Блюменфельд Л.А. Проблемы биологической физики

Подождите немного. Документ загружается.

5./] О

СПОНТАННЫХ

КОНФОРМАЦИОННЫХ

КОЛЕБАНИЯХ 131

ходить постепенно в каком-то интервале температур, а при

температуре излома скачком может измениться величина

Ъ в уравнении

(5.44)

(например, в связи с прохождением

меняющегося с температурой расстояния

между

центрами

связывания

на макромолекуле через значение, соответ-

ствующее расстоянию

между

центрами связывания на

низкомолекулярном

лиганде). Интерпретировать этот ска-

чок

можно только в том случае, когда известны детально

конструкция

системы и ее изменения с температурой в

ходе

исследуемого процесса.

Я полагаю, что все сказанное выше может быть отне-

сено

и ко многим химическим процессам в конденсирован-

ной

фазе, идущим без участия биополимеров. Роль макро-

молекулы

могут

в этих случаях играть, например, струк-

турированные образования типа сольватных оболочек.

§ 5.7. О СПОНТАННЫХ КОНФОРМАЦИОННЫХ КОЛЕБАНИЯХ

БЕЛКОВЫХ МАКРОМОЛЕКУЛ

В предыдущей главе было отмечено, что при соблюде-

нии

некоторых условий в белковых макромолекулах долж-

ны

наблюдаться спонтанные переходы

между

близкими

конформациями

или конфигурациями. В последнее время

литературе появились сообщения об исследованиях не-

скольких типов, в которых, возможно, удалось наблю-

дать такие конформационные колебания. Прежде всего

следует

упомянуть ведущиеся уже более 15 лет чрезвы-

чайно

интересные работы Шноля и др. [94—1Q3L В их

работах'представлены доказательства того, что для свеже-

приготовленных растворов и гелей белков актомиозино-

вого комплекса такие характеристики, как ферментатив-

ная

активность, количество доступных определению по-

верхностных S—Н-групп, сорбционная способность по

отношению к некоторым красителям, испытывают колеба-

тельные изменения с частотой, не превышающей 10 гц.

Аналогичные наблюдения были сделаны' Четвериковой на

креатинкиназе

[101—103].

Обобщение этих работ можно

найти

в [104].

Авторы

считают, что их результаты сви-

детельствуют

о существовании спонтанных конформацион-

ных изменений макромолекул исследуемых белков. Наи-

более загадочной особенностью этих колебаний является

их большая или меньшая синхронность в макрообъеме

132 СТРУКТУРНЫЕ

ИЗМЕНЕНИЯ

БИОПОЛИМЕРОВ ЕГЛ. 5

(иначе их нельзя было бы зарегистрировать применяемы-

ми

методами). Никакой более или менее обоснованный

механизм возникновения синхронных колебаний пока не

предложен.

Имеются исследования второго типа, где некоторые

особенности спектров протонного резонанса ряда белков

полипептидов интерпретируются как свидетельство

наличия

конформационных колебаний с частотой от де-

сятков герц (рибонуклеаза) до десятков килогерц (не-

которые полипептиды)

[105—107].

Такая интерпретация

основана на эффективном усреднении локальных магнит-

ных полей на определенных ядрах водорода при конфор-

мационных колебаниях. Нельзя не упомянуть также о ста-

рых работах Линдерштрём-Ланга [108], в которых было

показано,

что быстрый дейтерообмен водородов пептид-

ных связей внутренних частей

глобулы

косвенно свиде-

тельствует

в пользу конформационных колебаний (флук-

туации) (см. также [56, 57]).

Мы

не

будем

подробно останавливаться на работах, по-

священных" конформационным и конфигурационным коле-

баниям

белковых

глобул.

Скажем только, что, если

соответствующие данные и их интерпретация подтвердят-

ся,

они откроют новую, исключительно важную страницу

развитии биологической физики.

§ 5.8. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Материалы этой главы позволяют следующим образом

сформулировать задачи, стоящие перед исследователями,

изучающими конформационные и конфигурационные из-

менения

биополимеров.

а) Измерение тепловых эффектов возможно большего

числа реакций биополимеров прямыми калориметриче-

скими

методами. Выяснение природы изменений эффек-

тивных теплоемкостей белков с температурой.

б) Прямая регистрация структурных изменений макро-

молекул в

ходе

реакций с их участием.

в) Прямая регистрация структурных изменений макро-

молекул с температурой.

г) Экспериментальное разделение быстрых и медлен-

ных (релаксационных) стадий таких превращений.

5.8] ЗАКЛЮЧЕНИЕ 133

д) Создание теории, которая

даст

в руки исследователя

методы интерпретации экспериментальных данных вза-

мен неприменимых в данном

случае

термодинамических

кинетических методов, разработанных для гомогенных

газовых реакций.

Конечно,

все, перечисленное выше, значительно

труд-

нее выполнить, чем проводить измерения температурных

зависимостей констант равновесия и скоростей, строить

логарифмические анаморфозы и интерпретировать резуль-

таты в терминах упорядочения или разупорядочения сис-

темы в зависимости от знака рассчитываемой величины AS.

Г Л А В А 6

ФИЗИКА

ФЕРМЕНТАТИВНОГО

КАТАЛИЗА

6.1.

ВВЕДЕНИЕ

Едва ли не важнейшей функцией белков является их

каталитическая, ферментативная, функция. Не имеет

никакого

смысла давать здесь сколько-нибудь полный об-

зор установленных экспериментальных фактов, найден-

ных эмпирических закономерностей и предложенных тео-

рий,

относящихся к ферментативному катализу. В ли-

тературе

уже

существует

огромное (может быть,

даже

избыточное) количество монографий и обзоров, посвящен-

ных этому вопросу. Некоторые из них приведены в списке

литературы [1—5].

Как

мы знаем, все известные ферменты представляют

собой белки и для функционирования фермента нужна

вся

белковая

глобула

*); это позволяет предположить, что

все, сказанное в предыдущей главе об особенностях про-

цессов с участием биополимеров, может оказаться справед-

ливым и для катализируемых ферментами химических

реакций.

Действительно, представления о важной роли

конформационной

лабильности белков, например в

регу-

ляторных механизмах ферментативного катализа, за по-

следние годы перешли из категории

«этого

не может

быть»

категорию

«это

тривиально», довольно поспешно пройдя

стадию экспериментального и теоретического анализа.

В настоящей главе

будет

предпринята попытка про-

анализировать следствия, к которым приводит распростра-

нение

на ферментативные процессы выводов, полученных

предыдущей главе в

результате

рассмотрения термо-

динамики

и кинетики конформационных и конфигурацион-

ных превращений белков. Глава строится по

следую-

щему плану. Вначале

будут

изложены общие принципы

*) Известные экспериментальные

результаты,

согласно которым

а тивность некоторых ферментов сохраняется при их фрагментации

[6, 7], оказались ошибочными [8, 9].

6.2l

ОБЪЯСНЕНИЯ

ФЕРМЕНТАТИВНОЙ

АКТИВНОСТИ

135

существующих

теоретических

подходов

к объяснению

высокой

эффективности биокатализаторов и

других

осо-

бенностей их действия. Затем

будут

приведены эксперимен-

тальные данные, доказывающие необходимость распро-

странения

на ферментативные реакции выводов, сделан-

ных в предыдущей главе. Механичность, «машинность»

работы ферментов

будет

продемонстрирована на примере

нескольких более или менее хорошо изученных фермента-

тивных процессов. Конец главы

будет

посвящен формули-

ровке новых представлений о физике, лежащей в основе

элементарного акта ферментативного процесса.

§ 6.2. СУЩЕСТВУЮЩИЕ

ОБЪЯСНЕНИЯ

ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ

Прежде всего несколько слов об одном распространен-

ном

среди биохимиков заблуждении. Многие считают,

что

существуют

некие общие теории химического катали-

за, но их применение к ферментативным реакциям

затруд-

нено

ввиду

сложности биохимических процессов и биоло-

гических катализаторов. Эта ошибочная точка зрения

основана

на неоправданном преклонении биохимиков

перед могуществом классической физической химии. К со-

жалению, сколько-нибудь последовательной общей теории

катализа не

существует.

Имеется

огромный экспериментальный материал, сви-

детельствующий

о том, что во многих

случаях

в фермента-

тивных реакциях можно проследить известные эмпири-

ческие и полуэмпирические закономерности, установлен-

ные

при изучении гомогенного катализа в растворах. Речь

идет

о кислотно-основном катализе, катализе ионами и

комплексами

металлов и т. п. (см., например, обзор в

[1]).

В гомогенном катализе, по

существу,

исследователь

имеет

дело

с проблемой кинетики реакций в жидкой фазе.

Катализатор при этом — просто один из реагентов, об-

разующий промежуточное соединение с исходными про-

дуктами и позволяющий суммарной реакции пройти по

другому

пути. Физическая теория кинетики жидкофазных

реакций

еще не создана. Таким образом, обычный гомо-

генный

химический катализ никакими преимуществами

(в

смысле теоретической базы) перед ферментативным не

обладает.

136

ФИЗИКА

ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА

(гл. 6

Что касается гетерогенного катализа,

то

положение

с теорией здесь, по-видимому, значительно

хуже,

чем

ферментативном катализе. Прежде всего,

это

связано

тем, что в

случае

ферментативного катализа гораздо

легче

поставить чистый

воспроизводимый эксперимент.

Сколь

бы

сложны

ни

были катализаторы, сколь осторож-

ным

ни

надо быть

при их

препаративном выделении,

они,

конце концов, представляют собой макромолекулы,

синтезируемые

клетках матричным способом практичес-

ки

однозначно. Поэтому воспроизводимость работы

вы-

деленных ферментов,

как

правило, значительно

лучше

воспроизводимости действия

твердых

катализаторов

не-

биологического происхождения, тонкие детали

структуры

которых, определяющие

их

активность (дефекты поверх-

ности

и т. п.),

почти невозможно повторить.

Прежде

чем

говорить

об

объяснениях ферментатив-

ного катализа, необходимо более точно сформулировать,

что, собственно, надо объяснить,

т. е. что

понимается

под

словами «фермент ускоряет химическую реакцию».

Не-

достаточно сказать,

что

надо сравнивать скорость иссле-

дуемой

ферментативной реакции

со

скоростью

той же

реакции

гомогенном растворе

без

фермента.

Ведь

та же

реакция

без

фермента может просто

не

идти. Большинство

ферментативных процессов представляет собой последо-

вательность нескольких реакций

несколькими стабиль-

ными

промежуточными продуктами. Могло

бы,

например,

оказаться,

что

смоделировать

отсутствие

фермента

та-

кой

путь

суммарной реакции невозможно.

счастью,

по-видимому, это, как правило,

не так.

Косовер ввел очень

удобное

понятие

конгруэнтной

модельной

системы,

т. е.

системы,

которой

без

фермента реализуется

та же сум-

марная

реакция через

те же

стабильные промежуточные

продукты

[10]. Это

могут

быть промежуточные продукты

взаимодействия молекул

субстратов

между

собой,

или

субстратов

ионами (например, Н

или

субстратов

с ка-

талитическими группами.

В дальнейшем, когда речь пойдет

степени активности

фермента,

об

ускорении реакции,

всегда

подразумевает-

ся,

что

сравнение производится

конгруэнтной модель-

ной

системой.

У ферментативной системы

конгруэнтной модельной

системы совпадают пути реакций, фиксируемые стабиль-

6.2] ОБЪЯСНЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ 137

ными

(в принципе выделяемыми) промежуточными про-

дуктами. Что касается путей реакций в

ходе

отдельных

стадий, то они, как правило, не известны ни для фермен-

тативной, ни для модельной систем. Эти пути безусловно

не совпадают — в противном

случае

каталитический эф-

фект был бы невозможен.

Все великое множество имеющихся в литературе то-

чек зрения на природу исключительно высокой катали-

тической активности ферментов можно разделить на че-

тыре группы. В основе этих типов теоретических подхо-

дов соответственно лежат следующие утверждения:

1. Комплексообразование с ферментом концентри-

рует

и взаимно ориентирует реагирующие частицы (мо-

лекулы субстратов, каталитические группы), увеличи-

вая,

таким образом, число эффективных столкновений.

Это означает повышение предэкспоненциального множи-

теля в уравнении Аррениуса или, что то же самое, повы-

шение энтропии активации AS

в уравнениях теории ак-

тивированного комплекса.

2. Образование фермент-субстратного комплекса сни-

жает энергию активации АЕ

реакции. Это происходит

за счет изменения распределения электронной плотности

в молекуле субстрата, за счет ее насильственной дефор-

мации

при образовании комплекса и т. д.

3. В фермент-субстратном комплексе более вероятны

большие флуктуации тепловой энергии на некоторых ко-

лебательных степенях свободы, на некоторых связях. Фер-

мент, таким образом, как бы собирает тепловую энергию,

направляя ее на связь, подвергающуюся химическому

превращению.

4. Энергия, выделяющаяся при сорбции субстрата на

ферменте (при образовании фермент-субстратного ком-

плекса),

или при протекании одной из стадий сложной

ферментативной реакции, или в

ходе

превращения в одно-

стадийной ферментативной реакции, не рассеивается

в виде тепла, а рекуперируется и используется для пре-

одоления активационных барьеров следующих стадий или

элементарных актов.

Рассмотрим подробнее эти варианты объяснений. Пер-

вые два варианта — наиболее естественные, классичес-

кие.

Действительно, если константа скорости реакции

представляется в виде произведения

двух

сомножителей

138

ФИЗИКА

ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА [ГЛ. 6

(энтропийного и энергетического) и она возрастает при

переходе от некатализируемого процесса к ферментатив-

ному, то при этом обязательно должен увеличиться хотя

бы один из

двух

сомножителей. Итак, начнем с энтропий-

ного сомножителя.

Фермент

повышает

энтропию

активации. Этот

вариант объяснения подробно обсуждается в ряде работ

(см.,

например, [11]). Смысл предполагаемых эффектов

заключается в следующем. В конгруэнтной модельной

системе протекание реакции

требует

сближения субстра-

тов

между

собой, субстратов с ионами, субстратов с ката-

литическими группами (если такие есть), а также соответ-

ствующей ориентации реагирующих частиц

друг

отно-

сительно

друга.

Согласно теории активированного комп-

лекса элементарная стадия реакции идет однозначно по

пути с наименьшим активационным барьером, что пред-

полагает вполне фиксированную

структуру

переходного

состояния.

Эти эффекты (сближение, ориентация и т. д.)

обусловливают поэтому значительный отрицательный

вклад в энтропию активации для модельной системы.

Если комплексообразование с ферментом приводит к нуж-

ной

исходной ориентации субстратов

друг

относительно

друга

и относительно каталитических групп фермента,

то в фермент-субстратном комплексе энтропия системы уже

понижена. Поэтому энтропия активации процесса повы-

шается и реакция ускоряется. Концентрирование реа-

гентов в

результате

комплексообразования не всегда при-

водит к ускорению реакции. Если один из реагентов при-

сутствует

в избытке (например, вода при гидролитических

процессах), то вследствие локализации реакции в срав-

нительно немногочисленных комплексах (концентрация

фермента всегда мала) процесс может

даже

замедлиться.

Однако ориентационные эффекты всегда должны быть

выгодны. Расчетная величина ускорения реакции за счет

таких энтропийных эффектов может быть в принципе

сколь угодно велика, так как она определяется тем диапа-

зоном телесных

углов

между

взаимодействующими части-

цами,

который исследователь

считает

допустимым для

оптимального протекания процесса. Чем меньше этот

диапазон, т. е. чем точнее фермент должен фиксировать

в пространстве реагенты

друг

относительно

друга,

тем

больше результирующее ускорение процесса, Кошланд

5 6.2] ОБЪЯСНЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ

13§

в оценочных расчетах

[11, 12]

приходит

выводу,

что та-

кие энтропийные эффекты

могут

привести

увеличению

скорости реакции

на 18

порядков

внести,

таким

образом,

основной вклад

суммарное каталитическое действие

фермента.

он

f 11) +

СН

СООП

/С

н,о

НООС

сн,

ОН

СН

\А^

СН

.).

СН

сп

С\

о"

СНз

сн.

Недавно появилась весьма интересная работа Миль-

стина

Кона

[13],

цель которой состояла

прямой

140

ФИЗИКА

ФЕРМЕНТАТИВНОГО

КАТАЛИЗА

1ГЛ.

экспериментальной проверке возможности столь больших

эффектов

фиксации взаимного расположения реагирую-

щих групп

(т. е.

резкого ограничения поступательных

вращательных степеней свободы).

работе исследована

кинетика

катализируемых кислотой реакций образова-

ния

сложного эфира. Сравнивали

между

собой пять

процессов, схемы которых приведены выше.

В ряду

1—5

последовательно

все

больше фиксируется

относительное расположение

ориентация гидроксильной

карбоксильной групп,

между

которыми

результате

реакции образуется сложноэфирная связь. Реакция

бимолекулярна,

исходные ориентации практически

ни-

чем

не

ограничены.

мономолекулярных реакциях

2—5

свобода движений реагирующих групп последовательно

ограничивается возрастающими стерическими затрудне-

ниями.

табл.

6.1

приведены значения измеренных термо-

динамических

кинетических параметров реакций:

кон-

станты равновесия

А',

стандартной свободной энергии

реакции

эффективной константы скорости

при

кис-

лотном катализе

А;н

о+-

Таблица

6.1

Номер

реакции

К'

3,8-Ю-

0,04

0,62

25,67

>99

AF0,

ккал'моль

7390

1980

290

—1950

—2770

O+

~ Ю-

моль'

•

сек'

5,94-10"

сек-

6,22-Ю-

сек-i

2,62-10-

сек'

9 -10

сек--

Таким образом, переход

от

бимолекулярной

моно-

молекулярной реакции

дальнейшие ограничения степе-

ней

свободы реагирующих групп приводят

конце концов

повышению скорости реакции более

чем на 15

порядков

(это утверждение верно, если концентрации реагентов

в бимолекулярной реакции

не

превышают

1 М).

первого взгляда может показаться,

что

приведенные

результаты действительно подтверждают возможность

рез-

кого ускорения ферментативной реакции

за

счет энтро-

пийных факторов

могут

служить экспериментальным

доказательством правильности первого варианта теорети-