Белясова Н.А. Биохимия и молекулярная биология

Подождите немного. Документ загружается.

160

COO

OOC

FAD

FADH

COO

NAD

NADH

Оксалоацетат

COO

Сукцинат

Фумарат

Фумараза

Сукцинат-

дегидрогеназа

Малатдегид-

рогеназа

L-Малат

+ Н

Рис. 11.5. Заключительная стадия ЦТК: регенерирование оксалоацетата

Оксалоацетат

СоА

Цитрат

Изоцитрат

NAD

NADH

Оксалосукцинат

Сукцинат

Фумарат

СО

СоА

NAD

NADH

СоА

FAD

FADH

NAD

NADH

H C

COO

Глиоксилат

Сукцинат

Ацетил-СоА

цис-Аконитат

Изоцитрат-

лиаза

a-Кетоглутарат

Сукцинил-СоА

L-малат

GTP

GDP

Рис. 11.6. Цикл трикарбоновых кислот. Пунктирными линиями обо-

значены превращения глиоксилатного цикла

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

161

водных субстратов). Большинство углеродных атомов в порфиринах ведут

свое происхождение от сукцинил-СоА. Однако потребление промежуточных

продуктов ЦТК для целей биосинтеза обязательно должно сопровождаться их

восполнением, в противном случае цикл прервется. В норме между реакция-

ми, за счет которых определенные промежуточные продукты удаляются из

цикла и, наоборот, поступают в цикл, существует состояние динамического

равновесия.

Восполняющие запас промежуточных продуктов ЦТК реакции носят на-

звание анаплеротических. Одной из основных анаплеротических реакций

клеток млекопитающих является карбоксилирование пирувата с образовани-

ем оксалоацетата. Катализирует это превращение аллостерический фер-

мент — пируваткарбоксилаза. Его активатором служит субстрат ЦТК —

ацетил-СоА. В условиях накопления ацетил-СоА стимулируется активное

карбоксилирование пирувата и увеличивается количество оксалоацетата, ко-

торый служит непосредственным акцептором ацетил-СоА.

В клетках бактерий и растений восполнение оксалоацетата осуществляет

другой фермент — фосфоенолпируват-карбоксилаза.

11.3. Баланс ЦТК

На рис. 11.6 показано, что каждый оборот цикла трикарбоновых кислот

сопровождается поступлением в него двух атомов углерода (в виде молекулы

ацетил-СоА) и выходом из него двух атомов углерода (в виде двух молекул

СО

). В молекуле СО

достигается высшая степень окисленности углерода.

Окисление углерода сопровождается отщеплением от промежуточных

продуктов ЦТК четырех пар атомов водорода. Это сопровождается восста-

новлением 3 молекул NAD

и 1 молекулы FAD, образуется 3 молекулы

NADH и 1 молекула FADH

. Регенерация окисленных форм переносчиков

восстановительных эквивалентов происходит в дыхательной цепи, где конеч-

ным акцептором электронов выступает молекулярный кислород. Поэтому

ЦТК функционирует только в аэробных условиях, несмотря на то что молеку-

лярный кислород не принимает непосредственного участия в реакциях цикла.

Каждый оборот ЦТК обеспечивает запасание энергии на уровне субстратного

фосфорилирования: синтезируется одна молекула АТР (либо GTP).

Общая стехиометрия ЦТК:

Ацетил-СоА + 3NAD

+ FAD + ADP + P

+ 2H

O ®

® 2CO

+ 3NADH + FADH

+ ATP + 2H

+ CoA

11.4. Регуляция ЦТК

Скорость функционирования ЦТК регулируется на нескольких уровнях и

оказывается точно пригнанной к потребностям клетки. Основной реакцией,

лимитирующей интенсивность оборотов цикла, является окислительное де-

карбоксилирование изоцитрата. Изоцитратдегидрогеназа представляет собой

аллостерический белок, активируемый аденозиндифосфатом, который повы-

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

162

шает сродство фермента к субстратам. Ингибитором активности изоцитратде-

гидрогеназы служит NADH, который «вытесняет» из активного центра NAD

Другой фермент ЦТК — цитратсинтетаза — испытывает ингибирование

со стороны АТР: с увеличением содержания АТР в клетке снижается насы-

щение активного центра фермента ацетил-СоА и, как следствие, уменьшается

скорость образования цитрата.

Еще один фермент ЦТК — сукцинатдегидрогеназа изменяет свою актив-

ность в процессе аллостерической регуляции: активируется фосфатом и сук-

цинатом, а ингибируется оксалоацетатом. При накоплении в клетке ЩУК не

происходит окисление сукцината.

Наконец, активность a-кетоглутаратдегидрогеназы аллостерически инги-

бируется продуктами катализируемой этим ферментом реакции —сукцинил-

СоА и NADH.

Следует отметить, что у разных организмов могут существовать различ-

ные, в том числе не охарактеризованные здесь способы регуляции скорости

реакций ЦТК.

11.5. Другие пути окисления одно- и двухуглеродных

субстратов

Цикл трикарбоновых кислот осуществляется в клетках бактерий, грибов,

простейших, растений, животных и является одним из самых важных циклов

аэробных организмов. Однако у некоторых бактерий и растений существуют

другие пути окисления одно- и двухуглеродных молекул. Как правило, ис-

пользование альтернативных путей бывает вызвано тем, что в качестве един-

ственного источника углерода и энергии используется какой-либо неуглевод-

ный субстрат. В таком случае клетки вынуждены искать возможность такого

способа окисления субстрата, который приводит к образованию промежуточ-

ных продуктов, способных превращаться в необходимые клетке метаболиты.

Примером подобной ситуации может служить функционирование глиок-

силатного цикла в клетках семян высших растений. Когда основным запас-

ным веществом семян служат триацилглицериды, остатки жирных кислот

которых превращаются при окислении в ацетил-СоА, клетки используют гли-

оксилатный цикл (рис. 11.6, 11.7). Особенность этого цикла состоит в том,

что изоцитрат не декарбоксилируется, как в ЦТК, а расщепляется под дейст-

вием изоцитрат-лиазы на сукцинат (возвращается на этап b-окисления) и

глиоксилат (рис. 11.6).

Глиоксилат затем конденсируется с еще одной молекулой ацетил-СоА

(фермент малат-синтетаза) и превращается в L-малат. Это четырехуглерод-

ное соединение может окисляться в оксалоацетат либо декарбоксилироваться

с образованием пирувата. И оксалоацетат, и пируват могут использоваться

клеткой в качестве предшественников биосинтеза многих нужных клетке ве-

ществ, в том числе глюкозы (рис. 11.7).

Этот процесс используют и бактерии, например E. coli, Pseudomonas, а

также некоторые простейшие в случаях, когда единственным источни-

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

163

Глиоксилат

COO

H C

СоА

"Яблочный

фермент"

NAD

(NADP

NADH

(NADPH)

NAD

NADH

Оксалоацетат

Ацетил-СоА

Малат-

синтетаза

Малат-

дегидрогеназа

L-малат

Пируват + СО

Рис. 11.7. Реакции глиоксилатного цикла

ком углерода служит ацетат. У бактерий ЦТК и глиоксилатный цикл про-

странственно на разделены, а у эукариот часть ферментов, необходимых для

глиоксилатного пути, находится в особых органеллах —глиоксисомах. Гли-

оксисомы по структуре напоминают пероксисомы. Поскольку глиоксилатный

путь можно рассматривать как анаплеротические реакции (восполняют коли-

чество сукцината, малата, оксалоацетата), то его часто считают частью ЦТК

(рис. 11.6).

Некоторые бактерии существуют в условиях, когда единственным источ-

ником углерода являются такие двухуглеродные соединения, как гликолат,

глицин, оксалат. Все эти вещества могут превращаться в глиоксилат

(рис. 11.8), который, в свою очередь, окисляется до СО

и Н

О в цикле ди-

карбоновых кислот. В этом цикле акцептором глиоксилата служит ацетил-

СоА, который регенерируется в системе реакций. Каждый оборот цикла со-

провождается образованием двух молекул углекислоты и высвобождением

двух пар электронов, которые в составе двух молекул NADH поступают в

дыхательную цепь.

HO CH

СОО

N CH

OOC

Гликолат

Глицин

Оксалат

H C

COO

Глиоксилат

Переаминирование

Цикл дикарбоновых

кислот

СОО

-2[H]

+2[H]

2NAD

2NADH

2CO

Оксолил-СоА

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

164

Рис. 11.8. Окисление двухуглеродных субстратов

Клетки многих микроорганизмов, а также некоторых растений и живот-

ных способны окислять и другие необычные субстраты, в том числе одноуг-

леродные (например, формиат), извлекая при этом энергию. В каждом случае

реализуется оригинальный метаболический путь, позволяющий использовать

отщепленные от субстрата электроны в дыхательной цепи для синтеза АТР.

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

165

Глава 12. ДЫХАНИЕ

Дыхание является одним из самых распространенных способов запасания

энергии, которым обладает большинство организмов: животные, растения,

простейшие, грибы, аэробные и почти все факультативно анаэробные бакте-

рии. В процессе дыхания энергия запасается по механизму окислительного

фосфорилирования, донорами электронов могут выступать как органиче-

ские, так и неорганические вещества, а акцепторами электронов служат толь-

ко неорганические вещества. По сравнению с субстратным окислительное

фосфорилирование — гораздо более выгодный и эффективный механизм, в

эволюционном плане находящийся на более высокой ступени. Его отличи-

тельной особенностью является обязательное участие мембран, в которых в

строго определенной очередности расположены компоненты дыхательной

цепи. Движущей силой синтеза АТР служит энергия протонного градиента на

мембране. В свою очередь, протонный градиент создается в результате пере-

носа электронов по компонентам дыхательной цепи в определенном направ-

лении: от лучшего донора к лучшему акцептору.

Компоненты дыхательной цепи (электронтранспортная система) и ка-

тализирующий образование АТР фермент (АТР-синтаза) располагаются у

прокариот в плазматической мембране, а у эукариот — во внутренней мем-

бране митохондрий. Именно в этих органеллах, как было показано ранее

(глава 9, 11), в ходе катаболических и амфиболических процессов формиру-

ется наибольшее количество восстановительных эквивалентов, которые с по-

мощью никотинамидных и флавиновых переносчиков передаются в дыха-

тельную цепь.

В дыхательной цепи осуществляются реакции, представляющие собой

биохимический аналог горения водорода. Их отличительной особенностью

является запасание значительной части выделяющейся энергии в виде макро-

эргических связей АТР, т. е. перевод свободной энергии в биологически дос-

тупную форму. И лишь небольшая доля выделяющейся при дыхании энергии

рассеивается в виде тепла.

Для понимания механизма окислительного фосфорилирования необходи-

мо, прежде всего, охарактеризовать компоненты дыхательной цепи, законо-

мерности их функционирования и расположения в мембране.

12.1. Характеристика компонентов дыхательной цепи

Компоненты дыхательной цепи представляют собой переносчики восста-

новительных эквивалентов, среди них присутствуют переносчики водорода и

переносчики электронов. Причем их расположение в мембране строго опре-

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

166

делено: переносчики водорода чередуются с переносчиками электронов, и

лучшие доноры электронов всегда предшествуют лучшим акцепторам.

Поскольку транспорт электронов и транспорт водорода являются сопря-

женными и эквивалентными процессами, дыхательную цепь можно рассмат-

ривать как цепь переноса электронов (электронтранспортную цепь). Ее ос-

новными компонентами служат флавопротеины, железосерные белки, хи-

ноны и цитохромы.

Флавопротеины. Представляют собой ферменты, содержащие в качестве

простетических групп FMN или FAD. Эти переносчики восстановительных

эквивалентов охарактеризованы в главе 7. Следует подчеркнуть, что флави-

новые кофакторы переносят водород и являются более сильными окислите-

лями, чем NAD

Железосерные белки. Эти окислительно-восстановительные системы со-

держат атомы железа, связанные, с одной стороны, с серой аминокислотных

остатков цистеина, а с другой — с неорганической сульфидной серой. Желе-

зосерные центры (рис. 12.1) можно рассматривать как простетические группы

ферментов, имеющие, однако, структуру, отличную от гема. Поэтому железо-

серные белки называют еще белками с негемовым железом.

Число атомов железа и сульфидной серы в этих белках может различать-

ся, но наиболее часто встречаются белки, содержащие 2Fe, 2S

и 4Fe, 4S

Железосерные белки переносят только электроны. В частности, 2Fe, 2S

2—

центры транспортируют по одному электрону. При этом электроны не лока-

лизуются на атомах какого-то одного типа, а взаимодействуют и с ядрами

железа, и с ядрами серы, т. е. находятся в делокализованном состоянии.

Железосерные белки принимают участие в фиксации молекулярного азота

нитрогеназными системами, в восстановлении сульфитов и нитритов, в фото-

синтезе, окислении алканов.

Хиноны. Это низкомолекулярные переносчики водорода, которые при-

сутствуют во внутренней части липидного бислоя митохондриальных мем-

бран в 10—15-кратном избытке по сравнению с другими компонентами элек-

тронтранспортной системы. Благодаря наличию неполярной гидрофобной

цепи молекулы хинонов свободно перемещаются в липидном бислое. Разли-

чают несколько семейств хинонов, среди которых наиболее распространены

убихиноны (в переводе с латинского —вездесущие хиноны), которые также

называют коферментами Q (СоQ). Количество изопреноидных звеньев в

молекуле хинона обозначают в виде подстрочного символа (Q

). Убихиноны

митохондрий млекопитающих содержат 10 изопреноидных звеньев (Q

), а

убихиноны бактерий — 6 (Q

). На рис. 12.1 представлена структура и стадии

окисления—восстановления убихинонов.

Среди других групп хинонов известны пластохиноны (содержатся в

мембранах хлоропластов, осуществляют транспорт водорода в фотосисте-

мах), токоферолы (различные формы витамина Е с антиоксидантными

функциями), филлохиноны и менахиноны (семейство витаминов группы К,

участвуют в транспорте водорода у микобактерий, в свертываемости

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

167

S S

цистеинцистеин

цистеин

пептидная

цепь

пептидная

цепь

COOH

Гем а

[

]

[

]

[

Убихинон

Убигидрохинон

Простетическая группа железосерного

белка типа (2Fe,2S

)

+ 2 [H]

- 2 [H]

(убихинол)

Рис. 12.1. Структура и особенности функционирования компонентов дыха-

тельной цепи. В пунктирных рамках — сульфидная сера, способная отщеп-

ляться при подкислении в виде сероводорода

крови у млекопитающих). Дополнительные сведения об этих соединениях

содержатся в главе 17.

Цитохромы. Данные окислительно-восстановительные ферментные сис-

темы содержат в качестве простетической группы гем (рис. 12.1). Централь-

ный атом железа в геме участвует в переносе электронов, изменяя свою ва-

лентность:

Гем-Fe

« Гем-Fe

+ e

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

168

Цитохромы являются переносчиками электронов, и некоторые из них (ци-

тохромоксидаза) способны передавать электроны непосредственно на моле-

кулярный кислород.

Различают множество цитохромов, выделенных из разных источников.

Их принято обозначать сочетанием буквенных и цифровых символов: буквы

обычно указывают на тип гема (например, a, b, c, o), а цифры — на значение

длины волны a-полосы в спектре поглощения (например, 552; 557,5; 450).

Для электронтранспортной системы особенно важно, что разные цитохромы

характеризуются различными окислительно-восстановительными потенциа-

лами и расположены в мембране в определенной очередности по отношению

друг к другу. Только цитохром с, как полагают, находится в растворенном

состоянии на внешней поверхности внутренней митохондриальной мембра-

ны.

12.2. Окислительно-восстановительный

потенциал компонентов

Компоненты дыхательной цепи ведут себя как типичные окислительно-

восстановительные системы, переходя попеременно в процессе транспорта

электронов из восстановленного состояния в окисленное и наоборот. При

этом порядок расположения переносчиков в мембране обусловлен величиной

их окислительно-восстановительного потенциала (ОВП), который служит

мерой способности соединений или элементов отдавать электроны.

Подобно химическим элементам, функционирующие в клетках вещества

тоже можно расположить в ряд по величине их ОВП (Е

) при степени восста-

новления 1/2. Отрицательный окислительно-восстановитель-ный потенциал

свидетельствует о том, что данное вещество имеет меньшее сродство к элек-

тронам, чем молекулярный водород. Положительные значения Е

характери-

зуют более высокое, чем у Н

, сродство к электронам у данного вещества.

Таким образом, сильный восстановитель, например NADH, обладает отрица-

тельным Е

, а сильный окислитель (например, О

) — положительным Е

. В

биохимии пользуются величиной Е

`, приведенной к рН 7. Значения Е

` от-

дельных компонентов дыхательной цепи находятся в пределах от (-) 0,32 В

(для NAD

/NADH) до (+) 0,82 В (для О

/1/2 О

). Соответственно никотина-

мидные переносчики начинают дыхательную цепь, т. е. располагаются в ее

начале, а молекулярный кислород завершает цепь, выполняя роль конечного

акцептора электронов.

Разность ОВП двух реагирующих веществ может служить мерой измене-

ния свободной энергии в химической реакции, т. е. мерой полезной работы,

которую способна выполнить система. Сопоставление окислительно-

восстановительных потенциалов компонентов дыхательной цепи позволяет

обнаружить три этапа окисления, на которых высвобождается достаточное

для синтеза молекулы АТР количество энергии (не менее -0,15 В). В

табл. 12.1 представлены значения Е

` основных компонентов дыхательной

цепи, а также разность потенциалов (DЕ

) взаимодействующих систем.

Таблица 12.1. Окислительно-восстановительные потенциалы компонентов дыха-

тельной цепи

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

169

Компонент Е

`, В DЕ

, В Образование АТР

NAD

/NADH

FMN/FMNH

FeS/FeS(2e)

Q/QH

Цитохром b (Fe

/Fe

)

Цитохром c

(Fe

/Fe

)

Цитохром c (Fe

/Fe

)

Цитохром a*a

(Fe

/Fe

)

/1/2O

-0,32

-0,30

-0,25

+0,02

+0,03

+0,22

+0,24

+0,25*, +0,39

+0,82

-0,02

-0,05

-0,27

-0,01

-0,19

-0,02

-0,01

-0,43

нет

да

нет

да

нет

да

12.3. Механизм окислительного фосфорилирования

Вся система переносчиков в дыхательной цепи внутренней мембраны ми-

тохондрий включает примерно 70 различных полипептидов, организованных

в 4 ферментных комплекса: NADH—CoQ-редуктаза (комплекс I), CoQH

—

цитохром c-редуктаза (комплекс III), цитохромоксидаза (комплекс IY) и сук-

цинат—СоQ-редуктаза (комплекс II). Дыхательная цепь тесно примыкает к

АТР-синтазному комплексу, в котором осуществляется фосфорилирование

АDP. Для ответа на вопрос о том, каким образом транспорт электронов по

компонентам дыхательной цепи сопряжен с синтезом АТР, предложено не-

сколько гипотез:

1) гипотеза химического сопряжения (Е. Слейтер, 1953 г.): перенос элек-

тронов вызывает серию химических реакций, в ходе которых образуется не-

кий высокоэнергетический продукт. Расщепление этого продукта сопровож-

дается высвобождением энергии, достаточной для синтеза молекулы АТР;

2) гипотеза конформационного сопряжения (П. Бойер, 1964 г.): транспорт

электронов вызывает конформационные изменения в белковых компонентах

в мембране, что связано с переходом их в высокоэнергетическую форму. Эти

изменения передаются АТР-синтазе, которая активируется и катализирует

синтез АТР;

3) хемиосмотическая гипотеза (предложена Питером Митчеллом в

1961 г.): перенос электронов сопровождается выводом протонов в межмем-

бранное пространство митохондрий. Так на внутренней мембране создается

электрохимический градиент, который и запускает работу АТР-синтазы.

Иными словами, синтез АТР осуществляется за счет осмотической энергии

протонного градиента.

Из всех рассмотренных гипотез наиболее состоятельной и подтвержден-

ной многими экспериментальными данными является гипотеза Митчелла.

Она, в частности, объясняет необходимость целостности мембраны для син-

теза АТР. Однако и ее положения носят пока статус теории и далеки от со-

вершенства, хотя признаны большинством исследователей и будут рассмот-

рены ниже.

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)