Антонов В.Ф. Практикум по биофизике

Подождите немного. Документ загружается.

Зависимость коэффициента рассеяния от размеров частиц

сложная. Если диаметр рассеивающих частиц значительно

меньше длины волны, то при увеличении размера частиц рас-

сеяние увеличивается. Это наблюдается, например, при набу-

хании малых липосом диаметром

20—40

нм. Однако для час-

тиц,

размеры которых сравнимы с длиной волны, увеличение

размеров приводит к уменьшению рассеяния, а уменьшение

размеров — к увеличению рассеяния.

Для суспензии липосом диаметром

300—400

нм при их на-

бухании наблюдается уменьшение коэффициента рассеяния и

соответственно оптической плотности. Принято считать, что

для липосом такого размера оптическая плотность D обратно

пропорциональна их

объему:

- ,

где К — некоторый коэффициент, не зависящий от объема.

Выполнение

работы

Перед началом выполнения работы повторите методику оп-

ределения оптической плотности при помощи колориметра-

турбидиметра.

Задания 1 и 3 выполняются с фиолетовым светофильтром

(см.

задание 2).

Задание

1. Провести исследование изменения во времени

оптической плотности суспензии липосом, помещенных в ги-

потонический и гипертонический растворы.

Подготовьте таблицу для записи экспериментальных дан-

ных:

мин.

—

липосомы

гипото-

ническом

растворе

липосомы

гиперто-

песком

растворе

А. В гипотоническом растворе.

1) Налейте в измерительную кювету 2 мл (до нижней метки

на

боковой стенке кюветы) суспензии липосом, приготовлен-

ных на водном растворе КС1 концентрацией 20 ммоль/л.

2) Долейте в кювету 6 мл дистиллированной воды (до второй

снизу метки), быстро размешайте стеклянной палочкой и по-

местите в фотоэлектроколориметр.

3) Найдите зависимость оптической плотности от времени и

полученные данные занесите в таблицу. Измерения произво-

дятся до установления постоянной во времени оптической

плотности.

Б.

В гипертоническом растворе.

4) Долейте в ту же кювету с суспензией липосом (разведен-

ной

водой при выполнении задания А) 2 мл (до верхней метки

на

боковой стенке измерительной кюветы) раствора NaCl кон-

центрацией 0,5 моль/л и, быстро размешав стеклянной палоч-

кой,

поместите кювету в фотоэлектроколориметр.

5) Снимите зависимость оптической плотности суспензии от

времени и полученные данные занесите в таблицу. Измерения

производятся до установления постоянной во времени оптиче-

ской

плотности.

6) По полученным данным найдите зависимость относи-

тельного изменения объема ^Х от времени,

где AV = V - V

V — объем липосом в данный момент времени,

— объем липосом при первом измерении, в момент вре-

мени

t = 0 (см. задачу).

Постройте график

гипотонический

гипертонический

растворы

На

основе полученных

результатов

сделайте вывод

прони-

цаемости липосом

для Н

О и для

ионов

, Cl~, Na

Задпча.

Примем,

что

оптическая плотность липосом боль-

ших размеров, соизмеримых

длиной волны

(в

нашем

случае

средний диаметр липосом

~ 350 нм)

обратно пропорционален

объему

липосом:

у ,

где

К —

коэффициент

не

зависящий

от

объема.

Докажите,

что

относительное изменение объема липосом

ДО

где

AD = D — D

, D —

оптическая плотность

данный

мо-

мент времени,

a D

—

значение оптической плотности, полу-

ченной

первом измерении

для t = 0.

Решение задачи.

Если

D = -у , то

lnD

= lnK — lnV и

d(lnD)

d(lnK

— lnV)

откуда

(d(lnK)

= 0).

Приближенно

для

небольших изменений объема

AV и

опти-

ческой плотности

можно принять

AV AD

Относительное увеличение объема липосом равно относи-

тельному уменьшению оптической плотности, а относительное

уменьшение объема липосом равно относительному увеличе-

нию

оптической плотности.

Задание

2. Исследовать зависимость оптической плотности

суспензии липосом от длины волны.

Измерьте оптическую плотность суспензии липосом, остав-

шуюся после выполнения задания 1 при различных свето-

фильтрах. Данные занесите в таблицу:

Светофильтр

X, нм

Постройте график зависимости D =

f(A.):

А,, нм

На

основе данных, полученных при выполнении задания 2,

дайте

обоснование выбора светофильтров в заданиях 1 и 3.

Задание

3. Исследовать зависимость оптической плотности

суспензии липосом от ее концентрации.

Подготовьте таблицу:

1. Отлейте от суспензии, использованной в задании 2, 1/2

объема (5 мл).

2. Долейте в

кювету

до верхней метки изотонический рас-

твор (0,1 моль/л КС1).

3. Измерьте оптическую плотность при концентрации липо-

сом в суспензии п

/2 (с фиолетовым светофильтром).

Аналогично проведите измерения оптической плотности су-

спензии

липосом при концентрациях суспензии п

/4 и п

/8.

Данные занесите в таблицу.

Постройте график зависимости D = f(n).

Толщина кюветы

Длина волны

Задача. Принимая, что оптическая плотность суспензии

прямо

пропорциональна ее концентрации

= A

•

п,

где А — коэффициент, не зависящий от п, докажите, что отно-

сительное изменение концентрации

Дп AD

После

окончания работы тщательно промойте измеритель-

ную

кювету

дистиллированной водой.

1.2.

Изучение активного транспорта ионов

эксперименте

Активный транспорт вещества — перенос их от мест с мень-

шим

значением к местам с большим значением электрохими-

ческого потенциала — играет

важную

роль в жизненных про-

цессах. Активный перенос ионов калия и натрия — необходи-

мое условие для генерации биопотенциалов. Активный транс-

порт протонов играет

важную

роль в биоэнергетических про-

цессах, а ионов калия — в процессах мышечного сокращения.

Цель

работы:

1. Наблюдение активного транспорта ионов натрия через

кожу лягушки.

2. Изучение зависимости активного транспорта ионов на-

трия

от ингибирования обмена веществ.

Литература:

Антонов

В.Ф. и др. Биофизика. — М.:

Владею,

2000.

Подготовка

работе

Изучить по рекомендованному учебнику

следующие

вопро-

сы:

1. Электрохимический потенциал.

2. Пассивный и активный транспорт.

3. Уравнение Теорелла.

4. Закон Фика.

5. Опыт Уссинга.

6. Виды ионных насосов,

их

роль

функционировании

жи-

вого организма.

Теоретические

сведения

Активный

транспорт веществ. Активный транспорт —

это перенос вещества

из

мест

меньшим значением электро-

химического потенциала

места

с его

большим значением

(рис.

1).

направление активного транспорта

Рис.

Схема активного транспорта

Активный транспорт

мембране сопровождается ростом

энергии

Гиббса,

он не

может идти самопроизвольно,

только

сопряжении

процессом гидролиза аденозинтрифосфорной

кислоты (АТФ),

то

есть

за

счет затраты энергии, запасенной

макроэргических связях

АТФ.

Опыт

Уссинга.

Существование активного транспорта

ве-

ществ через биологические мембраны впервые было доказано

опытах Уссинга

(1949 г.) на

примере переноса ионов натрия

че-

рез кожу лягушки (рис.

2).

Экспериментальная

камера Уссинга, заполненная нормаль-

ным

раствором Рингера, была разделена

на две

части свеже-

изолированной

кожей лягушки.

На рис. 2

слева

—

наружная

мукозная поверхность кожи, справа

—

внутренняя серозная.

Наблюдались потоки ионов натрия через кожу лягушки: слева

направо

от

наружной

внутренней поверхности

справа нале-

во

от

внутренней

наружной поверхности.

Из

уравнения Теорелла, описывающего пассивный транс-

порт,

следует

уравнение Уссинга-Теорелла

для

отношения

этих потоков

случае

пассивного транспорта:

m,BH

ZFAm

На

коже лягушки, разделяющей раствор Рингера, возника-

ет разность потенциалов (ф

вн

— Фнар) — внутренняя сторона

кожи

имеет положительный потенциал по отношению к на-

ружной). В установке Уссинга (рис. 2) имелся блок компенса-

ции

напряжения, с помощью которого устанавливалась раз-

ность потенциалов на коже лягушки, равная нулю, что кон-

тролировалось вольтметром.

камера

Рис.

2. Схема опытов Уссинга (А — амперметр, V — вольтметр, Б — батарейка,

П — потенциометр)

Кроме

того, поддерживалась одинаковая концентрация ио-

нов

с наружной и внутренней стороны С

на

р = С

вн

При

этих условиях, если бы перенос натрия через кожу ля-

гушки определялся только пассивным транспортом, то соглас-

но

уравнению Уссинга-Теорелла потоки j

m BH

и j

m на

„ были

бы равны

друг

другу:

Суммарный поток через мембрану был бы равен нулю.

Однако обнаружено с помощью амперметра, что в условиях

опыта (отсутствие градиентов электрического потенциала и

концентрации)

через кожу лягушки

течет

электрический ток

следовательно происходит односторонний перенос заряжен-

ных частиц. Установлено, что ток через кожу

течет

от внешней

среды к внутренней.

Методом меченых атомов было показано, что поток натрия

внутрь больше потока

наружу

m вн

> j

m нар

- Для этого в ле-

вый

раствор экспериментальной камеры были включены ра-

диоактивные изотопы Na^2, а в правый — Na^. Изотоп Na^2

распадается с излучением жестких у -квантов. Распад Na

со-

провождается мягким (3-излучением. Регистрация у и (3-излу-

чения

показала, что поток Na

больше потока Na

Эти

экспериментальные данные неопровержимо свидетель-

ствовали о том, что перенос ионов натрия через кожу лягушки

не

подчиняется уравнению пассивного транспорта. Следова-

тельно, имеет место активный перенос.

Согласно современным представлениям, в биологических

мембранах имеются ионные насосы, работающие за

счет

энер-

гии

гидролиза АТФ — специальные системы интегральных

белков (транспортные АТФ-азы).

В настоящее время известны три типа электрогенных ион-

ных насосов, осуществляющих активный перенос ионов через

мембрану (рис. 3).

3Na

Рис.

Виды

ионных

насосов:

а — К

-Ыа

-АТФ-аза в

цитоплазматических

мемб-

ранах

(К

-Ыа

-насос);

б —Са

-АТФ-аза

(Са

-насос);

в — Н

-АТФ-аза

энергосопрягающих

мембранах

митохондрий,

хлоропластов

(Н

-насос,

или

протонная

помпа)

Перенос

ионов транспортными АТФ-азами происходит

вследствие сопряжения процессов переноса с химическими

реакциями

за

счет

энергии метаболизма клеток.

При

работе

-Na

-ATO-a3bi

за

счет

энергии, освобождаю-

щейся

при гидролизе каждой молекулы АТФ, в клетку перено-

сится

два иона калия и одновременно из клетки выкачиваются

три иона натрия. Таким образом, создается повышенная, по

сравнению с межклеточной средой концентрация в клетке ио-

нов

калия и пониженная — натрия, что имеет огромное

физи-

ологическое значение.

В Са

-АТФ-азе за счет энергии гидролиза АТФ переносят-

ся

два иона кальция, а в Н -помпе — два протона.

Выполнение

работы

Опыты проводятся на коже лягушки. Кроме этого опыты

могут

проводиться на мочевом пузыре лягушки, слизистой же-

лудка и кишечника.

Необходимые приборы и принадлежности: милливольт-

метр типа рН-340 (или ЛПУ-01, или ЛПМ-60), микроампер-

метр типа М-24 (или М-95), батарея БАС-Г-45, потенциометр,

четырехклеммные ключи, 2 каломельных и 2 хлорсеребря-

ных электрода, микрокомпрессор, камера Уссинга, препаро-

вальный инструмент, раствор Рингера для холоднокровных,

ванночка

для препаровки, стаканчики, глазные пипетки и

крупные лягушки.

Задание

1. Монтаж схемы.

На

первом этапе выполнения работы собирается электриче-

ская

схема установки в соответствии с рис. 4.

Батарея

должна подключаться в цепь тока с помощью тумбле-

ра. Нормальное положение тумблера — "выключено". рН-метр

включается по

схеме

работы вольтметра со шкалой ±100 мВ.

Шкалу

микроамперметра нужно отградуировать на 500 микроам-

пер.

Каломельные электроды должны быть свежезаполненными,

а кончики их находиться в непосредственной близости от кожи.

Пара

электродов должна быть симметричной, а разность по-

тенциалов

между

ними не превышать 2-3 мВ. Токовые элект-

роды представляют собой хлорированные серебряные прово-

лочки.

Для того, чтобы избежать значительной поляризации

этих электродов, их необходимо перед опытом хлорировать.

Задание

2. Измерение потенциала кожи.

Лягушку обездвиживают и осторожно с брюшной поверхно-

сти вырезают лоскут кожи. Лоскут должен иметь

круглую

батарея

микроамперметр

МКА

потенциометр

ключ

кожа

лягушки

милливольтметр

ключ

Рис.

4.Электрическая схема установки для

измерения

тока

короткого

замыка-

ния

коже

лягушки

форму и быть достаточным,чтобы полностью закрыть отвер-

стие

между

двумя отделениями камеры. После препаровки ло-

скут

на несколько минут помещают в раствор Рингера (для хо-

лоднокровных).

Затем приступают к монтажу камеры. Кожу помещают

между

двумя резиновыми прокладками и вставляют в зазор,

находящийся в середине камеры. После установления пре-

парата кожи, поджимными винтами сдвигают обе части ка-

меры так, чтобы кожа была плотно фиксирована в централь-

ной

части камеры. Через отверстие в камере заливают рас-

твор Рингера, причем необходимо заливать раствор неболь-

шими

порциями сразу в обе части камеры так, чтобы кожа

не

выгибалась в

результате

неравномерного заполнения ка-

меры. Необходимо следить за отсутствием пузырей

воздуха

камере, особенно в области электродов для отведения потен-

циала.

Если пузыри обнаружатся, их

следует

удалить

путем плав-

ного покачивания камеры.

После окончания монтажа камеры и заполнения ее вклю-

чают

милливольтметр и производят измерение потенциала