Антонов В.Ф. Практикум по биофизике

Подождите немного. Документ загружается.

Поворачивая

медленно рукоятку 17 в сторону увеличения

длин волн, зафиксировать момент, когда появится фиолетовое

пятно

на бумаге, записать соответствующее значение длины

волны с указателя длин волн. Затем увеличивая далее длину

волны,

отметить длины волн, соответствующие

голубому,

зе-

леному, оранжевому и красному излучению. При дальнейшем

вращении

зафиксировать момент, когда изображение пятна

пропадет — это граница инфракрасного диапазона. Составить

таблицу длин волн, соответствующих границам восприятия

глаза человека, а также указанным выше цветам.

Задание

2. Провести метрологическую поверку спектрофо-

тометра, используя стандартные светофильтры.

Из

комплекта спектрофотометра СФ-26 укрепить в держа-

теле

светофильтры КУ-1, НС8-1 и НС8-4 и поместить их на ка-

ретку в кюветное отделение.

Фильтр КУ-1 пропускает излучение от ультрафиолетового

до инфракрасного. Фильтры из стекла НС8 пропускают излу-

чение от видимого до инфракрасного, однако толщина фильт-

ра НС8-1 составляет 1 мм, а фильтра НС8-4—4 мм, поэтому по-

следний пропускает меньше.

Установить переключатель источников света в положение

"Н,

переключатель 25 фотоэлементов в положение "К", штор-

ку 22 фотоэлементов в положение "закр". Включить

тумблер

14 "сеть".

Рукояткой

17 установить длину волны 600 нм. В соответст-

вие с конструкцией прибора требуемое значение длины волны

устанавливается при вращении рукоятки 17 в сторону увели-

чения

длин волн. Если требуемое значение длин волн пройде-

но,

то необходимо вернуться на несколько делений назад и сно-

ва подвести указатель к требуемому делению со стороны мень-

ших длин волн.

Переключатель 18 "компенсация" поставить в положение

"0",

переключатель 19 "отсчет" в положение "xl", переключа-

тель 24 "чувствительность" в положение "1".

Рукояткой

23 "нуль" установить значение "0"% на ИП.

Внимание!

Рукоятка 23 "нуль" — потенциометр с двойной ре-

гулировкой (грубой и тонкой), им

следует

пользоваться с осто-

рожностью, не прилагая усилий.

261

Рукояткой

перемещения каретки 21 в световой поток ввес-

ти свободное от светофильтра окно держателя,

служащее

кон-

тролем.

Открыть шторку 22.

Меняя

ширину щели рукояткой 20, установить стрелку из-

мерительного прибора на значение

"100%".

Внимание:

отсчет

по измерительному прибору

следует

про-

водить при визуальном слиянии стрелки прибора и ее зеркаль-

ного отражения.

Если

световой поток недостаточен для установления 100% -го

пропускания,

то закрыть шторку 22, переключатель "чувстви-

тельность" 24 перевести в положение "2", снова установить ну-

левое значение на шкале ИП рукояткой 23 "нуль", открыть

шторку 22. Меняя ширину щели рукояткой 20, установить

стрелку ИП на значение 100%. Процесс повышения чувстви-

тельности

следует

продолжать, переводя рукоятку 24 последо-

вательно в положения "3", "4", с одновременной регулировкой

нуля вплоть до установления 100% пропускания.

Перемещая

каретку с фильтрами рукояткой 21 и фиксируя

ее последовательно с положениях 2, 3, 4, ввести в световой по-

ток

последовательно светофильтры КУ-1, НС8-1 и НС8-4. Для

каждого светофильтра три раза измерить значения

коэффици-

ента пропускания и занести в таблицу:

Светофильтр

КУ-1

НС8-1

НС8-4

Эталон

Измерения

Эталон

Измерения

Эталон

Измерения

Коэффициент

пропускания,

X = 600 нм

93,7

46,4

7,6

X = 640 нм

94,3

46,5

7,9

Закрыть

шторку 22.

Повторить измерения на длине волны 640 нм.

Сравнить

полученные значения т с эталонными и оценить

точностные характеристики спектрофометра.

Задание

3. Измерить спектр поглощения красителя эозина в

видимой части спектра и ароматической аминокислоты в уль-

трафиолетовой области.

262

По

описанной выше методике измерить спектр поглощения

эозина

в видимой части спектра

(450-650

нм) с шагом 20 нм.

Результаты занести в таблицу:

Номер

измерения

к,

нм

т,

D, отн. ед.

Построить в тетради спектр поглощения эозина в координа-

тах: оптическая плотность D (отн. ед.) — длина волны (нм).

По

описанной выше методике измерить спектр поглощения

ароматической аминокислоты в ультрафиолетовой области

спектра

(240-310

нм) с шагом 10 нм. Для этого установить пе-

реключатель источников света в положение "Д", переключа-

тель 25 фотоэлементов в положение "Ф". Результаты занести в

таблицу:

Номер

измерения

к,

нм

т,

D, отн. ед.

Построить в тетради спектр поглощения ароматической

кислоты в координатах: оптическая плотность D (отн. ед.) —

длина волны (нм).

Провести анализ исследованного вещества, то есть опреде-

лить исследованную ароматическую аминокислоту (качест-

венный

анализ) и ее концентрацию (количественный анализ),

используя спектральные свойства ароматических кислот:

Аминокислоты

Фенилаланин

Тирозин

Триптофан

Молярный

коэффициент

поглощения

е^, л/моль-см

180

1380

5600

максимума,

нм

257

275

279,5

При

определении молярной концентрации с вещества по

формуле (3), используя измеренную величину оптической

плотности D,

учесть,

что толщина кюветы составляет 1 см.

263

Задание

4. Решить задачи.

Задача 1. Оптическая плотность раствора, содержащего ве-

щество с молярной массой М=423 в концентрации с=

32 мкг/мл, составляет 0,27 при длине волны ^.=540 нм в од-

носантиметровой кювете. Найти молярную концентрацию

с[моль/л] и коэффициент молярного поглощения е^ для дан-

ного вещества.

Указание: при переводе концентраций из мкг/мл в моль/л

воспользоваться соотношением: с[моль/л] = 10~

•

с[мкг/мл]/М.

Для расчета величины е^ использовать формулу (3).

Задача 2. Оптическая плотность раствора, содержащего

вещество с молярной массой М=384 в концентрации с=

28 мкг/мл, составляет 0,27 при длине волны "к = 540 нм в

двухсантиметровой кювете. Найти молярную концентрацию

коэффициент молярного поглощения е^ для данного веще-

ства.

Задача 3. Имеется раствор аминокислоты триптофана, оп-

тическая плотность которого при длине волны 280 нм состав-

ляет 0,5, и раствор тирозина, оптическая плотность которого

для той же длины волны - 0,36. Какова оптическая плотность

раствора той же толщины, если смешали по 1 мл каждого рас-

твора?

Считать, что молекулы этих веществ не взаимодейству-

ют

друг

другом.

Указание: при смешивании концентрация каждого веще-

ства уменьшается в 2 раза, а оптические плотности складыва-

ются.

6.2

Определение

концентрации

веществ

в растворе с помощью

фотоэлектроколориметра

Свойство атомов и молекул поглощать

свет

определенных

длин волн, характерных для данного вещества, широко ис-

пользуется в медицине и фармации для качественных и коли-

чественных исследований. Измерение спектров поглощения

позволяет

судить

о концентрации различных химических ве-

ществ. Для измерения концентрации веществ по спектрам по-

глощения их растворов используют прибор фотоэлектроколо-

риметр.

264

Цель

работы:

1. Изучить законы поглощения света как теоретическую ос-

нову спектрофотометрии.

2. Понимать принципы применения фотоколориметрии в

биологии, медицине и фармации.

3. Выработать умение измерять концентрации веществ с по-

мощью фотоэлектроколориметра.

Литература:

Ремизов

А.Н. Медицинская и биологическая физика. Изд. Вто-

рое. — М.: "Высшая школа", 1996.

2. Лекции.

3. Данное методическое пособие.

Подготовка к работе

Изучить по рекомендованным пособиям следующие во-

просы:

1. Спектр поглощения вещества.

2. Вывод закона Бугера. Закон Бугера-Ламберта-Бера. Фи-

зический смысл

всех

входящих в него величин.

3. Коэффициент пропускания вещества, оптическая плот-

ность образца. Связь

между

этими величинами. Размерности

величин, входящих в формулы для коэффициента пропуска-

ния

и оптической плотности.

4. Принципиальная схема фотоэлектроколориметра, назна-

чение отдельных блоков.

5. Оптическая схема фотоэлектроколориметра, ход лучей в

нем,

способ изменения длины волны, место расположения ис-

следуемого образца.

6. Примеры применения абсорбционной фотоэлектроколо-

риметрии в медицине и фармации.

7. Ход работы и способ обработки результатов.

Теоретические сведения

Спектры поглощения веществ определяются разностью

энергий

между

энергетическими уровнями молекул, составля-

ющими вещество, а также вероятностями перехода

между

ни-

265

ми.

Разность энергий определяет длину волны, на которой

происходит поглощение света, вероятность

перехода

—

коэф-

фициент

поглощения вещества. Для веществ в растворе харак-

терны широкие полосы поглощения, обусловленные электрон-

ными,

колебательными и вращательными уровнями.

При

прохождении через вещество

свет

поглощается. Рас-

смотрим слой толщины /, в котором в концентрации с находит-

ся

вещество, поглощающее свет. В этом

случае,

согласно зако-

ну Бугера-Ламберта-Бера, интенсивность I света, прошедшего

через слой, и интенсивность 1

света, падающего на него, свя-

заны соотношением:

= I

, (1)

где е = 2,72 — основание натуральных логарифмов, к —

коэф-

фициент

пропорциональности, характерный для данного ве-

щества и для данной длины волны. Для практических прило-

жений закон (1) записывается в виде:

1(Г

(2)

где величина е^ — молярный коэффициент поглощения на

длине волны X. Показатель степени в формуле (2), взятый с об-

ратным знаком, называют оптической плотностью:

= е

с1. (3)

Как

видно из формул (1) и (2), измерив отношение интен-

сивностей падающего и прошедшего света и зная величину е^,

можно определить концентрацию с вещества.

На

практике измеряют две физические величины: оптичес-

кую плотность D и коэффициент пропускания х. Коэффициент

пропускания т — это отношение интенсивности света, прошед-

шего через образец, к интенсивности падающего света:

т = I / 1

. (4)

Значения

могут

меняться от 0 (весь

свет

поглощается) до 1

(весь

свет

проходит), обычно их выражают в процентах.

Как

видно из формулы (2), оптическая плотность D — это

десятичный логарифм отношения падающего и прошедшего

света. Она связана с коэффициентом пропускания:

= lg

/I)

= lg (1/x). (5)

266

Как

видно из формулы (5), когда коэффициент пропускания

т падает от 100% до 0%, оптическая плотность D соответствен-

но

растет от 0 до оо. Используются следующие единицы изме-

рений

х и D — безразмерные величины; концентрация погло-

щающего вещества [с] = моль/л; [/] = см; [е^] = л/моль • см.

Спектром

поглощения называют зависимость молярного

коэффициента

поглощения е^ от длины волны X. Спектры по-

глощения

можно измерять различными приборами. В види-

мом диапазоне

(380-760

нм) спектр поглощения определяет

цвет вещества, поэтому прибор для измерения спектров назы-

вается колориметром (от латинского

color

— цвет). Современ-

ные

колориметры позволяют производить измерения в более

широком

спектральном диапазоне от ультрафиолета до ближ-

него инфракрасного

(315-980

нм).

Примеры

применения

фотоэлектроколориметра в

биоло

гии,

медицине

фармации:

1. Измерение концентрации окрашенных веществ, напри-

мер,

некоторых витаминов и лекарств, в растворе.

2. Определение рН среды по цвету добавленных в раствор

рН-индикаторов.

3. Определение активности ферментов по интенсивности ок-

рашивания

раствора после добавления соответствующих хи-

мических реагентов, дающих окрашенные реакции с продук-

тами ферментативной реакция (например, оценка активности

АТФ-аз по скорости образования неорганического фосфата).

4. Оценка скорости роста микроорганизмов по увеличению

оптической плотности культуральной жидкости вследствие

рассеяния

света на микроорганизмах.

Принципиальная

оптическая

схема

фотоэлектроколори

метра.

Термин

"фотоэлектроколориметр" означает, что это прибор

для измерения цвета ("колориметр"), в котором оптическое из-

лучение ("фото") преобразуется в электрический сигнал ("эле-

ктро").

Фотоэлектроколориметр состоит из следующих основ-

ных блоков (рис. 1): источника света (И), светофильтров (СФ),

двух

кювет — К1 — кюветы сравнения, заполненной раствори-

телем, и К2 — кюветы для исследуемого раствора, полупроз-

267

СФ

К1

К2

(Ф2)

Рис.

1. Принципиальная

оптическая

схема

фотоэлектроколориметра

рачного зеркала (3), расщепляющего прошедший пучок света

на

два фотоэлемента (Ф1) и (Ф2).

Источник

света создает излучение в широком диапазоне

длин волн, светофильтр выделяет из него нужный участок спе-

ктра. Этот свет далее проходит либо через кювету (К2), в кото-

рую помещают исследуемый раствор, либо через кювету срав-

нения

(К1), в которой находится растворитель. Пучок света,

прошедший через кювету, расщепляется полупрозрачным зер-

калом на два пучка, интенсивности которых регистрируются

фотоприемниками

Ф1 и Ф2. Два фотоприемника используют-

ся

для измерений в разных участках спектра.

Оптическая схема фотоэлектроколориметра типа КФК-

2МП,

используемого в работе, естественно, существенно слож-

нее.

Кроме того в этом приборе применяется микропроцессор-

ная

система для получения и обработки данных. Фотоэлектро-

колориметр (рис.2) конструктивно состоит из колориметриче-

ского блока (1) и вычислительного блока (2), в котором разме-

щена

микропроцессорная система

(МПС),

представляющую

собой микроЭВМ.

В колориметрическом блоке (1) размещен источник света и

11 стеклянных светофильтров, вмонтированных в диск. Нуж-

ный

светофильтр вводится в световой пучок поворотом диска

(ручка (3)). Рабочее положение каждого светофильтра

фикси-

руется. Длина волны, которую пропускает данный фильтр, от-

считывается на ручке (3) против белой риски, нанесенной на

корпус прибора.

В кюветном отделении (4) в кюветодержателе, устанавлива-

емом на подвижный столик, располагают кюветы. Кюветодер-

жатель устанавливают так, чтобы две маленькие пружины на-

ходились со стороны источника света.

Ввод

в световой пучок

той или иной кюветы осуществляют перемещением ручки (5)

влево или вправо до упора (положение "1" или "2"). В положе-

нии

"1" в световой пучок вводится кювета с растворителем,

268

5 6

Рис.

2. Блок-схема

колориметра

КФК-2МП.

положении "2" — с исследуемым раствором. Кюветное отде-

ление закрывается крышкой (6).

При

открытой крышке специальная шторка перекрывает

световой пучок, чтобы не засвечивать фотоприемники. Дело в

том, что фотоприемники

даже

в отсутствии освещения

дают

на

выходе

так называемый "темновой" сигнал, свойства которого

меняются после изменения освещенности и искажают резуль-

таты измерений. Поэтому при открытом кюветном отделении

световой пучок перекрывают, а после закрытия крышки необ-

ходимо подождать некоторое время, прежде чем производить

измерения.

Переключение фотоприемников для регистрации в фиоле-

товой или красной областях спектра осуществляют с помощью

ручки (7).

В вычислительный блок 2 (рис. 2)

входит

микропроцессор-

ная

система

(МПС).

На

передней панели МПС расположены клавиатура, цифро-

вое табло и два сигнальных светодиода. Клавиатура состоит из

24 клавиш. Клавиша "пуск" предназначена для запуска мик-

ропроцессорной

системы. Клавиши "Ь" и "с" предназначены

для вызова на цифровое табло из памяти МПС значений соот-

ветствующих коэффициентов для их контроля или ввода но-

вых значений. Клавиша "сбр" (сброс) предназначена для сти-

269

рания

значения вызванного коэффициента (в

случае

необходи-

мости задания нового значения).

Клавиши

"О", "1-9", "-", "," предназначены для набора на ци-

фровом табло МПС нового значения коэффициента "Ь" или "с".

Клавиша "УТВ" (утверждение) предназначена для записи в

память МПС нового значения коэффициента, набранного на

цифровом табло.

Клавиши

"К(1)'\ "т(2)'\ "D(5)'\ "C(4)" предназначены для

выполнения калибровки прибора, то есть установки

100%-ого

пропускания, измерений коэффициента пропускания, оптиче-

ской

плотности исследуемого вещества, концентрации вещест-

ва в растворе.

Клавиша "А(3)" предназначена для измерения активности.

Клавиша "Ц/Р" предназначена для перевода МПС в один из

двух

режимов выполнения измерений: режим одиночных

(разовых "Р") измерений или режим циклических ("Ц") изме-

рений.

В режиме одиночных измерений измерения выполняют-

ся

один раз при нажатии соответствующей клавиши: в режиме

циклических измерений первое измерение производится при

нажатии соответствующей клавиши и затем они повторяются

циклически с периодом 5 с до тех пор пока МПС не

будет

переве-

дена в режим выполнения одиночных измерений. Перевод МПС

из

режима циклических измерений в режим одиночных измере-

ний

и обратно происходит при нажатии клавиши

"Ц/Р".

Сиг-

нальный светодиод "Ц" и сигнальный светодиод "Р"

служат

для

указания режима измерения. В режиме одиночных измерений

горит светодиод "Р", в циклическом — горит светодиод "Ц".

Цифровое табло состоит из б-ти индикаторов. Первый инди-

катор служит для отображения одного из символов "1", "2",

"3",

"4", "5", "0", появляющегося при нажатии одной из кла-

виш "К (1)", "х(2)", "А (3)", "С (4)", "D (5)" соответственно и

при

проверочном измерении "нулевого отсчета" "Ш (0)", то

есть темнового отсчета при перекрытом световом потоке. Ин-

дикаторы 2-6

служат

для вывода результатов измерений и

значений параметров "с" и "Ь".

Принцип

действия колориметра основан на поочередном

измерении светового потока Fg, прошедшего через раствори-

тель или контрольный раствор, по отношению к которому про-

изводится измерение и потока F, прошедшего через исследуе-

мую

среду.

270