Блюменфельд Л.А. Проблемы биологической физики

Подождите немного. Документ загружается.

S 5.4] НЕКОТОРЫЕ

РЕАКЦИИ

С УЧАСТИЕМ БЕЛКОВ Ц1

цитохромом с из сердца тунца и обнаружили большие

структурные различия. Недавно авторы отказались от

этих результатов и направили в печать статьи [74, 75],

которых сравнение

структур

ферри- и ферроцитохрома с

из

сердца тунца приводит к выводу об отсутствии сколько-

нибудь заметных структурных различий

между

молеку-

лами в

двух

окислительно-восстановительных состояниях.

Тем не менее имеет смысл рассмотреть результаты

работ [72, 73]. Сформулированные в них мысли о воз-

можных механизмах переноса электронов через молекулу

цитохрома стимулировали плодотворную дискуссию и до

сих пор сохранили свое значение независимо от того, пра-

вильны они или нет.

Цитохром с в мембранах митохондрий осуществляет

функцию

переноса электрона от цитохромредуктазного

(комплекс

III по Грину) к цитохромоксидазиому фермент-

ному комплексу (комплекс IV). Этот белок с молекуляр-

ным

весом около 12 300 представляет собой полипептид-

ную цепочку из 104 аминокислотных остатков без дисуль-

фидиых мостиков. Одна из стереопроекций структурной

схемы ферритоцитохрома с по [73] представлена на рис. 5.6.

Гем связан с белком ковалентно: тиоэфирными связями

с цистеиновыми остатками 14 и 17 и через атом железа,

пятое координационное место которого занято атомом

азота имидазола гистидина 18, а шестое — атомом серы

метионина

80. Кольцо имидазола гистидина 18

фикси-

руется также через атом N, образующий водородную связь

с СОО-группой пролина 30. Фиксация гема в его

«пещере»

внутри глобулы осуществляется также двумя карбоксиль-

ными

группами пропионовокислых остатков гема: одна из

этих групп образует своими атомами кислорода две водо-

родные связи с тирозином 48 и триптофаном 59, а

другая

выведена на поверхность молекулы к полярной среде.

Как

можно видеть из схемы, молекула состоит из

двух

половинок.

Остатки 1—47 располагаются на рис. 5.6

5.7 справа от пещеры гема. остатки

48—91—слева,

а остатки

92—104

образуют как бы застежку портфеля

(через верх слева направо). Два последних звена поли-

пептидной

цепочки 103 и 104, по-видимому, не строго

фиксированы

и обладают свободой движения. Единствен-

ный

отрезок полипептидной цепочки, образующий точ-

ную а-спираль,— это участок 91—101. Общая структур-

112

СТРУКТУРНЫЕ

ИЗМЕНЕНИЯ

БИОПОЛИМЕРОВ [ГЛ. 5

ная

схема феррицитохрома с следующая: полипептидная

цепочка,

обернутая вокруг гема, с гидрофобными белко-

выми группами вблизи гема и полярными у поверхности.

Рис.

5.6.

Одна

из

стереопроекций структурной схемы молекулы

[феррицитохрома

с (по

[73]).

В структуре глобулы имеются два «отверстия», связываю-

щие

ее внутренние части с поверхностью. Это канал к пе-

щере гема (к левому верхнему участку пещеры) и правый

канал,

дно которого определяет петля, образованная ос-

татками 19—25. Правый канал доступен для молекул

растворителя и небольших групп типа ароматических ами-

§5.4]

НЕКОТОРЫЕ РЕАКЦИИ

УЧАСТИЕМ БЕЛКОВ

ИЗ

нокислотных остатков; предположительно, он осуществ-

ляет связь с цитохромоксидазой.

При

восстановлении феррицитохрома с, т. е. при пере-

носе электрона на атом железа,

глобула

претерпевает

Рис.

5.7. Основные

структурные

изменения при восстановлении

феррицитохрома с (по [73]).

сильные конформационные изменения (рис. 5.7). Эти изме-

нения

не затрагивают только 21 аминокислотный остаток из

104 — так называемый скелет молекулы, образуемый

N-концевой

спиралью (остатки

1—11),

участком от 12-го

до 18-го остатка, небольшим участком вблизи С-конца и

самим гемом. Ниже перечислены наиболее существенные

114 СТРУКТУРНЫЕ

ИЗМЕНЕНИЯ

БИОПОЛИМЕРОВ [ГЛ. 5

изменения,

происходящие при восстановлении. Самым

сильным смещениям подвергаются звенья полипептид-

ной

цепочки от

77-го

до

83-го

остатка. Это своего рода «ак-

тивный центр» цепочки, который содержит эволюционно

инвариантные аминокислоты. В молекуле феррицитохро-

ма фенилаланин 82 смещен далеко влево к периферии мо-

лекулы и оставляет отверстие,

ведущее

левую

верхнюю

часть пещеры гема, открытым. В ферроцитохроме фенил-

аланин

передвинут к пещере гема и блокирует отверстие.

Одновременно соседнее звено, изолейцин 81, боковая груп-

па которого была в феррицитохроме на поверхности гло-

булы, поворачивается и теперь выступает в растворитель.

результате

изменяются также положения остатков

77-79.

В феррицитохроме цепочка

55—75

образует петлю,

окружающую гидрофобную, недоступную растворителю

область (левый канал), где находятся ароматические

кольца аминокислотных остатков тирозина 74, трипто-

фана

59 и тирозина 67, которые расположены параллельно

образуют, предположительно,

электронную

тропу

для

переноса электрона от цитохромредуктазы на атом S

метионина 80 и на атом железа гема. Тирозин 67 фиксиро-

ван водородной связью, идущей к остатку треонина 78.

Однако в процессе восстановления феррицитохрома эта

водородная связь разрывается, плоскость кольца тирози-

на

74 поворачивается примерно на 60°, так что оно стано-

вится почти перпендикулярным к поверхности глобулы

(в

ферриформе кольцо было практически параллельным

поверхности); кроме того, смещается вся близлежащая

полипептидная цепочка *).

В правом канале (остатки

19—25)

также происходят

перемещения, закрывающие этот канал.

Таким образом, конформация феррицитохрома оказы-

вается значительжГболее плотной и «закрытой», чем кон-

формация

ферриформы.

Как

уже было сказано выше, эта интерпретация ре-

зультатов рентгеноструктурного исследования была дана

*) Электронная тропа

при

этом, естественно, разрушается.

Возможно, однако, тропа

и не

играет существенной роли

процессе

электронного

переноса, реализующегося

по

туннельному механизму

(см.

гл. 7).

5.4] НЕКОТОРЫЕ РЕАКЦИИ С

УЧАСТИЕМ

БЕЛКОВ Ц5

на

основе изучения кристаллов феррицитохрома с из серд-

ца

лошади и ферроцитохрома с из сердца тунца [72, 73].

Сравнивая

структуры ферри- и ферроцитохрома с из серд-

ца

тунца, те же авторы пришли к выводу об отсутствии

сколько-нибудь существенных конформационных или кон-

фигурационных изменений, сопровождающих восстановле-

ние

феррицитохрома с 174, 75]. Этот вывод вызывает удив-

ление.

Многочисленные исследования феррицитохрома с

его восстановления в растворе свидетельствуют в поль-

зу значительных структурных изменений (см., например,

обзор [76]).

В работе [77] изучена зависимость скорости изотопного

обмена водородов в молекуле цитохрома с от состояния

окисления

железа гема. Показано, что при окислении чис-

ло атомов водорода, способных к быстрому обмену, су-

щественно возрастает. В соответствии со сказанным выше,

это

указывает не только па то, что

структура

феррицито-

хрома более открыта, но и на большую лабильность ферри-

цитохрома, на большую амплитуду флуктуационных коле-

баний

белковой глобулы.

Следует

иметь в

виду,

что практически все исследова-

ния

в растворе проведены с цитохромом с из сердца ло-

шади. В нашей лаборатории было показано, что величины

структурных изменений в области активного центра, соп-

ровождающих электронное восстановление феррицито-

хрома с, меняются в широких пределах в зависимости от

источника

цитохрома с [78]. Возможно, что цитохром с

тунца (или

даже

всех

холоднокровных) характеризуется

особенно

незначительными структурными изменениями при

окислительно-восстановительных превращениях. Возмож-

но

также, что. изменения, регистрируемые при сравнении

кристаллических образцов, существенно отличаются от

изменений

происходящих в растворе.

Представление о скорости конформационных измене-

ний

цитохрома с при восстановлении можно получить на

основании

результатов интересной работы [79], в которой

изучалась кинетика изменения спектра феррицитохрома

с при его превращении в ферроформу под действием гид-

ратированных электронов, образующихся при импульс-

ном

радиолизе. Восстановление железа заканчивается

быстрее, чем за 10^

сек, однако спектр продукта отлича-

ется от спектра обычного восстановленного цнтохрома с.

116 СТРУКТУРНЫЕ

ИЗМЕНЕНИЯ

БИОПОЛИМЕРОВ

[ГЛ. 5

Дальнейшие изменения спектра вплоть до полного его

совпадения с обычным происходят в

результате

медлен-

ного мономолекулярного процесса с к ж 8,5 сев"

, т. е.

длятся сотни миллисекунд. Вопрос о том,

успевают

ли

пройти

эти конформационные перестройки при нормаль-

ном

функционировании цитохрома с, остается, естествен-

но,

открытым. Еще медленнее происходят конформацион-

ные

изменения при гидратации цитохрома с [80].

Недавно конформационно неравновесные состояния

цитохрома с, возникающие в

ходе

реакций с его участием,

были детально изучены в нашей лаборатории. При

низко-

температурном восстановлении феррицито

хрома

с в твер-

дой матрице термолизованными электронами были зафик-

сированы

промежуточные состояния (активный центр

восстановлен, большая часть

глобулы

— в «окислен-

ной» конформации) [78]. То обстоятельство, что в водной

среде

при комнатной

температуре

восстановление цито-

хрома

с обычными химическими агентами протекает через

аналогичные конформационно неравновесные состояния,

было доказано исследованием образования комплекса меж-

ду цитохромом с и окисью

углер9Да

[81]. Равновесный

феррицитохром с не связывает СО, так как комплекс может

образоваться только с восстановленным гемом. Равновес-

ный

ферроцитохром также практически не связывает СО,

по-видимому, в связи с тем, что

«закрытая»

конформация

белка не

дает

возможности молекуле СО приблизиться к

железу.

В то же время, если проводить восстановление в

присутствии СО, то комплекс легко образуется. Цито-

хром

связывает СО в промежуточном конформационном

состоянии,

когда железо уже восстановлено, а конформа-

ция

глобулы

еще не

успела

измениться. Этим же методом

было показано, что в условиях динамического окис-

лительно-восстановительного равновесия в растворе кон-

формационные

переходы

между

равновесными окислен-

ными

и восстановленными формами цитохрома с практи-

чески не происходят (не

успевают

произойти).

Промежуточные конформационно неравновесные со-

стояния

феррицитохрома с были зарегистрированы также

после скачкообразных изменений рН или ионной силы

раствора [82, 83].

5.5] О

КОМПЕНСАЦИОННОМ

ЭФФЕКТЕ

. Ц7

5.5. О

КОМПЕНСАЦИОННОМ ЭФФЕКТЕ

Уже

течение многих

лет в

исследованиях, посвящен-

ных термодинамике

кинетике процессов

конденсиро-

ванной

фазе (главным образом

растворах), обсуждается

явление,

получившее название

компенсационного

эффекта.

Особенно отчетливо этот эффект наблюдается

процес-

сах,

которых принимают участие макромолекулы

био-

полимеров (денатурация, комплексообразование, инак-

тивация,

ферментативный катализ).

данном параграфе,,

где

будут

суммированы основные экспериментальные

факты,

относящиеся

компенсационному эффекту,

и в;

следующем,

где я

попытаюсь проанализировать

устано-

вить физический смысл параметров, определяемых

при

термодинамических

кинетических исследованиях

та-

ких процессов, речь

будет

идти

биополимерах. Однако

полагаю,

что все

выводы, которые

будут

сделаны, спра-

ведливы

и в тех

случаях,

когда компенсационный эффект

наблюдается

при

реакциях низкомолекулярных соеди-

нений.

Феноменологически

термодинамический компенсаци-

онный

эффект заключается

существовании линейной

за-

висимости

между

изменениями энтальпии

изме-

нениями

энтропии

ряду родственных изотермически

протекающих процессов

выражается соотношением

= а + T

(i = 1, 2

,...),

(5.36)

где

фиксирует данное превращение

ряду,

а а и Т

—

постоянные.

Константа

есть, очевидно,

не что

иное,

как

свободная энергия любого

из

процессов данного ряда

при

температуре

Т = Т

, а

постоянная

имеет размерность

температуры

называется обычно температурой

компен-

сации.

Таким образом,

данном ряду превращений

все

процессы характеризуются одинаковыми значениями

кон-

станты равновесия

К = ехр

(—a/RT

)

при

одной

и той же

температуре

Т = Т

Графики компенсационного эффекта

строят либо

координатах

и AS

(рис. 5.8, а),

либо

в;

координатах

AAHi

AASt

(рис.

5.8, б), где

символы

ААН

AASi

обозначают разности

между

и AS

соответ-

ствующими величинами

для

одного

из

членов данного

ря-

да превращений, который выбран

качестве стандарта.

Обычно стандартным считают процесс

наименьшими

118

СТРУКТУРНЫЕ

ИЗМЕНЕНИЯ

БИОПОЛИМЕРОВ

[ГЛ. 5

значениями

и AS

. Второй способ представления

отвечает

уравнению

ДЛЯ; =

AAS

(5.37)

Совершенно аналогично формулируется и кинетический

компенсационный

эффект. В этом

случае

энтальпия, энтро-

пия

и свободная энергия процесса заменяются энтальпией,

АН-

а)

АЛ

И-

AS; .

AAS

Рис.

5.8. Два способа представления компенсационного эффекта.

или энергией *),

активации, энтропией активации

и свободной энергией активации

Для кинети-

ческого компенсационного эффекта имеем

= a T

1, 2 ,. . .),

(5.38)

а вместо константы равновесия

следует

говорить о констан-

те скорости процесса, которая в данном

ряду

должна быть

постоянной

при Т = Т

. Подборку

существующих

эк-

спериментальных данных по термодинамическому и ки-

нетическому компенсационным эффектам, их анализ и

рассмотрение различного рода теорий этих эффектов

можно найти, например, в превосходных обзорах L84, 85].

Существует

несколько приемов построения ряда для

получения комценсационного эффекта, т. е. методов вы-

бора пар значений AH

, AS

для построения компенсацион-

ных графиков типа приведенных па рис. 5.8, а и 5.8, б.

Первый прием заключается в закономерном изменении

химического строения одного из реагентов с тем, чтобы

получить гомологичный ряд однотипных химических про-

цессов, второй — в закономерном изменении среды проте-

кания

реакции (изменение рН, концентрации электроли-

тов, добавка этанола в

водную

среду

и т. п.).

*) Си. § 5.3.

5.5] О

КОМПЕНСАЦИОННОМ ЭФФЕКТЕ

Ц9

Все описанные

литературе случаи компенсационного

эффекта

можно разбить

на два

типа.

первому типу

от-

носятся эффекты,

для

которых постоянная

близка

к тем-

пературе проведения опыта

(так

называемый

полный

ком-

пенсационный

эффект). Типичный пример такого рода

иллюстрируют подобранные Лихтенштейном

Сухору-

ковым данные

по

кинетике

термодинамике денатурации

белков

и по

кинетике фрементативных реакций

[84, 86].

В этих случаях величины

были весьма близки

к тем-

пературам измерения, которые

свою очередь

могут

варьировать только

узких пределах

уже

благодаря

спе-

цифике

объектов. Точки ложатся

на

компенсационные

графики

большим разбросом,

реально измеряемые

(без

расчетов

применением уравнений типа Вант-Гоф-

фа

иАррениуса) константы равновесия или скорости реак-

ции

не

слишком отличаются

друг

от

друга

(если

бы они

различались сильнее,

то при

используемой стандартной

технике

их

просто нельзя было

бы

измерить).

При

этих

условиях компенсационного эффекта

не

может

не

быть

*).

Речь ведь идет просто

о том, что

имеется набор близ-

ких

по

величине значений, например констант равнове-

сий

которые представляются

виде произведения

двух

сомножителей:

= exp

(ASt/R)

exp

(—AH

/RT).

(5.39)

Легко понять,

что, как бы ни

производить разбиение

на

сомножители, если

их

произведения должны быть близки

друг

другу,

температуры измерения

не

слишком силь-

но

различаются,

то

должно удовлетворяться соотношение

(5.36).

В этом

случае

истинная проблема заключается

не в

природе компенсации,

а в том,

почему похожие процессы

с близкими значениями реально измеряемых констант

равновесия

или

скоростей

могут

столь сильно различаться

по

значениям величин

АН и AS (или АН

и AS

рассчи-

тываемых

по

уравнениям Вант-Гоффа

или

Аррениуса.

А различия

между

ними

могут

быть весьма велики

(на

сотни килокалорий

сотни энтропийных единиц).

Примеры второго типа иллюстрируют весьма точные

измерения,

дающие компенсационные графики

малым

Это

соображение было высказано

И. В.

Березиньвд,

120 СТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ БИОПОЛИМЕРОВ [ГЛ. 5

разбросом точек и значения Т

, явно не совпадающие с

температурой измерения. Много примеров этого типа при-

ведено в уже цитированном обзоре [85]. Можно указать,

например,

на работы Битлстона с соавторами по термоди-

намике

связывания различных лигандов с гемоглобина-

ми,

выделенными из крови различных животных [87—91].

Следует

полностью отдавать себе отчет в том, что при

получении данных для построения компенсационных

графиков

исследователь обязательно использует уравне-

ния

типа Вант-Гоффа или Аррениуса и, следовательно,

принимает

справедливость

всех

постулатов, на которых

они

основаны. В

случае

кинетического компенсационного

эффекта

исследователь вообще лишен

другого

пути на-

хождения значений AS

i и

случае

термодинамиче-

ского компенсационного эффекта положение иное: в послед-

нее время появилась возможность прямого калориметри-

ческого измерения AH

. Однако для нахождения AS

исследователь все равно вынужден прибегать к

расчету,

основанному на допущении справедливости уравнения

Вант-Гоффа и, следовательно, равновесного термодинами-

ческого соотношения (5.3).

Мы

не

будем

здесь рассматривать существующих тео-

ретических представлений о природе компенсационного

эффекта.

Интересующийся этим вопросом читатель мо-

жет обратиться к уже цитированным выше обзорам. Из

изложенного выше, вероятно,

ясно,

что я придерживаюсь

следующей точки зрения: компенсационного эффекта, как

физического

явления вообще не

существует,

и он появля-

ется вследствие неправильного применения некоторых

уравнений равновесной термодинамики.

5.6.

АНАЛИЗ

ПРИМЕНИМОСТИ

УРАВНЕНИЙ

ВАНТ-ГОФФА

И АРРЕНИУСА

ТЕОРИИ

АКТИВИЗИРОВАННОГО

КОМПЛЕКСА

РЕАКЦИЯМ

УЧАСТИЕМ

БИОПОЛИМЕРОВ

Удобно отделить обсуждение термодинамических пара-

метров от обсуждения кинетических. Мы начнем с термо-

динамических. Суммируем основные выводы, которые мож-

но

сделать из проведенного в данной главе рассмотрения

экспериментальных данных.