.9) полностью сдвинуто вправо. Это кажется совершенно

невероятным,

если вспомнить, что тепловые эффекты та-

кого процесса должны иметь разные знаки и отличаться

примерно

на 130

ккал/молъ

(см. (5.19)). Итак, разбиение

реакции

кислотной денатурации ферригемоглобина на две

стадии не может объяснить резких расхождений

между

ре-

зультатами калориметрических и равновесных измерений.

Возникают сомнения в безоговорочной применимости урав-

нения

Вант-Гоффа к рассмотрению денатурации белков.

Вероятно, наиболее важным результатом проанализи-

рованных выше исследований является доказательство то-

го,

что изменение температуры в физиологической области

приводит к значительным структурным перестройкам

молекулы, сопровождающимся изменением ее теплосодер-

жания.

Об этом свидетельствует резкое изменение значе-

ния

измеренного термохимически теплового эффекта реак-

ции

в узком интервале температур от 15 до 25° С.

Прямое

экспериментальное доказательство существо-

вания

структурных перестроек глобулярных белков при

изменении

температуры в физиологической области дали

калориметрические исследования тепловой денатурации.

Тепловая

денатурация

белков.

Среди многочисленных

типов денатурации тепловая занимает особое место, по-

скольку для определения термодинамических парамет-

ров процесса измеряют зависимость степени превращения

от температуры, т. е. от того фактора, изменение которо-

го и приводит к исследуемому превращению. Это обстоя-

СТРУКТУРНЫЕ

ИЗМЕНЕНИЯ БИОПОЛИМЕРОВ ЕГЛ.

тельство необходимо иметь в виду при обсуждении термо-

динамических аспектов тепловой денатурации белков. По-

жалуй, наиболее существенные результаты были достиг-

нуты при использовании микрокалориметрического метода

при сравнении полученных данных с результатами рав-

новесных исследований.

Ввиду

важности этого вопроса

ниже

будут

подробно

рассмотрены две рабо-

ты по термодинамике

тепловой денатурации

глобулярных белков,

выполненные в

двух

ве-

дущих

лабораториях

мира. Начнем с резуль-

татов изучения обрати-

мой тепловой денатура-

ции

химотрипсиногена,

проведенного Джексо-

ном

и Брандтсом [14].

Калориметрическое ис-

следование сводится к

измерению парциальной

теплоемкости с

белка

в зависимости от темпе-

ратуры. Типичная диф-

(Н

am)

•

(двн)

Т"

Н(ден)/)

Н(натп)

Температура

Рис.

5.1.

Типичные дифференциаль-

ные

(А) и

интегральные

(Б)

калори-

метрические кривые химотрипсино-

гена

области тепловой денатурации

(по

[14]).

ференциальная калори-

метрическая кривая изо-

бражена на рис. 5.1, А.

На

рис. 5.1, Б показана

интегральная форма той

же кривой; сплошная

линия

на рис. 5.1, Б передает зависимость парциальной

энтальпии Н белка в растворе от температуры. Для натив-

ного химотрипсиногена с

(нат) равно

0,40кал-г~*-град'

при

20° С и характеризуется сильной температурной за-

висимостью: повышение температуры на 1° увеличивает

на 0,7%. Это изменение теплоемкости с температурой

не вызвано изменением взаимодействия с растворителем,

а представляет собой свойство самой макромолекулы бел-

ка,

так как сохраняется и для безводного химотрипсино-

гена. У безводного химотрипсиногена теплоемкость на

30% меньше, чем в растворе, но ее температурный

коэффи-

5.2] ДЕНАТУРАЦИЯ БИОПОЛИМЕРОВ 85

циент

остается практически неизменным (0,6% вместо

0,7%). При приближении к температуре денатурации рост

с температурой ускоряется, теплоемкость проходит

через максимум и затем падает почти до исходной величи-

ны.

Теплоемкость денатурированного химотрипсиногена

(ден) характеризуется значительно меньшим темпера-

турным коэффициентом, чем теплоемкость нативного бел-

ка.

Авторы

рассчитывают изменение энтальпии в резуль-

тате

денатурации по формуле

Т" Т Т"

АЯГал

(Т) = $ c

dT - \

Ср

(нат) dT - \ с

(ден) dT,

(5.21)

Г' Т' Т

т. е. приравнивают энтальпию перехода площади, ограни-

ченной

абегда.

Для проведения этой процедуры прихо-

дится экстраполировать величины Ср (нат) и с

(ден) в об-

ласть перехода, в

результате

чего возникает денатураци-

онный

скачок теплоемкости дг (см. рис. 5.1, А). Такая

процедура не вполне однозначна. Мы увидим далее, что

другие

авторы, экстраполируя с

(нат) для того же белка,

получили Ас

= 0. Разделение всего температурного ин-

тервала на две области эквивалентно определению

денату-

рации

как перехода

между

двумя макроскопическими со-

стояниями

— нативным и денатурированным. Нативное

состояние

существует

при

всех

температурах ниже нача-

ла

«главного»

денатурационного перехода (точка а на

рис.

5.1, А), определяемого как область сильного изме-

нения

различных физических свойств, а денатурирован-

ное

состояние

существует

при

всех

температурах выше

этого перехода. Температурная зависимость с

внутри

областей, соответствующих нативномуили денатурирован-

ному состояниям, трактуется как характеристика состоя-

ния,

а не как его изменение, независимо от того, происхо-

дит ли изменение теплоемкости с температурой в резуль-

тате

обычного термического возбуждения внутренних

степеней свободы макромолекулы или вследствие конформа-

ционных

переходов, сопровождающихся поглощением теп-

ла или изменением взаимодействия белка с растворителем

(см.

ниже § 5.6). При таком определении исходного и ко-

нечного состояний макромолекулы,

между

которыми про-

исходит денатурационный переход, энтальпии перехода,

измеряемые непосредственно калориметрически (по пло-

СТРУКТУРНЫЕ

ИЗМЕНЕНИЯ

БИОПОЛИМЕРОВ

[ГЛ.

щади

абвгдапа

рис. 5.1,

А),

должны

не

слишком отличать-

ся

от

вант-гоффовских равновесных значений

Д£Гвг

;

последние находят

по

тому

же

графику зависимости

конс-

танты равновесия

К от

температуры

использованием

формулы (5.6), причем

принимается равным отношению

соответствующих площадей

под

кривой

рис.

5.1,

А. Ре-

зультаты измерений

Д-ffS

Д#в

ля

денатурации

хи-

мотрипсиногена

при

разных

рН

приведены

табл.

5.1.

Рассчитанные значения константы равновесия

вант-

гоффовских координатах

(In К и ЦТ) не

ложатся

на

пря-

мую,

что,

естественно,

следует

из

неравенства нулю

Ас

Приведенные

таблице значения Д.Нвг

относятся

к тем-

пературе, соответствующей максимуму

на

рис. 5.1,

А.

Таблица

5.1

рН

1,95

2,03

2,08

2,59

2,99

3,02

Т,

"С

40,6

42,0

48,0

53,9

54,2

Ден

кал

ккал-моль~

103

102

126

145

135

Ас,-,,

кал

•моль~

-грав-'

4200

3300

3900

3200

2800

ляда».

вг

пкал

моль-*

126

133

134

Как

видно

из

табл.

5.1,

имеется достаточно хорошее

совпадение

между

калориметрическими

равновесными

значениями

Д//

ден

. Скачок

Ас

при температуре перехода

авторы объясняют конформационным изменением белка

(выходом гидрофобных групп

на

поверхность глобулы)

при

денатурации,

тогда

как не

менее существенные изме-

нения

Ср (нат)

области низких температур

не

считаются

изменением

состояния молекулы.

Полученное таким способом совпадение Д#кал

ДТ/вт*

авторы считают свидетельством

пользу одноступенчато-

го характера денатурационного процесса.

Пожалуй, наиболее интересным результатом проведен-

ных исследований является доказательство наличия

су-

щественных изменений теплоемкости нативного белка

физиологической

области температур задолго

до

регист-

рации

главного денатурационного процесса.

Эти

измене-

SI5.2]

ДЕНАТУРАЦИЯ

БИОПОЛИМЕРОВ

ния

Ср

(обнаруженные, кстати, многими авторами

всех

изученных белков) наблюдаются

широких, температур-

ных интервалах

происходят весьма плавно: никаких

скачкообразных предденатурационных изменений

ни-

когда

не

отмечается.

Тепловая денатурация химотрипсиногена

(и

некоторых

других

белков) была изучена также калориметрически

Т. "С

Рис.

5.2.

Калориметрические кривые химотрипсиногена

при

различ-

ных

рН (по

[15]).

Числа

кривых указывают значения

рН.

Приваловым,

Хечилашвили

Атанасовым

[15].

Применя-

емая ими"методика исследованиями

их

экспериментальные

кривые практически

не

отличались

от

только

что рас-

смотренных. Однако обрабатывали

эти

кривые авторы

дру-

гим способом.

На рис. 5.2

показаны типичные калоримет-

рические записи

для

нескольких значений

рН.

Парциаль-

ная,

теплоемкость химотрипсиногена

при 20° С

оказалась

равной

0,4 кал-г^-град'

, как и в

предыдущей работе.

Однако,

по

мнению Привалова

сотрудниками,

(нат)

не

меняется

до 28° С,

после чего повышается

при

всех

ис-

следованных значениях

рН.

Авторы

относят наблюда-

емые изменения теплоемкости

двум

стадиям: предденату-

рационной

денатурационной. Разделение

на две

стадии

получают

и в том

случае, когда

за

изменениями белка

еле-

СТРУКТУРНЫЕ

ИЗМЕНЕНИЯ

БИОПОЛИМЕРОВ

[ГЛ. 5

дят по температурным изменениям экстинкции е при

2820

(рис.

5.3). Точное разделение на стадии проводится так,

чтобы результаты спектрофотометрических измерений для

второй денатурационной стадии ложились (в вант-гоффов-

ских координатах) на одну прямую. Таким образом,

1,0

0,5

50 60

Т,°С

Рис.

5.3.

Зависимость экстинкции

при 2820 А

раствора химотри-

псиногена

от

температуры

при

разных значениях

рН (по

[15]).

постулируется независимость Л#вг

температуры (в от-

личие от предположения, сделанного в предыдущей рабо-

те).

Авторы

постулируют также, что теплоемкость меняет-

ся

только в

ходе

первой, предденатурационной, стадии

(пунктир на рис. 5.2) и, следовательно, денатурационный

скачок теплоемкости в этом

случае

отсутствует.

Рассчитан-

ные при таком предположении калориметрические значе-

ния

энтальпии денатурации Л#кал весьма близки к рав-

новесным (табл. 5.2).

Таблица

5.2

рН

2,3

2,6

2,8

3,4

4,0

5,0

днД

ен

ВГ '

ккал'моль-'-

100

105

132

143

145

ден

кал

ккал-люль-'

102

110

130

140

148

ккал-моль~

105

140

155

182

200

207

5.2] ДЕНАТУРАЦИЯ БИОПОЛИМЕРОВ 89

Можно

сделать и

другое

предположение о температур-

ном

ходе

истинной теплоемкости, например, считать, что

изменяется только при второй, денатурационной, стадии

процесса или на протяжении обеих стадий пропорцио-

лально поглощенному теплу. В последнем

случае

полу-

чают значения суммарной энтальпии процесса Д/7^

л, при-

веденные в четвертом столбце табл. 5.2. Вычитая из

АД^

ал

соответствующее значение Д/Тщ?, можно оценить тепло,

поглощенное в первой, предденатурационной, стадии (30—

ккал-молъ'

Полученные значения недостаточно точ-

но

совпадают с оценками теплового эффекта первой ста-

дии,

сделанными в соответствии с уравнением Вант-Гоффа

по

крутизне перехода. Конечно, оценки эти недостовер-

ны:

первая и вторая стадии частично перекрываются, а

выделение денатурационной стадии постулированием неза-

висимости ее энтальпии от температуры вряд ли достаточ-

но

обосновано. Тем не менее авторы считают возможным

принять,

что изменение с

происходит только в предденату-

рационной

стадии.

Ввиду

того, что на нее частично налага-

ется вторая стадия, авторам не удается выделить площадь,

соответствующую поглощенному теплу. На основании это-

го они приходят к несколько странному выводу о том, что

предденатурационной стадии тепло вообще не поглоща-

ется и не выделяется, а происходит только изменение теп-

лоемкости. Вряд ли, однако, столь сильные изменения тем-

лоемкости с температурой

могут

обусловливаться только

термическим возбуждением внутримолекулярных степеней

свободы. Сами авторы полагают, что изменения теплоем-

кости

в основном связаны с изменением числа контактов

гидрофобных групп белка с растворителем (напомним,

что именно таким способом Джексон и Брандтс объясняли

постулированный ими скачок с

при денатурации). Если

непредвзято отнестись к экспериментальным данным, то

можно'прийти

к следующей картине процесса. При увели-

чении

температуры (начиная с комнатной) наблюдаются

значительно большие изменения теплосодержания белка в

растворе, чем можно было бы ожидать, исходя из триви-

ального повышения теплоемкости за счет термического

возбуждения внутримолекулярных степеней свободы.

Начиная

с некоторой области температур, изменения

энтальпии

становятся более интенсивными, а затем снова

90 СТРУКТУРНЫЕ

ИЗМЕНЕНИЯ

БИОПОЛИМЕРОВ 1ГЛ. 5

замедляются. Изменения энтальпии системы в преддена-

турационной стадии по порядку величины сравнимы с

денатурационными изменениями.

Так

или иначе, и те и

другие

изменения сопровождают-

ся

изменениями структуры макромолекулы (что, в частно-

сти,

отражается и на ее взаимодействии с растворителем).

Может быть, предденатурационная стадия соответствует

конфигурационным

изменениям, а денатурационная —

конформационным

переходам (см. сноску на стр. 70).

В более поздних работах Привалов

[16—19]

вновь воз-

вращается к калориметрическим измерениям предденату-

рационных

изменений и тепловой денатурации глобуляр-

ных белков и приводит соответствующие данные для

лизоцима,

химотрипсина, химотрипсиногена, миоглобина,

цитохрома с и рибонуклеазы. По сравнению с рассмотрен-

ной

выше работой [15] имеются некоторые незначитель-

ные

изменения, относящиеся как к самим эксперименталь-

ным

данным, так и к их трактовке . В средней точке

денатурации появляется скачок теплоемкости, как в работе

Джексона и Брандтса [14]. Линейное возрастание с

с тем-

пературой наблюдается, начиная с низших использован-

ных в работе температур (20° С).

Автор

считает, что изме-

нения,

происходящие в белке при нагревании, можно раз-

делить на две качественно различные стадии: стадию ли-

нейного

возрастания теплоемкости и стадию интенсивного

поглощения

тепла. Изменение энтальпии во второй, де-

натурационной,

стадии (как всегда, деление единой кри-

вой

на части, соответствующие

двум

стадиям, вносит не-

который,

хотя и незначительный, произвол в количе-

ственные оценки) практически совпадает во

всех

случаях

с равновесным значением, вычисленным . в соответствии

с уравнением Вант-Гоффа по форме калориметрической

кривой.

Рассматривая предденатурационную стадию, Прива-

лов приходит к важному выводу о том, что ее нельзя интер-

претировать как тривиальное изменение теплоемкости с

температурой. Исследуя изменения спектра поглощения в

предденатурационном и денатурационном интервалах тем-

ператур, автор обращает внимание на сущестовование чет-

ко

выраженных изобестических точек в предденатураци-

онном

интервале (от 20 до 65° G при рН 3,0). На основании

этого можно прийти к выводу о сосуществовании в данном