Блюменфельд Л.А. Проблемы биологической физики

Подождите немного. Документ загружается.

5.4]

НЕКОТОРЫЕ

РЕАКЦИИ С УЧАСТИЕМ БЕЛКОВ

101

рассчитывают величины ASl при разных температурах.

Величины AGl, ASl и вычисленные по уравнению

(5.31)

величины К

также приведены в табл. 5.4. Рассмотрим

подробнее процедуру и результаты этого расчета. Итак,

прямой

эксперимент показал, что тепловой эффект свя-

зывания

низкомолекулярного ингибитора сТбелком силь-

но

зависит от температуры. В расчете принимается, что

вся эта зависимость обу-

словлена существовани-

ем

постоянной

разности

Ас

теплоемкостей ис-

ходного состояния (2,7

молекулы свободного

ингибитора+свободный

белок) и конечного со-

стояния

(комплекс). Та-

ким

образом, на этой

стадии расчета постули-

руется, что Ас

не зави-

сит от температуры и

лн'

КОМПМ

301 Т°К

Рис.

5.4. К нахождению величины

Д#,

ь-

связыванием ингиби-

все структурные пере-

стройки, происходящие

в системе, обусловлены только

тора. Экстраполированное к абсолютному нулю темпе-

ратуры значение энтальпии перехода АНь оказывается

неправдоподобно большим. Процедуру нахождения этой

величины иллюстрирует рис. 5.4, на котором представ-

лена постулированная зависимость от температуры тепло-

содержаний исходных

(Н

СВ

об)

и конечных

(Н

КО

ипл)

продук-

тов реакций.

Следует

отметить, что абсолютный наклон

прямых Н (Т) произволен. Эксперимент и расчет фик-

сируют только Ас

, т. е.

угол

между

двумя прямыми.

Для нахождения AS'l можно было бы обойтись и без

уравнения (5.32). Если единственной причиной темпера-

турной зависимости энтальпии превращения является по-

стоянная

разность Ас

, то, определив из уравнений (5.30),

(5.31)

(5.34)

значение ASl при 25° С (при которой была экс-

периментально определена константа равновесия), можно,

воспользовавшись формулой (5.8), сразу найти ASl для

любой

другой

температуры:

TA.

(5.35)

AS°

—

ASl

{2)

102 СТРУКТУРНЫЕ

ИЗМЕНЕНИЯ

БИОПОЛИМЕРОВ [ГЛ. 5

Естественно, результаты были бы теми же. Таким образом,

основу расчета положены два постулата: выполнение ус-

ловия

(5.3) и независимость Ас

от температуры. Учиты-

вая

все сказанное выше о практически всегда обнаружи-

ваемых перестройках глобулярных белков при физиологи-

ческих температурах,

следует

отметить, что выполнение

обоих постулатов представляется весьма сомнительным.

помощью этих расчетов авторы получают значения кон-

стант равновесия для комплексообразования при разных

температурах (см. табл. 5.4). Естественно, найденные зна-

чения

не ложатся на прямую в координатах lg К

и ЦТ и,

более того, К

имеет максимум при 25° С (т. е. при той

единственной температуре, при которой эта величина была

действительно измерена). Было бы интересно получить

непосредственно значения К

и при остальных тем-

пературах.

Эта работа была столь подробно рассмотрена лишь в

качестве примера. Аналогичные результаты были получе-

ны

и при изучении

других

систем, например, при образо-

вании

комплекса

между

коферментом никотинамидаде-

ниндинуклеотидом (НАД) и ферментом глицеральдегид-

3-фосфатдегидрогеназой [40]. Обработка полученных

данных была проведена с помощью той же процедуры,

что и в рассмотренной выше работе (равновесные измере-

ния

проведены путем регистрации тушения триптофановой

флуоресценции белка при комплексообразованииУ. за

тем исключением, что величина Кь непосредственно из-

мерялась при тех же температурах. Были получены сле-

дующие значения:

2\°К

278,2

298,2

313,2

К^молъ'

6,55-10

2,36-1С

1,05 -10

Прямые

калориметрические измерения дали при этих

температурах приведенные ниже величины АН

(в

ккал

на

моль

связанного НАД).

Т,°К 278 208 313

АН,, — 1,9 -12,4 -20,1

ASl +19,9 -16,8 -41,6

Значения

были рассчитаны с помощью тех же рав-

новесных

формул, что и в предыдущей работе, т.е. в пред-

5.4]

НЕКОТОРЫЕ РЕАКЦИИ

УЧАСТИЕМ БЕЛКОВ

ЮЗ

положении

выполнении обоих сформулированных выше

постулатов

и,

следовательно,

применимости уравнения

Вант-Гоффа.

Вместе

с тем

расчет

по

уравнению Вант-Гоффа

на ос-

нове данных

о К

дает

для

всего изученного интервала

температур

АН

= —9,0 ±1,0

ккал

на 1 моль НАД,

что резко отличается

от

истинных калориметрических

значений

АН

(и от АНъ,

вычисляемого

по

уравнению

(5.33)

равного

143,08

ккал

на 1 моль

НАД).

Это

расхож-

дение заставляет серьезно сомневаться

выполнении

по-

стулатов,

на

которых основано применение равновесных

методов

проводимых авторами расчетов.

То обстоятельство,

что

любые локальные микрохими-

ческие изменения белковой макромолекулы (присоединение

низкомолекулярного лиганда, окисление

или

восста-

новление

иона переходного металла

активном центре

т. п.)

способны приводить

существенным конформа-

ционным

или

конфигурационным перестройкам биополи-

мера, можно считать

настоящее время твердо

уста-

новленным.

Об

этом косвенно свидетельствуют много-

численные работы но влиянию таких локальных изменений

на

физические характеристики (дисперсия оптического

вращения,

вязкость, растворимость, седиментационные

константы

и т. п.), на

устойчивость

действию протео-

литических ферментов

денатурирующих агентов.

Нет

возможности привести

все

литературные ссылки (см.,

на-

пример,

[25,

41—42]).

За

последние годы были получе-

ны

более^прямые доказательства эффектов этого типа

бла-

годаря широкому применению методов флуоресцентных

спиновых меток

парамагнитного зонда. Было,

част-

ности,

твердо установлено,

что

присоединение субстрата

активному центру фермента может существенно изменить

окружение метки, присоединенной

другом

месте белко-

вой

глобулы

(см.,

например, [43]).

В работе

[44]

получены весьма красивые результаты

по

конформационным

переходам, индуцируемым присоеди-

нением

ингибиторов (мономера, димера

тримера

N-

ацетилглюкозамина)

лизоциму. Исследование прове-

дено методом протонного магнитного резонанса

(ПМР)

с высоким разрешением

на

частоте

270 Мгц. На

этой

частоте удается разрешить

идентифицировать сигналы

ПМР

алифатических

ароматических протонов отдельных

104 СТРУКТУРНЫЕ

ИЗМЕНЕНИЯ

БИОПОЛИМЕРОВ

[ГЛ. 5

аминокислотных остатков. Анализ положений

ширин

сигналов

ПМР

показал,

что

присоединение ингибитора

сопровождается существенными смещениями аминокислот-

ных остатков, локализованных

разных

участках

поли-

пептидной цепочки. Присоединение ингибитора

не

только

меняет конформацию молекулы лизоцима,

но и

меняет

ее конформационную подвижность: частота спонтанных

об-

щих

локальных конформационных перестроек белка после

присоединения ингибитора уменьшается. Кстати, скорости

мономолекулярных конформационных переходов,

сле-

дующих

за

бимолекулярной реакцией присоединения инги-

битора, значительно ниже скорости последней.

Эти

пере-

стройки длятся единицы

десятки миллисекунд. Поэтому

за время одного конформационного превращения макро-

молекула должна испытывать множество элементарных

актов присоединения

отщепления низкомолекулярного

ингибитора.

Мы еще

вернемся ниже

этой особенности

реакций

участием

белков.

Недавно появилось несколько замечательных исследо-

ваний,

которых структурные изменения были непосред-

ственно зарегистрированы прямым рентгеноструктурным

анализом. Речь

идет

работах

Перутца

по

структурным

изменениям

гемоглобина

при

присоединении кислорода

железу

гема

и о

работах

Диккерсона

и др. о

структур-

ных изменениях, сопровождающих окисление

восста-

новление железа

геме

цитохрома

с.

Оксигенация гемоглобина.

Изменения геометрии моле-

кулы гемоглобина

электронной

структуры

ее

железо-

порфириновых активных центров (гемов), сопровождаю-

щие присоединение молекулярного кислорода

атомам

железа гемов (оксигенацию),

уже

много десятков

лет при-

влекали внимание исследователей.

Эти

изменения имеют

прямое отношение

функционированию гемоглобина,

его

способности переносить большие количества моле-

кулярного кислорода

при

данной разнице парциальных

давлений

между

альвеолами легких

тканевыми

ка-

пиллярами. Действительно,

как мы

увидим далее, именно

специфические конформационные изменения белка

при

оксигенации приводят

кооперативности процесса

свя-

зывания

кислорода

и к

специфической S-образной форме

кривой

диссоциации,

что

обеспечивает значительно боль-

шее количество переносимого гемоглобином кислорода,

5.4]

НЕКОТОРЫЕ

РЕАКЦИИ

С УЧАСТИЕМ БЕЛКОВ

105

ньо

чем то, которое могло бы быть перенесено при классиче-

ской

ленгмюровской кривой диссоциации (рис. 5.5)*

Поэтому исследование строения и динамических характери-

стик

гемоглобина связано с решением едва ли не важней-

шей научной проблемы нашего времени:

выяснением

меха-

низма

целесообразного

поведения

биологических

систем на

молекулярном

уровне.

Обзор истории вопроса и различных

аспектов теоретических

экспериментальных

исследований гемогло-

бина можно найти в ря-

де статей и монографий

(см.,

например, [45,

46]). В 1970 г. появи-

лись две статьи Перут-

ца, основанные на собст-

венных рентгенострук-

турных работах и на

некоторых литератур-

ных данных, где в об-

щих

чертах

выяснены

основные этапы измене-

ния

геометрии молеку-

лы гемоглобина, следующие за актами присоединения кис-

лорода к четырем гемам в четырех субъединицах этого

сложного белка [47, 48].

Ниже излагаются главные выводы, к которым пришел

Перутц.

Молекула дезоксигемоглобина отличается от молеку-

лы оксигемоглобина как третичной структурой

всех

четы-

рех субъединиц, так и четвертичной структурой, т. е.

способом упаковки

двух

а- и

двух

р-субъединиц в единую

глобулу.

Оксигенация начинается с црисоединения моле-

кулы О

к железу одной из ос-субъединиц (точная после-

довательность оксигенации отдельных единиц гема неиз-

вестна и не так уж важна для понимания

сути

дела).

В с$-субъединицах полость

между

спиральными участками,

в которой помещается кольцо гема, достаточно широка, и

молекула кислорода может присоединиться к железу гема

практически безактивационно. В

результате

образо-

вания

связи кислород — железо последнее переходит из

высокоспинового состояния с координационным числом

Рис. 5.5.

Гиперболическая

(1)

HS-O6-

кривые

оксигенации гемо-

глобина.

разная

106 СТРУКТУРНЫЕ

ИЗМЕНЕНИЯ

БИОПОЛИМЕРОВ [ГЛ. 5

5 в гексакоординированное низкоспиновое состояние. При

этом атом железа, находившийся на расстоянии 0,75 А

от плоскости норфиринового кольца, смещается и в окси-

гемоглобине уже располагается в этой плоскости. Одно-

временно образуется более прочная связь с атомом азота

соседнего гистидинового остатка, расстояние которого

от плоскости порфиринового кольца уменьшается на

0,75—0,95

А *). Эти смещения

«запускают»

дальнейшие

конформационные

превращения третичной и четвертичной

структуры молекулы, которые были детально рассмотрены

Перутцом. Происходящие конформационные превраще-

ния

приводят к

тому,

что один из спиральных участков

пептидной

цепи перемещается к центру глобулы и вытал-

кивает тирозиновый остаток из полости, где он ранее на-

ходился. При этом рвутся два солевых мостика

между

и а

-субъединицами. Та же процедура происходит пос-

ле оксигенации а

-субъединицы, причем рвутся еще два

солевых мостика. Разрыв мостиков сопровождается диссо-

циацией

протонов (эффект

Бора).

Таким образом, после

оксигенации

двух

а-субъединиц четыре из шести солевых

мостиков,

определяющих четвертичную

структуру

дезок-

сигемоглобина, оказываются разорванными, что облег-

чает разрыв остальных

двух

мостиков (аф

и a

Pi). Тетра-

мер принимает оксиконфигурацию, причем разрываются

солевые мостики, связывавшие Р-субъединицы с находив-

шейся

между

ними молекулой 2,3-дифосфоглицерата, ко-

торая теперь освобождается. Таким образом, на этой

стадии макромолекула имеет смешанную форму: четвер-

тичная

структура

уже приняла оксиформу, а третичная

структура

(3-субъединиц еще осталась прежней, но теперь

уже напряженной. Это обстоятельство и приводит факти-

чески к облегчению*присоединения следующих молекул

кислорода, т. е. к кооперативное™ эффекта и к S-образ-

ности

кривой диссоциации (конечно, если бы мы начали

с оксигенации р-субъединиц,

результат

был бы тот же).

•) Измерение расстояния

между

гистидином и норфириновым

кольцом при оксигенацип гемоглобина было впервые предсказано

еще в 1952 г. [45, 491 на основе косвенных данных и существовавшей

то время модели. В 1966 г.

Хорд

[501 предсказал, что в

результате

оксигенации

должно происходить смещение атома железа относи-

тельно порфиринового кольца.

5.4] НЕКОТОРЫЕ

РЕАКЦИИ

С УЧАСТИЕМ БЕЛКОВ 107

Затем молекулы кислорода присоединяются к атомам

железа |3-субъединиц. Здесь происходят те же события,

вызывающие изменение третичной структуры белковых

глобул

(смещение атомов железа в плоскость порфирино-

вых колец, уменьшение расстояния

между

последними и

гистидиновыми остатками, перемещение некоторых спи-

ралей и освобождение тирозиновых остатков из соответ-

ствующих полостей). Единственное отличие заключается

том, что в р-субъединицах полости гема недостаточно

широки

для беспрепятственного вхождения кислорода, и

для осуществления первой стадии процесса необходимо

наступление подходящей тепловой флуктуации структуры,

и,

следовательно, первая стадия не может быть безак-

тивационной.

Трудно переоценить значение этих исследований Пе-

рутца, изложенных здесь весьма конспективно. Я на-

стоятельно рекомендую читателю прочесть его статьи в

оригинале.

Прослеживание безупречной логики автора,

разбор прекрасно оставленных структурных

схем

достав-

ляют истинное эстетическое наслаждение (см. также

[51-53]).

Весьма интересен вопрос о кинетике описанных выше

конформационных

изменений. Для его решения можно

воспользоваться тем обстоятельством, что при облучении

окси-

или карбоксигемоглобина светом видимой области

спектра происходит диссоциация молекул О

или СО.

Начальные стадии перехода

НЬО

-*- НЬ были прослеже-

ны

в работе [54]. Мощная лазерная вспышка приводила

практически мгновенной диссоциации всего кислорода

(в

случае

оксигемоглобина) или всей окиси

углерода

(в

случае

карбоксигемоглобина). Основные изменения опти-

ческой плотности, возникающие в

результате

диссоциа-

ции,

заканчиваются быстрее, чем за 10~

сек (временное

разрешение прибора). Однако по своим спектральным

характеристикам восстановленный гемоглобин, образо-

вавшийся

результате

отщепления О

(или СО) за время,

меньшее 1CT

сек (после вспышки), слегка отличается от

обычного равновесного гемоглобина: изменения оптиче-

ской

плотности слишком велики. Превращение в «истин-

ный» спектр гемоглобина

требует

времени порядка

10~

сек, после чего спектр уже не меняется. Это не озна-

чает, однако, что через 10~

сек закончились все измене-

108 СТРУКТУРНЫЕ

ИЗМЕНЕНИЯ

БИОПОЛИМЕРОВ [ГЛ. 5

ния

гемоглобина после «мгновенного» отщепления лиган-

да (О

или СО). Проведя опыты с фотодиссоциацией кар-

боксигемоглобина при рН 9,0, Гиббсон [55] установил,

что гемоглобин, образовавшийся через

2-10~

сек после

вспышки,

значительно быстрее (на порядок) присоединяет

кислород, чем обычный гемоглобин. Кинетика перехода

«быстрого»

гемоглобина в «нормальный» удовлетворяет

уравнению первого порядка с константой скорости около

200

сек*

т. е. переход длится несколько миллисекунд.

Переход этот не сопровождается спектральными изме-

нениями

в видимой области. Можно

думать,

что быстрые

изменения

после вспышки, сопутствующие диссоциации

лиганда, происходят только в самой простетической груп-

пе и ее непосредственном окружении. Гем становится

восстановленным, а конформация всей остальной макромо-

лекулы остается «оксигенированной», так как соответ-

ствующий конформационный переход

требует

значитель-

но

больше времени, чем изменение электронной структуры

тема. К сожалению, при нейтральных рН эти результаты

воспроизвести не удалось.

Различие равновесных конформационных состояний

макромолекулы, соответствующих различным состояниям

активного центра, проявляется не только в структурном

отношении,

но и в изменении кинетических характеристик

этих состояний, в частности в их лабильности, способности

спонтанным флуктуациям структуры. Как было показа-

но

еще в 1966 г. [56, 57], именно такие «конформационные

колебания» (периодические обратимые изменения струк-

туры), как правило, определяют скорость изотопного об-

мена атомов водорода в белках. Энглендер и Ролф [58]

показали

недавно, что при оксигенации

структура

гемо-

глобина заметно лабилизуется и новые большие сегменты

макромолекулы, содержащие около 30 атомов водорода,

начинают принимать активное участие в спонтанных

«дыхательных»

движениях.

Отмеченные выше особенности кинетики реакций гемо-

глобина с СО, а именно сравнительно медленные структур-

ные

изменения значительной части белковой глобулы пос-

ле вызванных присоединением или отщеплением лиганда

быстрых изменений активного центра, по-видимому,

являются общими характеристиками реакций с участием

белков. В

результате

первого элементарного акта возни-

5.4] НЕКОТОРЫЕ РЕАКЦИИ С УЧАСТИЕМ БЕЛКОЙ Ю9

кает неравновесное состояние, в котором уже произошли

локальные изменения вблизи реакционного центра, а

основная

часть макромолекулы сохранила прежнюю кон-

формацию.

Недавно такие неравновесные состояния были

экспериментально

обнаружены и идентифицированы для

некоторых белков, в том числе для реакции электронного

восстановления ферригемоглобина [59, 60]. Восстановле-

ние

проводилось термолизованными электронами, возни-

кающими

при гамма-облучении

твердых

растворов ферри-

гемоглобина в водно-этиленгликолевой смеси при 77° К.

В этих условиях возможно только восстановление железа

небольшие локальные структурные изменения вблизи

активного центра, а исходная конформация всей белковой

глобулы

оказывается кинетически стабилизированной

(«замороженной»). В

результате

возникает устойчивое

при

77° К неравновесное состояние гемоглобина: восста-

новленный

активный центр и «окисленная» конформация.

Восстановленный гем оказывается при этом в низкоспино-

вом состоянии (каким он никогда не бывает в равновесных

условиях)

и характеризуется «цитохромоподобным» спек-

тром поглощения.

При

повышении температуры и размораживании мат-

рицы

растворителя молекула редаксирует и превращает-

ся

в обычный восстановленный гемоглобин. Эти эффекты

не

обусловлены четвертичной структурой, так как наблю-

даются и для ферримиоглобина. Почти такие же неравно-

весные промежуточные состояния (разумеется, кинетически

нестабильные)

удалось

зарегистрировать и при прове-

дении

электронного восстановления ферригемоглобина при

комнатной

температуре

в водных растворах методом им-

пульсного радиолиза [61].

Эти и

другие

результаты,

свидетельствующие о сравни-

тельно медленном протекании процессов конформационной

перестройки белков, сопровождающей реакции с их уча-

стием, и о появлении регистрируемых концентраций су-

щественно неравновесных промежуточных конформаци-

онных

состояний, заставляют отнестись с осторожностью

некоторым общепринятым представлениям.

В течение многих лет гемоглобин

служил

излюбленной

моделью, иллюстрирующей аллостерическое взаимодей-

ствие в белках, реализующееся через конформационные

изменения

макромолекулы. Кинетические схемы, описы-

НО

СТРУКТУРНЫЕ

ИЗМЕНЕНИЯ

БИОПОЛИМЕРОВ [ГЛ. 5

вающие эти превращения, всегда оперируют с неизмен-

ными,

конформационно равновесными молекулами белка

(конформерами)

и объясняют изменения свойств систе-

мы только изменениями относительных концентраций та-

ких конформеров. Этот постулат лежит в основе

всех

мо-

делей кооперативных свойств гемоглобина, начиная с фор-

мальной кинетической схемы Эдера [62] и кончая моделью

«генерализованных концертных

переходов»

Огаты и Мак-

Коннела

[63]. Последняя модель по

существу

идентична

модели Моне, Уаймана и Шанже [64], за тем исключением,

что в ней учтена неэквивалентность а- и ^-субъединиц. Как

известно,

в работе [64] постулируется существование

двух

типов равновесных конформеров, Т и R, характеризующих-

ся

соответственно низким и высоким сродством к кисло-

роду

(или к СО). Присоединение кислорода индуцирует

сдвиг равновесия Т ^ R вправо, что и обусловливает

кооперативные свойства гемоглобина. Аналогичный «рав-

новесный»

подход

лежит в основе модели последователь-

ного присоединения [65].

Эксперименты

по исследованию связывания гемогло-

бина

СО методом ЯМР высокого разрешения [66] показа-

ли,

что в процессе связывания лиганда появляются со-

стояния

белка, которые не

могут

быть описаны равнове-

сием

между

конформерами. К аналогичному выводу

пришли

авторы работ [67—71], в которых изучали кине-

тику переходов

между

равновесными (в темноте) и стацио-

нарными

(на

свету)

состояниями системы гемоглобин —

СО

в широком диапазоне степеней пасыщения, концентра-

ций

гемоглобина и интенсивностей света. Было" показано,

что полученные результаты принципиально нельзя объ-

яснить

в рамках любых схем, учитывающих только

равновесные формы молекул белка с их измеренными в

условиях равновесия характеристиками реакции с лиган-

дом. Во время перехода

между

равновесными или стацио-

нарными

состояниями возникают конформационно нерав-

новесные (не успевшие отрелаксировать) молекулы белка

с отличающимися кинетическими характеристиками.

Окисление

восстановление

цитохрома

с. Большой

интерес вызвали результаты рентгеноструктурного ис-

следования ферро- и феррицитохрома с, опубликованные

Дикерсоном с соавторами [72, 73] в 1971 г. В этих работах

сравнивали феррицитохром с из сердца лошади с ферро-