Блюменфельд Л.А. Проблемы биологической физики

Подождите немного. Документ загружается.

4.4] НЕКОТОРЫЕ СВОЙСТВА БИОПОЛИМЕРНЫХ СТРУКТУР 71

Вместе с тем при незначительных локальных (например,

образование дополнительной связи с небольшой молеку-

лой или ионом) или общих (например, небольшое измене-

ние

температуры) возмущениях, недостаточных для пере-

вода молекулы в новое конформационное состояние (т. е.

для изменения схемы замыкания вторичных связей, опре-

деляющих объемные взаимодействия), может сравнитель-

но

сильно измениться геометрия, конфигурация, молекул.

В этом отношении свойства больших молекул, обладаю-

щих вторичной и третичной структурой, резко отлича-

ются от свойств малых молекул. Минимум свободной

энергии при неизменной конформации может в

случае

биополимеров достигаться при несколько ином располо-

жении не связанных вторичными связями мономеров. Это-

му способствует возможность поворотов вокруг ординар-

ных связей главной цепи, а также не очень строгие требо-

вания,

предъявляемые к линейности водородных связей,

т. д.

Ажурная

структура

биополимера напоминает сложную

проволочную конструкцию, которую может

«повести»

при

изменении температуры или возникновении неболь-

ших локальных напряжений. Эту особенность больших

цепных молекул со вторичной или третичной

структу-

рами

следует

иметь в виду при рассмотрении их химиче-

ских взаимодействий

друг

другом

и с малыми молеку-

лами.

При

достаточно сильных возмущениях можно ожидать

истинных конформационных переходов с разрывом од-

них и замыканием новых вторичных связей. Если диск-

ретные уровни свободной энергии лежат достаточно близ-

ко

и отделены

друг

от

друга

сравнительно низкими

энергетическим или энтропийным барьерами *), то можно

ожидать возникновения конформационных колебаний

релаксационной природы. Иногда эти переходы и колеба-

ния

могут

не затрагивать всю молекулу, а носить более

или менее локальный характер.

При рассмотрении

всех

явлений, связанных с измене-

ниями

конфигурации и конформации биополимеров,

Малость

энтропийного

барьера

означает,

что для

перехода

из

одного

состояния

другое

требуется

изменить

последовательно

сравнительно

небольшое

число

слабых

связей

или что

этот

переход

может

реализоваться

многими

способами.

72 О СТАТИСТИЧЕСКОЙ ФИЗИКЕ БИОПОЛИМЕРОВ [ГЛ. 4

следует

помнить, что эти структуры, как было показано вы-

ше,

представляют собой в значительной степени механи-

ческие системы с жесткой памятью на различных уровнях

организации,

с целыми областями фазового пространства,

недостижимыми без разрушения структуры. Поэтому мож-

но

ожидать существования немногих выделенных степеней

свободы и движение частей системы во время конформа-

ционных

и конфигурационных переходов должно быть по

преимуществу

механическим.

случае

чисто релаксацион-

ных конформационных переходов после быстрых возму-

щений

к состоянию нового частичного равновесия можно

ожидать весьма больших характеристических времен этих

процессов.

Все перечисленные свойства биополимерных

структур

должны решающим образом влиять на их функциони-

рование.

Г Л А В А 5

КОНФОРМАЦИОННЫЕ

КОНФИГУРАЦИОННЫЕ

ИЗМЕНЕНИЯ

БИОПОЛИМЕРОВ

5.1.

ВВЕДЕНИЕ

В конце предыдущей главы мы увидели, к каким след-

ствиям может привести то обстоятельство, что важнейшие

биополимеры представляют собой существенно кинетиче-

ски

неравновесные структуры с памятью на различных

уровнях организации и с выделенными степенями свобо-

ды, т. е. в значительной степени являются «машинами».

В таких системах для отображения их истинного движения

пространстве и времени требуется учитывать значитель-

но

меньше степеней свободы, чем в принципе необходимо

для их полного описания.

Следует

четко отдавать себе

отчет в том, что

существуют

две причины такого «механи-

ческого поведения» макромолекул биополимеров: их боль-

шие

размеры и возможность образования большого коли-

чества вторичных связей, достаточно сильных, чтобы фик-

сировать различные конформации (дискретные уровни

свободной энергии по Лифшицу [1]), и достаточно слабых,

чтобы допускать конфигурационные и конформационные

переходы под действием различных возмущений.

Именно

способность к конформационным переходам,

способность к движению с участием выделенных механи-

ческих степеней свободы, является важнейшим свойством

биополимеров, в значительной мере определяющим их

функционирование.

Исследованиям таких переходов было

последние годы посвящено большое число работ, в ос-

новном

экспериментального характера. Однако при анали-

зе своих экспериментальных данных большинство авторов

не

учитывает отмеченные в гл. 4 принципиальные особен-

ности

биологически важных макромолекулярных структур.

Поэтому в настоящей главе

будут

не только рассмот-

рены

экспериментальные результаты исследований кон-

формационных

и конфигурационных изменений биополи-

меров, но и заново проанализированы эти результаты (за

исключением данных, непосредственно относящихся к

74 СТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ БИОПОЛИМЕРОВ [ГЛ. 5

ферментативному катализу, которые разбираются в сле-

дующей главе).

Наибольшее количество имеющихся в литературе ра-

бот посвящено изучению так называемой денатурации био-

полимеров.

Этот термин не имеет строго определенного

смысла и употребляется для обозначения самых различ-

ных изменений свойств макромолекул под влиянием са-

мых различных воздействий. При рассмотрении термоди-

намических и 'кинетических характеристик различных

денатурационных процессов возникает общая проблема

применимости

понятий и уравнений, используемых в

физи-

ческой химии малых молекул, для описания процессов, в

которых принимают участие макромолекулы биополимеров.

Речь идет о применимости закона действующих масс, урав-

нений

Вант-Гоффа, Аррениуса и теории активированного

комплекса.

Ввиду

важности этого вопроса, для многих

проблем, обсуждаемых в настоящей книге, он

будет

под-

робно исследован уже здесь, хотя основные следствия из

нашего рассмотрения (относящиеся к кинетике и механиз-

му ферментативных реакций и механизмам трансформа-

ции

энергии в клетке)

будут

использованы потом.

Весьма большое внимание

будет

уделено термодинами-

ческим и кинетическим аспектам конформационных и кон-

фигурационных изменений белка, наблюдаемых при ло-

кальных химических возмущениях (образование комплек-

са с малыми молекулами и ионами, отдача и присоедине-

ние

электрона и т. п.).

5.2.

ДЕНАТУРАЦИЯ

БИОПОЛИМЕРОВ

Денатурации белков посвящено огромное количество

оригинальных и обзорных работ, глав в учебниках. Нет

никакой

возможности

даже

перечислить основные экспе-

риментальные результаты и теоретические представления.

Пожалуй, в этом

даже

нет необходимости, так как по мере

усовершенствования физических методов исследования

становится все более очевидным, что, в сущности, нет еди-

ного денатурационного процесса, характеристики и ме-

ханизм которого

следует

установить. Вероятно, единствен-

ной

общей чертой

всех

эффектов, сопровождающих то,

что называют денатурацией, являются значительные из-

менения

конформации макромолекул, происходящие в

5.2] ДЕНАТУРАЦИЯ БИОПОЛИМЕРОВ 75

узкой области значений внешних параметров (температу-

ра, рН, гидростатическое давление и т. д.). В этом смысле

можно говорить о большой степени кооперативности дена-

турационных изменений, напоминающих иногда фазовые

переходы. Часто, вероятно, они и являются фазовыми пе-

реходами (глобула — клубок), рассмотренными в преды-

дущей главе.

Наиболее подробно как экспериментально, так и теоре-

тически изучено плавление или переход спираль — клу-

бок

в ДНК. В списке литературы приведены основные ра-

боты по этой теме [2—8].

Следует

обратить особое внимание

на

серию работ Лазуркина, Франк-Каменецкого и Трифо-

нова,

которые внесли, вероятно, наиболее существенный

вклад в создание последовательной концепции и в выяс-

нение

детального механизма плавления двухспиральной

нити

ДНК. В

случае

денатурации белков работ такого ти-

па

не

существует

и, по-видимому, существовать не может.

Точнее говоря, детальный механизм плавления, конфор-

мационного

перехода каждого белка определяется специ-

фической

щшформацией его макромолекулы, и в этом

смысле механизмов и теорий должно быть столько, сколь-

ко

существует

различных белков. В какой-то степени об-

щий

подход

возможен только после создания статистиче-

ской

физики систем с памятью на разных уровнях органи-

зации.

Начало создания такой теории положено работами

Лифшица,

рассмотренными в предыдущей главе.

На

протяжении многих лет при анализе денатурацион-

ных процессов чаще всего пользовались примитивным тер-

модинамическим подходом, рассматривая денатурацию

как

обычную мономолекулярную химическую реакцию,

которой вещество А (нативная форма биополимера) пре-

вращается в вещество В (денатурированная форма). Пред-

полагалось, что это превращение можно в принципе про-

вести обратимо и при фиксированном значении внешних

параметров (температура, рН, концентрация денатурирую-

щего агента и т. д.) всегда достигается истинно равновес-

ное

соотношение

между

концентрациями А и В. Этого счи-

талось достаточно, чтобы для описания денатурационного

процесса применять законы действующих масс и уравне-

ние

изотермы реакции Вант-Гоффа. При обработке ре-

зультатов кинетических исследований, естественно, поль-

зовались уравнением Аррениуса, представлениями теории

76 СТРУКТУРНЫЕ

ИЗМЕНЕНИЯ

БИОПОЛИМЕРОВ

[ГЛ. 5

абсолютных скоростей реакции

вычисляли обычны-

ми

способами энергии

энтропии активации процессов.

Лишь

самое последнее время

связи

развитием техни-

ки

высокочувствительной микрокалориметрии начали

непосредственно измерять тепловые эффекты денатура-

ционных

процессов (как, впрочем,

ряда реакций компле-

ксообразования

малых молекул

белками

реакций

ассоциации

макромолекул). Сравнение результатов равно-

весных

термохимических измерений заставляет усом-

ниться

законности первых. Впрочем, многие результаты

равновесных исследований вызывают

сами

по

себе скеп-

тическое отношение. Действительно, определяемые

по

уравнению Вант-Гоффа тепловые эффекты

энтропии

превращений

(АН и AS)

иногда чувствительны

методу

регистрации денатурационных изменений (изменения

ра-

створимости, спектра поглощения, вязкости, оптического

вращения,

ферментативной активности, устойчивости

протеолизу, доступности различных химических групп),

способу проведения денатурации (тепло, добавление

кислоты,

добавление мочевины

других

денатурирую-

щих агентов),

незначительным изменениям солевого

со-

става среды. Примеры этому можно найти

во

всех

моно-

графиях

обзорах, посвященных термодинамическим

ас-

пектам денатурации белков (см., например,

[9]).

Аналогичная ситуация характерна

и для

активацион-

ных параметров

—

энергии

АЕ

энтропии

актива-

ции.

Рассмотрим несколько примеров, иллюстрирующих

определение термодинамических параметров денатурации

равновесными

термохимическими (прямыми) методами,

а также определение активационных параметров

по

кине-

тическим измерениям.

Кислотная

денатурация

ферригемоглобина.

Прямое

измерение теплового эффекта этой реакции

[10]

было про-

ведено при температурах

15 и 25° С.

При

15°

интервале

рН

3,51—3,19

константа скорости реакции меняется

от

0,031

до 0,130 мин*

, а

тепловой эффект процесса

АН =

—76

±1,6

ккал/молъ.

При

25°

интервале

рН

3,79—

3,40 константа скорости реакции меняется

от

0,029

до

0,350

мин"

, а

тепловой эффект меняет знак

становится

равным

-f- 10,0 ± 0,3

ккал/молъ

(положительный тепло-

вой

эффект соответствует поглощению тепла

ходе

про-

цесса).

Если учесть,

что

при денатурации происходит свя-

5.2] ДЕНАТУРАЦИЯ БИОПОЛИМЕРОВ 77

зывание протонов (одинакового их числа при обеих тем-

пературах), и внести поправку на энергию, необходимую

для извлечения протонов из среды (эта энергия равна ну-

лю при 25° и +12,5

ккал/молъ

при 15° С), то различие меж-

ду тепловыми эффектами при 15

и 25

станет еще значи-

тельнее:

ДЯ

—88,5

ккал/молъ,

АН

2Ь

= +10,0

ккал/молъ.

(5.1)

Таким

образом, при повышении температуры на

тепловой эффект процесса возрастает почти на

100

ккал/молъ,

меняя свой знак. Это формально соот-

ветствует

повышению теплоемкости при денатурации

на

Ас

= +9850

кал-моль'

-град'

(при 20° G). Близкие

величины были получены и при исследовании денатурации

сывороточного альбумина [11].

чем может быть связана такая сильная температур-

ная

зависимость теплового эффекта? В принципе ее можно

объяснить двумя способами. Во-первых, этот

результат

может полностью определяться законом Кирхгоффа, т. е.

различием теплоемкостей нативного и денатурированного

состояний

(тогда приведенная выше величина Ас

имеет

реальный физический смысл и не может считаться формаль-

ной).

Изменение теплоемкости может быть, например,

связано

с тем, что в денатурированном состоянии на по-

верхность выходят гидрофобные группы и увеличивается

энергия

гидрофобного взаимодействия с растворителем.

Альтернативой приведенному объяснению является пред-

положение,

согласно которому при разных температурах

под влиянием кислоты наблюдаются по

существу

различ-

ные

процессы. Это означает, что либо начальная, либо ко-

нечная

структуры меняются с температурой, причем их

изменения

сопровождаются поглощением или выделением

тепла. Такое предположение эквивалентно представлению

том, что при каждой температуре происходит

другая

реакция

кислотной денатурации со своим тепловым эф-

фектом.

В чем принципиальное различие этих

двух

воз-

можных объяснений? В первом

случае

изменение теплового

эффекта

с температурой

(дАН/дТ)

определяется различи-

ем теплоемкостей начального и конечного состояний (Дс

В рассматриваемом примере

—•£=—=

Дс

9850

кал-молъ~

-град~

(5.2)

78 СТРУКТУРНЫЕ

ИЗМЕНЕНИЯ

БИОПОЛИМЕРОВ [ГЛ. 5

Все структурные изменения в системе при этом происходят

только в

результате

реакции денатурации (при данной

постановке опыта вследствие изменения рН при фикси-

рованной

температуре, а при

другой

— вследствие, на-

пример,

изменения температуры при фиксированном зна-

чении

рН). Изменение температуры само по себе не при-

водит к каким-либо изменениям характеристик исходного

конечного состояний. В этом

случае

должно выполняться

очевидное термодинамическое соотношение

дАН dAS ,„ч

связывающее температурный коэффициент теплового эф-

фекта с температурным коэффициентом изменения энтро-

пии

системы в

результате

протекания реакции.

Если

правильно второе объяснение, то при разных тем-

пературах

идут,

собственно говоря, разные реакции и со-

отношение

(5.3) не должно выполняться.

Ведь

тогда

АН и AS должны входить величины АН' и AS', характе-

ризующие процессы перестройки, происходящие с исход-

ными

(или конечными) соединениями под действием тем-

пературы и не связанные

между

собой термодинамическим

соотношением типа (5.3). Пусть, например, при некоторой

температуре Т

процесс кислотной денатурации сопровож-

дается изменением энтальпии на АН (7\) и энтропии на

AS (Т

). Проведем теперь тот же процесс при большей тем-

пературе Т

. Конечно, закон Кирхгоффа

будет

выполнять-

ся

и величины АН и AS изменятся за счет конечной вели-

чины

Ас

. Однако если

структура

исходной молекулы

изменилась,

т. е. произошло превращение под действием

нагревания,

которое характеризуется своими параметрами

АН' и AS', то наблюдаемые термодинамические параметры

кислотной

денатурации станут равными АН (Т

) — АН' и

AS (Г

) — AS' (для простоты принято, что

структура

ко-

нечного,

денатурированного состояния практически не

меняется

с температурой). Поскольку АН' и AS' не свя-

заны

соотношением (5.3), а определяются конкретной

структурой белка, то и для наблюдаемых параметров кис-

лотной денатурации АН — АН' и AS — AS' соотношение

(5.3) не

будет

выполняться. Если второе объяснение пра-

вильно,

то

структура

исследуемого белка должна в об-

ласти комнатных температур претерпевать изменения, су-

§5.2] ДЕНАТУРАЦИЯ БИОПОЛИМЕРОВ 79

щественно влияющие на путь реакции кислотной

денату-

рации.

Исследование того же процесса кислотной денатурации

равновесными методами дало совершенно

другие

резуль-

таты. Определяя константу равновесия К денатурации

спектрофотометрически (при денатурации изменяется

спектр поглощения ферригемоглобина в видимой области

спектра), Штейнхард и Цайзер [12, 13], пользуясь уравне-

ниями

Вант-Гоффа

(

)

d\nK _ Aff .,, ,,

d(l/T)

- ~~R~~'

{

-°-

нашли,

что график зависимости In К от 1/7" имеет два

прямолинейных участка с изломом при 15,5° С. В интер-

вале температур от 0,2 до 15,5° G тепловой эффект оказал-

ся

равным 32

ккал/молъ,

а в интервале температур от 15,5

до 25° С — практически

равным

нулю.

Несовпадение результатов равновесных и прямых тер-

мохимических измерений представляется весьма стран-

ным,

если допустить, что температурная зависимость теп-

лового эффекта полностью определяется различием тепло-

емкостей начального и конечного состояний, т. е. законом

Кирхгоффа. С первого взгляда может показаться, что при

определении теплового эффекта с помощью равновесных

измерений (т. е. по тангенсу

угла

наклона кривой в коор-

динатах In К и 1/7

) предполагают постоянство величин

АН и AS. Однако это не так. Действительно, пусть АН

AS не зависят от температуры. Тогда из (5.4) имеем

ЭКН . i d!±S \

дТ ~Т~ R дТ ) '

что эквивалентно соотношению (5.5).

Если А/7 и AS зависят от температуры, то

dK _

I Aff1 ЭКН

~ {

Выполнение термодинамического соотношения (5.3) ав-

томатически превращает (5.7) в (5.6). Таким образом, в

формуле (5.5) не заложено требование температурной не-

зависимости изменений энтальпии и энтропии в

ходе

80 Ш

СТРУКТУРНЫЕ

ИЗМЕНЕНИЯ

БИОПОЛИМЕРОВ

[ГЛ. 5

исследуемого процесса, а заложено предположение, что эти

изменения

подчиняются (5.3). В частности, при выполне-

нии

закона Кирхгоффа, т. е. когда

АН = ДЯ° +

Ас

Т,

AS = AS

+ Ac

In T (5.8)

температурная зависимость энтальпии и энтропии пре-

вращения

определяется только разностью теплоемкостей

начального и конечного состояний, применение уравне-

ния

Вант-Гоффа должно давать истинные значения АН.

Наблюдаемые существенные расхождения результатов

калориметрических и равновесных измерений, различаю-

щихся не только по величине, но и по знаку изменения

АН с температурой, не поддаются примитивной интерпре-

тации.

Форест и Стюртевант [10] объясняют отличие своих ре-

зультатов от значений, полученных с помощью равновес-

ных методов, предполагая, что кислотная денатурация

ферригемоглобина протекает в две стадии, одна из которых

не

регистрируется спектрофотометрически. Пусть К

— константы равновесия этих

двух

стадий, а АН

АН

— соответствующие истинные (измеряемые калори-

метрически) молярные тепловые эффекты:

А^В = С. (5.9)

В качестве первого случая рассмотрим

следующую

си-

туацию. Пусть спектрофотометрически регистрируется

только второй переход, а спектральные характеристики

А и В неразличимы (исследователь

даже

не подозревает

наличии промежуточного состояния В).

Пусть Ъ

и с

—•

истинные равновесные концентрации

В и С, а

— суммарная концентрация белка. Тогда в на-

шем

случае

спектрофотометрическое измерение

даст

для

кажущейся константы равновесия

(5.10)

(5Л1)

^каж

«о

Подставив сюда