Белясова Н.А. Биохимия и молекулярная биология

Подождите немного. Документ загружается.

150

Глава 10. БРОЖЕНИЕ

Брожение со времен Пастера называют «Жизнью без воздуха». Этот тип

метаболизма возник на нашей планете одним из самых первых —еще в то

время, когда в атмосфере отсутствовал молекулярный кислород. Наиболее

древние обитатели Земли использовали этот самый примитивный и наименее

выгодный с энергетической точки зрения способ метаболизма для своей жиз-

недеятельности. В ходе эволюции возникли новые, более перспективные про-

цессы запасания энергии, однако брожение по прежнему используется мно-

гими организмами, поскольку позволяет им осуществлять жизнедеятельность

в условиях отсутствия молекулярного кислорода.

Брожение происходит в клетках бактерий, дрожжей (для этих микроорга-

низмов брожение является преобладающим типом метаболизма), простей-

ших, моллюсков, в некоторых тканях рыб и птиц, а также высших животных,

включая человека (мышцы, хрусталик и роговица глаза).

Известно большое разнообразие процессов брожения, которые отличают-

ся друг от друга субстратами, продуктами, а также химическими превраще-

ниями. При этом можно различить несколько типов брожения, встречающих-

ся наиболее часто: спиртовое, молочнокислое, пропионовокислое, муравьино-

кислое, маслянокислое, ацетоно-бутиловое. Свое название эти типы брожения

получили от доминирующих или характерных продуктов, которые образуют-

ся в результате определенной последовательности реакций. Нетрудно заме-

тить, что среди продуктов преобладают органические кислоты и спирты. Суб-

стратами для разных типов брожения служат также органические вещест-

ва — в большинстве случаев пируват, а также лактат, ацетил-СоА, некоторые

промежуточные метаболиты гликолитического пути, аминокислоты. Таким

образом, брожение можно определить как катаболический процесс, происхо-

дящий в условиях, не требующих участия молекулярного кислорода, в кото-

ром и донорами, и акцепторами электронов являются органические вещества.

Реакциям брожения всегда предшествуют предварительные этапы катабо-

лизма субстратов: чаще гликолиз, реже — пентозофосфатные и фосфоглюко-

натный пути. Поэтому часто реакции собственно брожения рассматривают в

совокупности с предшествующими этапами, и в этом случае можно говорить

о запасании энергии в ходе таких процессов. Однако следует помнить, что

энергия в форме макроэргических связей АТР запасается в процессе суб-

стратного фосфорилирования, как правило, еще до образования пирувата. В

процессах собственно брожения энергия запасается редко, и можно назвать

всего три реакции, в которых фосфорилируется ADP: образование масляной,

уксусной, а также ацетоуксусной кислот. В брожениях других типов дополни-

тельного количества энергии не образуется, и их основной задачей является

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

151

регенерация окисленной формы переносчика восстановительных эквивален-

тов — NAD

. Это необходимо для бесперебойного осуществления реакций

гликолиза и других катаболических путей, в ходе которых, как известно, про-

исходит расщепление субстратов, сопровождающееся их окислением, что

требует постоянного присутствия в клетке акцепторов восстановительных

эквивалентов — NAD

Рассмотрев более детально несколько типов брожения, можно убедиться в

том, что соблюдается эквивалентность между количеством молекул NADН,

образованных в ходе гликолиза, и числом молекул NAD

, сформировавшихся

в ходе собственно брожения (при условии, что в метаболизме не принимает

участие молекулярный кислород). Таким образом, в анаэробных условиях

использующие бродильный тип метаболизма клетки вынуждены тратить су-

щественную часть двух-, трехуглеродных органических веществ для акцепти-

рования водорода, выводя их затем из клетки. Этот крайне непроизводитель-

ный процесс приводит к тому, что в анаэробных условиях клетки перераба-

тывают огромные количества субстрата, чтобы извлечь нужное для жизне-

деятельности количество энергии. Неслучайно у многих факультативно-

анаэробных микроорганизмов выработался механизм подавления процессов

брожения в аэробных условиях с переключением на дыхательный метабо-

лизм. При дыхании из одной молекулы глюкозы клетка может извлечь мак-

симально 38 молекул АТР, а при брожении — только 4 (в большинстве слу-

чаев всего 2).

10.1. Спиртовое брожение

Преобладающим продуктом спиртового брожения является этиловый

спирт. Этот тип брожения характерен для определенных видов дрожжей, бак-

терий, а также мицелиальных грибов. Известно 3 основных способа спирто-

вого брожения, которые отличаются друг от друга тем, какой из трех катабо-

лических путей расщепления глюкозы (и некоторых других сахаров) реализу-

ется: гликолиз, пентозофосфатные пути либо путь Энтнера—Дудорова. Наи-

более часто, как отмечалось выше, клетки используют гликолиз, и его конеч-

ный продукт — пируват чаще других служит субстратом спиртового броже-

ния.

На рис. 10.1 представлены схемы двух способов спиртового брожения.

Первый способ предполагает катаболизм глюкозы по гликолитическому пути

(характерен для дрожжей и бактерий Sarcina ventriculi), а второй — по пен-

тозофосфатному (гетероферментативные молочнокислые бактерии). Соответ-

ственно различаются участвующие в этих процессах ферменты и спектр про-

дуктов. Третий способ спиртового брожения, который используют бактерии

Zymomonas mobilis, отличается тем, что глюкоза катаболизируется по пути

Энтнера—Дудорова. Образующийся пируват подвергается декарбоксилиро-

ванию, как и в первом случае, и ступенчато восстанавливается в этанол.

Часть пирувата восстанавливается в молочную кислоту.

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

152

Глюкоза

Гликолиз

C C

Ацетальдегид

C CH

Этанол

Глюкоза

NADP

NADPH

NADP

NADPH

O P

C C

Ацетальдегид

C C

Этанол

C CH

O P

OHH

Ацетилфосфат

Пируват

NAD

NADH

СО

NADHNAD

H OH

Лактат

Стадии

гликолиза

2ATP

2ADP

4ADP

4ATP

2NAD

2NADH

2 Пируват

2СО

Пируватде-

карбоксилаза

Алкоголь-

дегидрогеназа

Пентозофос-

фатный путь

2ADP

2ATP

Рибулозо-5-фосфат

Глицеральдегид-

-3-фосфат

Фосфо-

кетолаза

Лактатдегид-

рогеназа

2ATP

2ADP

Рис. 10.1. Способы спиртового брожения: 1 — основанный на гликолитиче-

ском расщеплении глюкозы; 2 — основанный на пентозофосфатном пути. По-

казано только число образованных, но не затраченных молей АТР

На рис. 10.1 наглядно продемонстрировано, что количество затраченных в

ходе гликолиза и пентозофосфатного пути молекул NAD

(NADP

) строго

соответствует количеству регенерированных в процессе спиртового брожения

молекул NAD

(NADP

). При этом реакции субстратного фосфорилирования,

приводящие к синтезу АТР, имеют место только в катаболических путях до

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

153

образования пирувата. В реакциях собственно спиртового брожения, связан-

ных с преобразованием пирувата в этанол или лактат, запасание энергии не

происходит.

Ход брожения очень сильно зависит от условий, в которых функциониру-

ют клетки. Кроме того, у некоторых микроорганизмов существуют отдельные

отклонения от приведенных выше классических схем спиртового брожения. В

результате спектр продуктов брожения может сильно различаться и включать

кроме этанола и лактата примеси: глицерол, ацетальдегид, другие альдегиды,

эфиры, кетоны, спирты, в том числе высшие органические кислоты и др.

10.2. Молочнокислое брожение

Данный тип брожения также широко распространен в природе и обнару-

жен у представителей разных царств живых существ: в первую очередь у

млекопитающих, у простейших, некоторых насекомых, бактерий семейства

Lactobacillaceae, в клетках некоторых тканей птиц и рыб.

Различают два основных типа молочнокислого брожения — гомо- и гете-

роферментативное. При гомоферментативном брожении до 90% состава ко-

нечных продуктов представлено молочной кислотой. Лишь небольшая часть

образованного в процессе гликолиза пирувата превращается в уксусную ки-

слоту, этанол, ацетоин, а также СО

. Схема этого процесса представлена на

рис. 10.2. Обращает на себя внимание соотношение окисленных и восстанов-

ленных форм никотинамидных пере-носчиков: так же, как и в спиртовом

брожении, между ними сохраняется эквивалентность. Синтез АТР не осуще-

ствляется в реакциях собственно молочнокислого брожения, это происходит

еще до формирования пирувата, в гликолизе.

У микроорганизмов, осуществляющих гетероферментативное молочно-

кислое брожение (бактерии рода Lactobacillus, Leuconostoc mesenteroides),

отсутствуют ферменты гликолитического пути — альдолаза и триозофосфат-

изомераза. В клетках этих бактерий глюкоза катаболизируется с участием

пентозофосфатных путей, и субстратом брожения служит рибулозо-5-фосфат.

В этом случае реализуется 2-я схема брожения, представленная на рис. 10.1, а

среди продуктов брожения преобладают молочная кислота и этиловый спирт.

Гликолиз

Глюкоза

Лактатдегидрогеназа

2 Пируват

2 Лактат

4ADP

4ATP

2NAD

2NADH

2ATP

2ADP

Рис. 10.2. Схема процесса гомоферментативного молочнокислого брожения

10.3. Реакции субстратного фосфорилирования

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

154

Приведенные выше процессы наиболее распространенных типов броже-

ния — спиртового и молочнокислого — позволяют выявить большое разно-

образие способов и путей образования конечных продуктов.

ATP

Фосфоенолпируват

ATP

Пируваткиназа

Пируват

C CO

Гликолиз

SCoA

CoA

C COOH

ATP

Ацетилфосфат

Ацетат

CoA

Ацетоацетилфосфат

ATP

Ацетоацетат

C (CH

)

SCoA

i CoA

C (CH

)

Бутирилфосфат

Бутираткиназа

ATP

COOH

C (CH

)

Бутират

ADP+P

GDP+P

GTP

1,3-Дифосфоглицерат

3-Фосфоглицерат

Ацетил-СоА

Ацетоацетил-СоА

Бутирил-СоА

Сукцинил-СоА

Сукцинат

Фосфоглицерат-

киназа

Фосфотранс-

ацетилаза

СоА-транс-

фераза

Ацетоацетат-

киназа

Сукцинаттиокиназа

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

ADP+P

С O

Ацетат-

киназа

ADP+P

СоА-транс-

фераза

OС

ADP+P

OOC

(CH

)

COO

OOC

(CH

)

SCoA

CoA

Рис. 10.3. Реакции субстратного фосфорилирования

Как уже говорилось, существует еще не менее четырех основных типов

брожения. Важно отметить, что природа, спектр и относительные количества

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

155

конечных продуктов брожения того или иного типа зависят как от самого ор-

ганизма (его видовой принадлежности), так и от условий инкубирования (или

ситуации в клетке).

Таким образом, можно насчитать множество разнообразных химических

реакций, относящихся к собственно брожению либо к подготовительным ста-

диям (катаболические процессы расщепления углеводов). Но среди этого

множества лишь считанные реакции обеспечивают запасание энергии на

уровне субстратного фосфорилирования (рис. 10.3). При этом следует под-

черкнуть, что две первые, из приведенных на рис. 10.3 реакций, осуществля-

ются в процессе гликолиза, и только реакции 3—5 относятся к собственно

брожению. Синтез АТР при образовании ацетата, ацетоацетата и бутирата

(масляной кислоты) имеет место в маслянокислом и ацетоно-бутиловом бро-

жении. Последняя, 6-я на рис. 10.3, реакция субстратного фосфорилирования

осуществляется в цикле трикарбоновых кислот.

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

156

Глава 11. ЦИКЛ ТРИКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ

Продукты катаболизма углеводов, жирных кислот, аминокислот у боль-

шинства аэробных организмов (клеток) подвергаются полному окислению в

цикле трикарбоновых кислот (иначе — цикл лимонной кислоты, цикл Креб-

са). В этой системе замкнутых реакций образуются СО

, Н

О, запасается не-

большое количество энергии на уровне субстратного фосфорилирования и

формируется большое количество восстановительных эквивалентов. Послед-

ние с помощью переносчиков попадают в дыхательную цепь и обусловлива-

ют там синтез АТР (окислительное фосфорилирование). Таким образом, ос-

новной задачей цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) является окончательное

окисление топливных молекул и улавливание восстановительных эквивален-

тов. Кроме этого, в ЦТК образуется ряд промежуточных продуктов, которые

используются в качестве субстратов для биосинтеза важных соединений

(аминокислот, порфиринов, глюкозы). Поэтому ЦТК рассматривают как

промежуточный или центральный тип метаболизма — амфиболизм (от грече-

ского «амфи» — оба), связывающий между собой реакции катаболизма и

анаболизма.

Топливные молекулы вступают в ЦТК в виде активированного двуугле-

родного соединения — ацетил-СоА. В свою очередь, ацетил-СоА образуется

при окислении жирных кислот, расщеплении некоторых аминокислот и в хо-

де окислительного декарбоксилирования пирувата.

11.1. Окислительное декарбоксилирование пирувата

Как показано ранее (глава 9), основным продуктом катаболизма углево-

дов является пируват. Это трехуглеродное соединение образуется также при

окислении многих аминокислот. Для того чтобы пируват мог подвергнуться

дальнейшему окислению в ЦТК, он должен быть превращен в ацетил-СоА.

Этот весьма сложный процесс осуществляется с участием пируватдегидро-

геназного комплекса, который включает три фермента и пять кофакторов.

Суммарное уравнение процесса окислительного декарбоксилирования пиру-

вата выглядит довольно просто (рис. 11.1), однако механизм действия всех

компонентов пируватдегидрогеназного комплекса включает несколько ста-

дий.

На первой стадии пируватдекарбоксилаза (называется также дегидроге-

назой) с помощью своего кофактора — тиаминдифосфата катализирует де-

карбоксилирование пирувата с образованием оксиэтильного производного (—

СНОН—СН

), которое остается связанным с кофактором и ферментом. Затем

происходит перенос оксиэтильного остатка на молеку-

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

157

C CO COOH

HSCoA

Пируватдегидрогеназный

комплекс

NAD

NADH

C CO

SCoA

Пируват

Ацетил-СоА

+ СО

Рис. 11.1. Суммарное уравнение процесса окислительного де-

карбоксилирования пирувата

лу липоевой кислоты, которая служит кофактором второго фермента ком-

плекса — липоат-ацетилтрансферазы. Перенос завершается окислением

оксиэтильного остатка до ацетильной группы и частичным восстановлением

липоевой кислоты. На третьей стадии ацетильная группа переносится от ли-

поевой кислоты на тиоловую группу коэнзима А, в результате чего ацетил-

СоА отделяется от комплекса и образуется полностью восстановленная форма

липоевой кислоты — дигидролипоевая кислота. Последняя стадия процесса

катализируется третьим ферментом —дигидролипоилдегидрогеназой, со-

держащей FAD в качестве простетической группы. Этот фермент катализиру-

ет окисление дигидролипоевой кислоты в липоевую с восстановлением FAD

до FADH

. Наконец, восстановительные эквиваленты от FADH

передаются

на NAD

, который транспортирует их в дыхательную цепь.

Следует отметить, что в составе сформированного в процессе окислитель-

ного декарбоксилирования пирувата продукта — ацетил-СоА —появляется

макроэргическая связь (обозначена волнистой линией на рис. 11.1).

Активность пируватдегидрогеназного комплекса зависит от количества

АТР в клетке и регулируется с привлечением механизма ферментативной

модификации белка: АТР-зависимая протеинкиназа осуществляет фосфори-

лирование определенных аминокислотных остатков в пируватдекарбоксилаз-

ной субъединице, в результате чего фермент утрачивает активность. Обрат-

ное действие (восстановление активности пируватдекарбоксилазы) совершает

особая фосфатаза, которая дефосфорилирует белковую молекулу.

11.2. Химизм ЦТК

Реакции цикла трикарбоновых кислот осуществляются у эукариот в мито-

хондриях — там же, где функционируют системы, поставляющие «топливо»

для ЦТК: b-окисление жирных кислот, окислительное декарбоксилирование

пирувата. Считается, что ферменты, принимающие участие в ЦТК, сгруппи-

рованы в особый каталитический комплекс, расположенный между внутрен-

ними мембранами митохондрий. Структура комплекса такова, что промежу-

точные продукты цикла последовательно переходят от одного фермента к

другому, не высвобождаясь в матрикс. В этом случае скорость процесса зна-

чительно увеличивается.

Все реакции ЦТК можно условно разделить на 4 стадии: 1) акцептирова-

ние ацетил-СоА и образование изоцитрата; 2) окислительное декарбоксили-

рование изоцитрата; 3) окислительное декарбоксилирование a-кетоглутарата;

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

158

4) регенерация акцептора ацетил-СоА.

Акцептором ацетил-СоА является оксалоацетат (щавелевоуксусная кисло-

та, ЩУК). Это четырехуглеродное соединение конденсируется с двухуглерод-

ным компонентом ацетил-СоА при участии фермента цитратсинтетазы. Дан-

ная реакция альдольной конденсации протекает ступенчато, с образованием

промежуточного продукта — цитрил-СоА, гидролиз которого сдвигает на-

правление реакции в сторону образования цитрата (рис. 11.2).

Чтобы могло осуществиться окислительное декарбоксилирование шести-

углеродного соединения, цитрат (лимонная кислота) должен изомеризоваться

в изоцитрат. Этот процесс катализируется аконитазой и представляет собой

реакцию дегидратации с последующей гидратацией.

Окислительное декарбоксилирование изоцитрата катализируется изоцит-

ратдегидрогеназой, которая использует NAD в качестве кофермента. Изоцит-

рат окисляется в b-кетокислоту, оксалосукцинат, который быстро теряет кар-

боксил, будучи связанным с ферментом, и превращается в a-кетоглутарат

(рис. 11.3).

На третьей стадии (рис. 11.4) a-кетоглутарат также подвергается окисли-

тельному декарбоксилированию. Эту реакцию катализирует организованный

ансамбль ферментов — a-кетоглутарат-дегидрогеназный комплекс. Состав

ансамбля сходен с комплексом, катализирующим окислительное декарбокси-

лирование пирувата, и оба процесса имеют множество общих деталей. Про-

дуктом реакции является четырехуглеродное активированное соединение —

сукцинил-СоА. Макроэргическая

COO

Оксалоацетат

C C

SCoA

COO

CHO

SCoA

C C

COO

HO C

COO

Цитрат

COO

НС

Изоцитрат

Ацетил-СоА

Цитрил-СоА

цис

-Аконитат

Цитрат-

синтетаза

Аконитат-

дегидрогеназа

Аконитат-

гидратаза

Цитрат-

синтетаза

+ Н

+ HS-CoA

+ H

+ Н

Рис. 11.2. Первая стадия ЦТК: образование изоцитрата

связь сукцинильного тиоэфира расщепляется с участием сукцинаттиокиназы,

и это сопряжено с фосфорилированием GDP (у млекопитающих) или АТР (у

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

159

бактерий, высших растений). Образование высокоэнергетической связи GTP

или АТР при гидролизе сукцинил-СоА является единственным случаем суб-

стратного фосфорилирования, который имеет место в ЦТК.

Образовавшийся на предыдущей стадии сукцинат (янтарная кислота) в

ходе нескольких реакций (окисление, гидратация, окисление) превращается в

оксалоацеат (рис. 11.5). Данная последовательность превращений представ-

ляет собой процесс b-окисления, который уже был рассмотрен по отношению

к жирным кислотам в главе 9. Реакции последней стадии ЦТК представляют

собой регенерирование оксалоацетата. Окисление сукцината катализирует

сукцинатдегидрогеназа. Этот фермент непосредственно связан с цепью пере-

носа электронов, и в отличие от других ферментов ЦТК является интеграль-

ным белком внутренней мембраны митохондрий.

Продукт окисления сукцината — фумарат — гидратируется фумаразой.

Происходит стереоспецифическое присоединение водорода и гидроксила с

образованием L-малата (яблочной кислоты). Наконец, L-малат окисляется в

оксалоацетат малатдегидрогеназой.

Полностью циклическая система реакций ЦТК представлена на рис. 11.6.

Многие промежуточные вещества ЦТК служат предшественниками в биосин-

тетических реакциях. Например, оксалоацетат и a-кетоглутарат используются

в биосинтезе аминокислот. Оксалоацетат включается в процесс глюконеоге-

неза (образование глюкозы из неугле-

Изоцитрат

НС

COO

CO O C

COO

NAD

NADH

Оксалосукцинат

Изоцитрат-

дегидрогеназа

Изоцитрат-

дегидрогеназа

СО

a-Кетоглутарат

Рис. 11.3. Вторая стадия ЦТК: окислительное де-

карбоксилирование изоцитрата

COO

O C

COO

SCoA

COO

NAD

NADH

CoA

GDP

GTP

CoA

Сукцинат

a-Кетоглутарат

Кетоглутаратдегид-

рогеназный комплекс

Сукцинат-

тиокиназа

Сукцинил-СоА

Рис. 11.4. Третья стадия ЦТК: окислительное декарбоксилирование a-

кетоглутарата

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)