Антонов В.Ф. Практикум по биофизике

Подождите немного. Документ загружается.

графический

результат

все точнее приближается по форме к

треугольному импульсу (тому сигналу, который первоначаль-

но

подвергался Фурье-разложению).

г) Зарисуйте в тетрадь временную зависимость и спектр тре-

угольного импульса.

Задание

6. Спектральное разложение пилообразного им-

пульсного сигнала.

а) После получения на экране временной зависимости на-

жмите еще раз клавишу «ENTER» и пронаблюдайте времен-

ную зависимость y^(t) для первой гармоники. Чему рана ее ча-

стота? Согласуется ли это с теоремой Фурье?

б) Какую частоту должна иметь вторая гармоника? Ответ

проверьте, нажав клавишу "ENTER" и получив временную за-

висимость для второй гармоники.

в) После получения последней гармоники пронаблюдайте

решение компьютером задачи, обратной задаче спектрального

разложения — последовательного сложения временных зави-

симостей, соответствующих каждой из гармоник Фурье-разло-

жения

исследуемого сигнала. Обратите внимание на то, как по

мере увеличения числа складываемых гармоник графический

результат

все точнее приближается по форме к пилообразному

импульсному сигналу (тому сигналу, который первоначально

подвергался Фурье-разложению).

г) Зарисуйте в тетрадь временную зависимость и спектр пи-

лообразного сигнала.

Задание

7. Зарисовать в тетрадь в одних и тех же осях спек-

тры

трех

вышеразобранных сигналов:

— прямоугольного импульсного сигнала;

— треугольного импульсного сигнала;

— пилообразного импульсного сигнала.

В чем

сходство

и различие спектров этих сигналов?

Задание

8. Спектральное разложение гармонического сиг-

нала с медленно меняющейся частотой.

Пронаблюдать временную зависимость и спектр сигнала с

медленно меняющейся частотой. Как из приведенного уравне-

ния

зависимости co(t) найти нижнюю и верхнюю границы спе-

251

ктра — максимальную и минимальную частоты, которым со-

ответствует

отличная от нуля спектральная плотность интен-

сивности

(амплитуды)?

Задание

9. Спектр сигнала ЭКГ.

Пронаблюдайте и зарисуйте в тетрадь временную зависи-

мость и спектр сигнала ЭКГ. К какому типу спектра относится

приведенный

на экране спектр ЭКГ?

Задание

10. Применение спектрального разложения в фи-

зике.

а) Пронаблюдайте и схематично зарисуйте в тетрадь спект-

ры гласного и согласного звуков. В чем их основное различие?

б) Пронаблюдайте и схематично зарисуйте в тетрадь спектр

лазерного излучения и спектр излучения Солнца, спектры тор-

мозного и характеристического рентгеновского излучения. В

чем их основное отличие?

252

Методы

анализа

биологических

веществ

6.1

Спектрофотометр и его использование

медико-биологических

исследованиях

Свойство атомов и молекул поглощать свет с определенной

длиной волны, характерной для данного вещества, широко ис-

пользуется в медицине и фармации для качественных и коли-

чественных исследований. Измерение спектров поглощения

позволяет судить о химическом составе вещества и его состоя-

нии

в биологических

структурах.

Для регистрации спектров

поглощения используются приборы спектрофотометры.

Цель

работы:

1. Изучить законы поглощения света как теоретическую ос-

нову спектрофотометрии.

2. Понять принципы применения спектрофотометрии в би-

ологии, медицине и фармации.

3. Выработать умение проводить качественный и количест-

венный анализ физиологически активных веществ методом

абсорбционной спектрофотометрии.

Литература:

Ремизов А.Н.

Медицинская

биологическая

физика.

— М.: Выс-

шая

школа,

1996.

Лекции.

Данное

методическое

пособие.

Подготовка

работе

Изучить по рекомендованным пособиям следующие вопросы:

1. Спектры поглощения белков и нуклеиновых кислот, ха-

рактерные длины волн.

2. Закон Бугера-Ламберта-Бера и физический смысл

всех

входящих в него величин.

253

3. Коэффициент пропускания вещества, оптическая плот-

ность образца. Связь

между

этими величинами. Размерности

величин,

входящих в формулы для коэффициента пропуска-

ния

и оптической плотности.

4. Принципиальная

схема

спектрофотометра, назначение

отдельных блоков.

5. Оптическая

схема

спектрофотометра, ход

лучей

в нем,

способ изменения длины волны, место расположения исследу-

емого образца.

6. Примеры применения абсорбционной спектрофотомет-

рии

в медицине и фармации.

Теоретические

сведения

Спектры поглощения веществ определяются разностью

энергий

между

энергетическими уровнями молекул, составля-

ющими вещество, а также вероятностями перехода

между

ни-

ми.

Разность энергий определяет длину волны, на которой про-

исходит поглощение света, вероятность перехода —

коэффици-

ент поглощения вещества. Для биологически важных молекул

характерны широкие полосы поглощения, обусловленные эле-

ктронными,

колебательными и вращательными уровнями.

При

прохождении через вещество свет поглощается. Рас-

смотрим слой толщины I, в котором в концентрации с находит-

ся

вещество, поглощающее свет. В этом случае, согласно зако-

ну Бугера-Ламберта-Бера, интенсивность I света, прошедшего

через слой, и интенсивность

света, падающего на него, свя-

заны

соотношением:

= 1

е ~

, (1)

где е = 2,72 — основание натуральных логарифмов, к —

коэф-

фициент

пропорциональности, характерный для данного ве-

щества и для данной длины волны. Для практических прило-

жений

закон (1) записывается в виде:

= 1

10 "V, (2)

где величина е^— молярный коэффициент поглощения на дли-

не

волны X. Показатель степени в формуле (2), взятый с обрат-

ным

знаком, называют оптической плотностью:

254

cl.

(3)

Как

видно из формул (1) и (2), измерив отношение интен-

сивностей падающего и прошедшего света и зная величину е^,

можно определить концентрацию с вещества. Метод изучения

веществ по их способности поглощать свет называется абсорб-

ционной

спектрофотометрией.

На

практике измеряют две физические величины:

коэффи-

циент

пропускания т или оптическую плотность D.

Коэффици-

ент пропускания т — это отношение интенсивностей прошед-

шего и падающего света:

х = 1/1

- (4)

Значения

могут

меняться от 0 (весь свет поглощается) до 1

(весь свет проходит), обычно их выражают в процентах.

Оптическую плотность D можно определить из формулы (2)

выразить через коэффициент пропускания:

= lg(I

/I) = lgd/t). (5)

Как

видно из формулы (5), когда коэффициент пропускания т

падает от 100% до 0% , оптическая плотность D соответственно

растет от 0 до °°. Используются следующие единицы измере-

ний:

т и D — безразмерные величины; концентрация поглоща-

ющего вещества [с] = моль/л; [I] = см; [е^]=л/моль • см.

Спектр

поглощения — это зависимость молярного

коэффи-

циента

поглощения е^ от длины волны X. Прибор для измере-

ния

спектров называется спектрофотометром. Молекулярные

группы, поглощающие свет, называют хромофорами.

Стандартный диапазон измерений в абсорбционной спект-

рофотометрии —

180-1100

нм. Он включает в себя три облас-

ти спектра: ближнюю ультрафиолетовую область (УФ) -

180-380

нм; видимую (ВИД) -

380-760

нм и ближнюю инфра-

красную (ИК) -

760-1100

нм.

Нуклеиновые кислоты поглощают только в УФ области

(180-220

240-280

нм). Их хромофорами являются, в основ-

ном,

пуриновые и пиримидиновые основания.

Белки

имеют три типа хромофорных групп: собственно

пептидные группы, боковые группы аминокислотных остат-

ков

и простетические группы. Первые две поглощают в УФ

области и не поглощают в видимой области. Пептидные груп-

255

пы

-CO-NH-

поглощают в районе 190 нм. Боковые группы

трех

ароматических кислот — триптофана, тирозина и фенилала-

нина

— также поглощают на этих длинах волн, причем значи-

тельно сильнее, чем пептидные группы. Кроме

того

они имеют

полосу поглощения в диапазоне

260-280

нм.

Простетические группы (гем в гемоглобине и др. хромофо-

ры) поглощают в УФ и в видимой области. Именно они прида-

ют белку цвет (например, красный цвет гемоглобину).

Спектр поглощение гемоглобина (рис. 1) имеет характерные

максимумы в видимой области (~400 нм и

525-580

нм), а так-

же в ближней ИК-области (900 нм). Спектры поглощения ге-

моглобина, связавшего кислород (оксигемоглобин) — сплош-

ная

линия — и свободного гемоглобина (деоксигемогло-

бин) — пунктирная линия — отличаются. Поэтому с помо-

щью спектров поглощения можно измерить содержание кис-

лорода в крови человека.

500

100

1,0

с;

0,1

0,01

0,005

400

600 800

1000

нм

Рис.

1. Спектры поглощения

гемоглобина,.связавшего

кислород,

(оксигемогло-

бин)

— сплошная линия — и

свободного

гемоглобина

(деоксигемогло-

бин)

— пунктирная линия

Примеры

использования

спектрофотометрии в

биологии,

медицине

фармации.

1. Измерение концентрации белков и нуклеиновых кислот.

2. Оценка кровоснабжения тканей на основе измерений сте-

пени

оксигенации гемоглобина.

256

3. Измерение рН среды с помощью красителей, изменяю-

щих спектр поглощения с изменением рН.

4. Определение концентрации различных лекарственных

средств, имеющих характерные спектры поглощения (рутин,

берберин).

5. Отслеживание динамики размножения микроорганизмов

по

изменению оптической плотности среды, в которой они на-

ходятся.

Принципиальная

схема

спектрофотометра

Спектрофотометр состоит из следующих основных блоков

(рис.2):

источника света (И), монохроматора (М), измеритель-

ной

кюветы (К1) и кюветы сравнения (К2), фотоприемника (Ф)

регистратора (индикатора) (Р).

К1

К2

Рис.

2. Принципиальная схема

спектрофотометра

Источник

(И) испускает свет, монохроматор (М) выделяет

из

него нужный участок спектра. Этот свет далее проходит ли-

бо через измерительную кювету (К1), в которую помещают ис-

следуемый раствор, либо через кювету сравнения (К2), запол-

ненную растворителем (в этом

случае

кювету К2 помещают

вместо кюветы К1). Свет, прошедший через кювету, регистри-

руют

фотоприемником (Ф), и его интенсивность либо записы-

вают каким-либо регистратором, либо отображают на индика-

торе. В качестве индикатора можно использовать стрелочный

прибор.

Две кюветы используют для того, чтобы исключить

паразитные эффекты, связанные с поглощением света в рас-

творителе и его отражениями от стенок кюветы.

Оптическая схема спектрофотометра типа СФ-26, используе-

мого в работе, естественно, существенно сложнее (рис. 3). Для то-

го,

чтобы проводить измерения как в видимой части спектра, так

в ультрафиолетовой, в приборе установлено два источника све-

та (1 и 1'). Выбор нужного источника производится поворотным

257

зеркалом (2). Пучок света от источника поворачивается плоским

зеркалом (3) и через линзу (4) освещает

входную

щель монохро-

матора (5). С помощью специальной ручки можно менять ее ши-

рину и тем самым регулировать интенсивность светового потока,

подаваемого на монохроматор, а затем на кювету. Далее излуче-

ние

отражается от сферического зеркала (6) с фокусным расстоя-

нием

500 мм и падает под

углом

на поверхность поворотной квар-

цевой призмы (7), у которой одна грань сделана зеркальной. По-

скольку у кварца коэффициент преломления зависит от длины

волны, на границе воздух-кварц пучок белого света разлагается

в спектр. Свет с разными длинами волн распространяется по раз-

ными

углами к поверхности кварца (на рисунке для

двух

разных

длин волн показаны сплошной и пунктирной линиями направ-

ления

распространения лучей). Отразившись от зеркальной гра-

Рис.

3. Оптическая схема

спектрофотометра

ни

призмы, лучи повторно проходят через границу раздела

кварц-воздух, в

результате

чего различия в

углах

увеличивают-

ся.

Затем эти пучки света с разной длиной волны повторно отра-

жаются от сферического зеркала (6) и попадают на выходную

щель (8). Через нее из монохроматора может выйти монохрома-

тическое излучение только с одной длиной волны — той самой,

для которой

угол

выхода из призмы обеспечивает попадание

258

эту щель. Чтобы изменить длину волны на

выходе

монохрома-

тора, призму надо повернуть на соответствующий

угол.

После

выхода из монохроматора излучение последовательно

проходит через линзу 9, кювету, линзу 10 и, отразившись от по-

воротного зеркала 11, попадает на один из

двух

фотоэлементов

(12 и 12'). Фотоэлемент (12), обозначенный на приборе буквой

"Ф",

рассчитан на работу в ультрафиолетовой и видимой облас-

тях спектра

(186—650

нм), а фотоэлемент (12'), обозначенный

буквой "К", в красной и инфракрасной

(600—1100

нм).

Электрический сигнал с выходов фотоэлементов через спе-

циальную электронную

схему

(13) подается на измерительный

прибор ИП.

Конструктивно спектрофотометр СФ-26 включает следую-

щие

блоки (рис. 4):

1) монохроматор (MX) с указателем длин волн (УДВ) и изме-

рительным прибором (ИП);

2) осветитель (Осв) с источником излучения;

3) кюветное отделение (К);

4) камеру с фотоэлементами (ФЭ) и электронной схемой;

14 —

тумблер

"сеть" и сигнальная лампа включения сети;

15 — "Н" - сигнальная лампа включения лампы накалива-

ния,

для области

350-1100

нм;

УДВ

Осв ФЭ

1516 1718 19

ип

20 21 22 23

Рис.

Конструкция

спектрофотометра

259

16 — "Д" — сигнальная лампа включения дейтериевой лам-

пы,

для области до 350 нм;

17 — рукоятка установки длин волн (вращения призмы);

18 — переключатель "компенсация";

19 — переключатель "отсчет";

20 — рукоятка раскрытия щели от 0,01 до 2 мм;

21 — рукоятка перемещения каретки с образцами;

22 — рукоятка шторки, перекрывающей фотоэлементы;

23 — рукоятка "нуль" установки нулевого значения на ИП

при

закрытой шторке ФЭ;

24 — переключатель "чувствительность";

25 — переключатель фотоэлементов "Ф"

(186-650

ни) и "К"

(600-1100

нм).

Выполнение

работы

Задание

1. Ознакомиться с порядком включения прибора,

границами

видимого спектра, соответствием цвета и длины

волны.

Подключить прибор к сети 220 В.

Рукоятку переключения источников света, находящуюся

на

задней стенке осветительного блока, перевести в крайнее

правое положение "Н", соответствующее лампе накаливания.

Перевести рукоятку 22 шторки фотоэлементов в положение

"закр."

Включить

тумблер

14 "сеть", после чего загорится сигналь-

ная

лампа "сеть" и сигнальная лампа 15 "Н".

Дать прибору прогреться 10 мин.

В процессе прогрева прибора измерить диапазон длин волн,

видимых глазом человека, по излучению, выходящему из мо-

нохроматора в кюветное отделение.

Внимание:

Перед открыванием крышки кюветного отделения убедить-

ся

в том, что рукоятка 22 шторки, перекрывающей фотоэле-

менты,

находится в положении "закрыто".

Открыть кюветное отделение и поместить в него около вы-

хода

светового пучка из монохроматора лист белой бумаги. От-

крыть максимально щель (рукоятка 20). Вращая рукоятку по-

ворота призмы (17) в сторону увеличения длин волн, устано-

вить на указателе длин волн значение 350 нм.

260