Адо А.Д. Патологическая физиология

Подождите немного. Документ загружается.

Наконец, окисление тиоловых групп мембранных белков приводит к

появлению дефектов в липидном слое мембран клеток и митохондрий.

Под действием разности электрических потенциалов на мембранах

через такие дефекты в клетки входят ионы натрия, а в митохондрий — ионы

калия. В результате увеличивается осмотическое давление внутри

клеток и митохондрий, что способствует еще большему повреждению

мембран.

Во-вторых, результат перекисного окисления липидов связан с тем,

что продукты пероксидации обладают способностью непосредственно

увеличивать

ионную

проницаемость липидного бислоя. Показано, что

продукты перекисного окисления липидов делают липидную фазу мемб-

ран проницаемой для ионов водорода (рис. 2.8, 2) и кальция (рис. 2.8, 3).

Это приводит к тому, что в митохондриях окисление и фосфорилирова-

ние разобщаются, а клетка оказывается в условиях энергетического го-

лода (т.е. недостатка АТФ). Одновременно в цитоплазму выходят ионы

кальция, которые повреждают клеточные структуры.

Третьий (и быть может, самый важный) результат пероксидации —

это уменьшение стабильности липидного

слоя,

что может вызвать элект-

рический пробой мембраны собственным мембранным потенциалом, т.е.

под действием разности электрических потенциалов, существующей на

мембранах живой клетки. Электрический пробой приводит к полной по-

тере мембраной ее барьерных функций (рис. 2.8, 4).

Клеточные системы антирадикальной защиты. В нормальных

условиях процесс перекисного окисления липидов находится под стро-

гим контролем ферментативных и неферментативных систем клетки, от-

чего скорость его невелика. Принято делить химические соединения и

физические воздействия, влияющие на скорость перекисного окисления

липидов, на прооксиданты (усиливают процессы перекисного окисления)

и антиоксиданты (тормозят перекисное окисление липидов). К проокси-

дантам в живой клетке относятся высокие концентрации кислорода (на-

пример, при длительной гипербарической оксигенации больного), фер-

ментные системы, генерирующие супероксидные радикалы (например,

ксантиноксидаза, ферменты плазматической мембраны фагоцитов и др.),

ионы двухвалентного железа.

Хотя сам процесс перекисного окисления развивается в виде цеп-

ных реакций в липидной фазе мембран и липопротеинов, начальные (а

возможно, и промежуточные) стадии этой сложной системы реакций про-

текают в водной фазе. Часть защитных систем клетки также локализуется

в липидной, а часть — в водной фазах. В зависимости от этого можно го-

ворить о водорастворимых и гидрофобных антиоксидантах.

Антиоксиданты водной фазы. Основные реакции в водной фазе,

предшествующие цепному окислению, и роль антиоксидантов в ограни-

чении скорости этих процессов можно представить в виде схемы:

Непосредственными предшественниками гидроксильного радика-

ла, инициирующего цепное окисление липидов, служат ионы двухвалент-

ного железа и перекись водорода (или образующийся из нее гипохлорит).

По этой причине образование радикала гидроксила и пероксидация ли-

пидов тормозятся веществами, снижающими концентрацию одного из

этих двух соединений. К ним относятся следующие вещества:

— фермент супероксиддисмутаза — снижает концентрацию суперок-

сидных радикалов и тем самым препятствует восстановлению ими

ионов трехвалентного железа до двухвалентного. В клетке ионы же-

леза хранятся в трехвалентном состоянии в специальных депо, об-

разованных субъединицами белка — ферритина;

— ферменты

каталаза

и глутатионпероксидаза — удаляют перекись во-

дорода. Эффективность работы глутатионпероксидазы зависит от

концентрации свободного глутатиона, при снижении которой может

возрастать концентрация цитотоксических гидроксильных ради-

калов;

— регенерация восстановленного глутатиона (СБН) из окисленного

(СББС) осуществляется за счет НАДФН; этот процесс катализиру-

ется ферментом

глутатионредуктазой.

Недостаток глутатиона в

клет-

ках, например в эритроцитах, который может быть обусловлен дей-

ствием токсичных веществ, например ионов тяжелых металлов или

наследственным недостатком глутатионредуктазы, приводит к ак-

тивации перекисного окисления; это, в частности, наблюдается при

некоторых видах гемолитических анемий;

— соединения, связывающие ионы железа (комплексоны). Следует,

однако, добавить, что в водной фазе некоторые комплексы ионов

железа вступают в реакции с супероксидным радикалом и перекисью

водорода наряду со свободными ионами железа.

Антиоксиданты, тормозящие развитие цепных реакций в ли-

пидной фазе. Основные реакции в липидной фазе биологических мемб-

ран и липопротеинов крови, а также роль антиоксидантов в ограничении

скорости этих процессов можно продемонстрировать с помощью схемы.

Цепные реакции «ведут» свободные радикалы липидов (L* и LOO),

разветвление цепей происходит при взаимодействии продукта перокси-

дации — гидроперекиси липидов (LOOH) с ионами Fe

. Все соединения,

снижающие концентрацию перечисленных веществ, выполняют функцию

антиоксидантов. К ним относятся:

— ферменты

фосфолипаза

и глутатионпероксидаза, разрушающие

гидроперекиси липидов, предотвращая разветвление цепей окис-

ления липидов в мембранах. При этом действие фосфолипазы зак-

лючается в отщеплении от фосфолипидов окисленной жирной кис-

лоты, содержащей гидроперекисную группу (LOOH), а действие

глутатионпероксидазы сводится к восстановлению этой группы до

спиртовой с одновременным окислением глутатиона (GSH) до ди-

сульфида (GSSG):

LOOH + 2GSH -» LOH + GSSG + Н

— ловушки радикалов, которые называют иногда «липидными анти-

оксидантами». По своей химической природе липидные антиок-

сиданты — это производные фенола. К ним относится сс-токоферол

(витамин Е), убихинон (кофермент Q), тироксин, эстрогены и синте-

тические соединения,например ионол;

— соединения, связывающие железо. Большинство из них, включая

такие природные соединения, как дипептид карнозин, не просто

связывают железо, но, главное, не дают ему возможности приник-

нуть в липидную фазу мембран, поскольку образующиеся комплек-

сы в силу своей полярности не проникают в гидрофобную зону.

Для детоксикации двухвалентного железа в организме существует,

по-видимому, целая система окисления и связывания ионов железа. В

плазме крови эта система представлена ферментом церрулоплазмином

(феррооксидазой), который окисляет Ре

до Ре

кислородом без обра-

зования свободных радикалов, и белком трансферрином, который

свя-

зывает и переносит в кровяном русле ионы трехвалентного железа, а за-

тем захватывается клетками. В клетках железо может восстанавливаться

аскорбиновой кислотой и другими восстановителями, но затем окисля-

ется и депонируется в окисленной форме внутри ферментного белкового

комплекса ферритина.

2.1.4. Другие причины нарушения барьерных свойств

липидного слоя мембран

Роль эндогенных фосфолипаз в нарушении барьерной функ-

ции мембран. Вторая важная причина, приводящая к нарушению целос-

ти липидного слоя мембран и потере ею барьерных свойств, — это гид-

ролиз мембранных фосфолипидов ферментами — фосфолипазами типа

А. Фосфолипазы А гидролизуют сложноэфирные связи в молекуле фос-

фолипида, при этом образуется свободная жирная кислота (СЖК) и ли-

зофосфолипид (ЛФ), например лизофосфатидилхолин при гидролизе

фосфатидилхолина (лецитина):

и Н

— углеводородные цепи жирных кислот. Фосфолипазы при-

сутствуют в пищеварительном соке поджелудочной железы, а также прак-

тически во всех мембранных структурах клетки, включая митохондрии,

лизосомы, плазматические мембраны. В мембранах фосфолипазы обыч-

но находятся в малоактивном состоянии по двум причинам. Во-первых,

фосфолипазы плохо гидролизуют фосфолипиды, входящие в состав не-

поврежденного липидного бислоя. Во-вторых, фосфолипазы активиру-

ются ионами кальция и ингибируются ионами магния, а в цитоплазме мало

кальция (10

моль/л и менее) и относительно много ионов магния (около

-3

моль/л).

Увеличение проницаемости плазматической мембраны при

повреждении клетки или при открывании кальциевых кана-

лов (т.е. возбуждении клетки), как и выключение насосов за

счет недостатка энергии в клетку (т.е. АТФ) приводят к уве-

личению концентрации кальция в цитоплазме.

Некоторое повышение его концентрации (до 10~

моль/л) следует

считать нормальным механизмом регуляции внутриклеточных процессов,

так как кальций является вторичным посредником при действии многих

медиаторов, гормонов и при электрическом возбуждении ряда клеток.

Умеренная активация фосфолипазы А

— также нормальное физиологи-

ческое явление, поскольку служит первым звеном в цепи образования

физиологически активных производных арахидоновой кислоты.

Чрезмерное увеличение концентрации ионов кальция в ци-

топлазме и активация фосфолипазы приводят к потере мем-

бранами их барьерных свойств и нарушению функциониро-

вания клеточных органелл и клетки в целом.

Как уже говорилось, повреждающее действие мембранных фосфо-

липаз играет важную роль в повреждении клеток при недостатке кисло-

рода (гипоксии).

Механическое (осмотическое) растяжение мембран и адсорб-

ция белков. Важную роль во вторичном повреждении мембран играют

процессы их механического растяжения в результате нарушения осмоти-

ческого равновесия в клетках. Если поместить эритроциты в гипотони-

ческий раствор, то вода будет входить в клетки, они примут сферическую

форму, а затем произойдет гемолиз. Митохондрии также набухают в

гипотонических средах, но механический разрыв происходит только у

внешней мембраны; внутренняя остается целой, но теряет способность

задерживать небольшие молекулы и ионы. В результате митохондрии ут-

рачивают способность к окислительному фосфорилированию.

Сходные явления наблюдаются в целых клетках и тканях при пато-

логии. Так, в результате активации фосфолипазы мембран митохондрии

при гипоксии они становятся проницаемыми для ионов К

. Если в этих

условиях восстановить оксигенацию ткани, то на мембранах митохонд-

рии восстановится мембранный потенциал (со знаком «минус» внутри) и

митохондрии будут «насасывать» ионы К

, вслед за которыми в матрикс

входит фосфат. Осмотическая концентрация ионов внутри митохондрии

возрастает, и органеллы набухают. Это приводит к растяжению мембран

и их дальнейшему повреждению.

Механизм нарушения барьерных функций мембран при адсорбции

налипидном бислое полиэлектролитов, в частности белков, чужеродных

для клетки, пока изучен недостаточно. В молельных опытах показано, что

в некоторых случаях на поверхности мембраны могут формироваться бел-

ковые «поры», а также происходит снижение электрической стабильнос-

ти мембран. Можно думать, что сходные явления наблюдаются при дей-

ствии на клетки антител.

Молекулярные механизмы увеличения проницаемости липид-

ного слоя для ионов. При изучении молекулярных основ проницаемос-

ти липидного слоя широко используются модельные мембранные систе-

мы: изолированные мембранные структуры (эритроциты, Митохондрии,

везикулы саркоплазматического ретикулума), а также искусственные

фосфолипидные мембраны (бимолекулярные липидные мембраны —

БЛМ и фосфолипидные везикулы — липосомы). Изучение такого рода

систем показало, что сам по себе липидный слой практически непрони-

цаем для ионов. При действии различных химических и физических фак-

торов он становится проницаемым по одной из трех причин.

В липидном бислое)(вязкость которого внутри близка вязкости рас-

тительного масла) появляется жирорастворимое вещество, способное

связывать ионы. Механизм переноса ионов в этом случае напоминает

перевоз пассажиров на лодке с одного берега на другой и называется

«челночным», или переносом с помощью подвижного переносчика. При-

мером подвижного переносчика может служить ионофорный антибиотик

валиномицин, который образует комплекс с ионами К\ растворимый в

липидной фазе мембраны. К числу подвижных переносчиков, возможно,

относятся водорастворимые продукты перекисного окисления липидов,

в присутствии которых, как оказалось, увеличивается проницаемость

мембран для ионов водорода.

В липидном слое появляются вещества, молекулы которых, собира-

ясь вместе, образуют канал через мембрану. Сквозь такой канал ионы

могут проходить с одной стороны мембраны на другую. Каналы образу-

ются молекулами некоторых антибиотиков, например грамицидина А и

полимиксина. Продукты перекисного окисления липидов также могут об-

разовывать каналы в липидном слое, если в растворе есть ионы кальция.

Продукты расщепления некоторых фосфолипидов (в частности, кардио-

липина) фосфолипазой А

образуют каналы для одновалентных катионов.

Снижается электрическая прочность липидного слоя мембран, и уча-

сток мембраны разрушается электрическим током, который возникает под

влиянием разности потенциалов, существовавшей на мембране. Такое

явление носит название «электрического пробоя».

2.1.5. Нарушение электрической стабильности липидного слоя

Явление электрического пробоя мембран. Явление электричес-

кого пробоя мембран изучалось многими авторами на искусственных

мембранах и отдельных клетках. Мембраны обладают определенным

сопротивлением (Я) электрическомутоку (I), которое при небольшой раз-

ности потенциалов (II) между двумя сторонами мембраны является по-

стоянной величиной. Иными словами, для мембраны соблюдается закон

Ома:

I = и/в.

Это означает, что зависимость между напряжением на мембране (и)

и током через мембрану (I) линейная. Однако такая зависимость сохра-

няется при сравнительно небольших величинахи — обычно не выше 200—

300 мВ. При определенной критической разности потенциалов на мемб-

ране, называемой «потенциалом пробоя» (и*), происходит резкое

возрастание тока. При постоянном мембранном потенциале, если он пре-

вышает критическое значение, ток самопроизвольно нарастает во вре-

мени до полного разрушения мембраны. Это явление называется элект-

рическим пробоем

мембраны.

В основе этого явления лежит самопроизвольное зарождение де-

фектов в липидном бислое вследствие теплового движения фосфолипид-

ных молекул. При отсутствии разности потенциалов на мембране разме-

ры спонтанно образовавшихся пор не увеличиваются, так как этот процесс

сопровождается ростом площади раздела фаз липид — вода и требует

преодоления очень значительных сил поверхностного натяжения на гра-

нице раздела фаз. Более того, под действием сил поверхностного натя-

жения спонтанно образовавшийся дефект (пора) сразу же затягивается,

и мембрана остается целой. Увеличение разности потенциалов на мемб-

ране уменьшает энергию, необходимую для образования и роста поры.

При критической разности потенциалов и* рост спонтанно образовавших-

ся пор становится самопроизвольным, ток через мембрану резко возра-

стает, а если разность потенциалов поддерживать, мембрана будет пол-

ностью разрушена.

Для патологии клетки является чрезвычайно важным то обстоятель-

ство, что электрическая прочность мембран, мерой которой служит по-

тенциал пробоя, снижается под действием повреждающих факторов. Как

уже говорилось, основными причинами нарушения барьерных свойств

мембран в патологии являются перекисное окисление липидов, действие

мембранных фосфолипаз, механическое растяжение мембран или адсор-

бция на них некоторых белков. Изучение влияния этих действующих фак-

торов на электрическую прочность мембран показало, что все они сни-

жают потенциал пробоя мембран.

Пробой мембран собственным мембранным потенциалом («са-

мопробой»). Электрический пробой мембраны может наблюдаться не

только под действием напряжения, подаваемого на мембрану от внеш-

него источника, но и под действием собственного мембранного потен-

циала, т.е. разности потенциалов, возникающей на мембране в резуль-

тате диффузии ионов. Разумеется, этого не происходит в нормально

функционирующих неповрежденных клетках, потому что потенциалы про-

боя мембран и* выше, чем разности потенциалов, существующие на кле-

точных и внутриклеточных мембранах (и* > и).

При повреждении мембранных структур потенциал пробоя U* сни-

жается и может сложиться ситуация U* < U, когда мембрана будет «про-

биваться» собственным мембранным потенциалом. К чему это приводит

в условиях живой клетки? Предположим, клетку облучают ультрафиоле-

товыми лучами, под влиянием которых в липидных мембранах активиру-

ется перекисное окисление. В неповрежденных митохондриях потенциал

на мембране равен 175 мВ, а потенциал пробоя составляет около 200 мВ.

В процессе активации перекисного окисления липидов потенциал про-

боя начинает постепенно снижаться,,и как только он достигает значения

175 мВ, мембрана митохондрий «пробивается» собственным мембран-

ным потенциалом. То же происходит и при активации фосфолипаз: сни-

жение потенциала пробоя до величины, равной существующему на мем-

бране потенциалу, приводит к электрическому пробою мембраны и потере

ею барьерных свойств. В опытах с эритроцитами и митохондриями было

показано, что и осмотическое растяжение мембраны, и добавление чу-

жеродных белков могут снизить потенциал пробоя мембран настолько,

что мембраны начинают «пробиваться» собственным мембранным потен-

циалом.

Электрический пробой как универсальный механизм наруше-

ния барьерной функции мембран. Стоит задуматься, почему такие,

казалось бы, разные воздействия, как перекисное окисление липидов,

ферментативный гидролиз фосфолипидных молекул, механическое рас-

тяжение мембраны или адсорбция полиэлектролитов, приводят к одному

и тому же результату — снижению электрической прочности (т.е. умень-

шению величины потенциала пробоя) мембраны? Теория электрическо-

Рис. 2.9. Снижение электрической прочности мембран (потенциала пробоя)

при действии повреждающих воздействиях.

1 — перекисное окисление липидов, вызванное УФ облучением; 2 — действие фосфоли-

пазы А2; 3 — адсорбция поликатиона (белок протамин-сульфат); 4 — растяжение мемб

раны, вызванное разностью гидростатического давления (АР).

го пробоя дает четкий ответ на этот вопрос. Самопроизвольному росту

пор, случайно зародившихся в липидном бислое, препятствуют силы по-

верхностного натяжения на границе раздела фаз липидный слой мемб-

раны — окружающий водный раствор. Нужно приложить довольно боль-

шую разность потенциала к мембране, чтобы преодолеть эти силы и

вызвать рост поры. Теперь становится понятно, что вещества, снижаю-

щие поверхностное натяжение (детергенты), должны облегчать самопро-

извольный рост пор и снижать величину критического потенциала, кото-

рый нужно приложить к мембране, чтобы вызвать электрический пробой.

Это и наблюдается в действительности. Продукты перекисного окисле-

ния липидов, так же как и продукты гидролиза фосфолипидов фосфо-

липазами (лизолецитины), и многие белки снижают поверхностное натя-

жение на границах раздела фаз. Именно поэтому они снижают потенциал

пробоя мембран, т.е. уменьшают их электрическую прочность (см.

рис. 2.9). Механическое растяжение мембраны (ДР на рис. 2.9) действует

сходно, так как противодействует силам поверхностного натяжения. Та-

ким образом, электрический пробой мембран оказывается универсаль-

ным механизмом нарушения барьерной функции мембран в патологии.

Повышение электрической прочности мембран. Известны два

способа, с помощью которых живые клетки повышают свою электричес-

кую прочность: асимметричный поверхностный потенциал и наличие хо-

лестерина. Поверхностный потенциал возникает на мембране в случае

появления на поверхности липидного слоя заряженных химических

группировок, таких, например, как карбоксил или фосфат. Непосред-

ственно на липидный бислой действует потенциал, равный разности меж-

ду потенциалом в водной среде, омывающей мембрану, и поверхност-

ным потенциалом. За счет неодинакового заряда на поверхностях

мембраны реальная разность потенциалов, приложенная к липидному

бислою, может быть больше или меньше трансмембранной разности по-

тенциалов. В большинстве биологических мембран заряды распределе-

ны таким образом, что разность потенциалов на липидном бислое мень-

ше разности потенциалов между водными растворами, омывающими

мембрану. Это повышает реальную электрическую прочность мембраны

и снижает вероятность ее самопробоя.

Второй фактор, повышающий электрическую прочность мембран, —

это холестерин. Было показано, что включение молекул холестерина в

фосфолипидный бислой весьма заметно увеличивает электрическую

прочность мембран, т.е. повышает потенциал пробоя. Особенно заметно

действие холестерина на поврежденные мембраны. Защитные свойства

холестерина против электрического пробоя мембраны можно объяснить

его влиянием на вязкость липидного бислоя. Известно, что введение хо-

лестерина в фосфолипидный бислой может повысить вязкость последнего

в 2—3 раза, что приводит к замедлению образования и роста дефектов

(пор) в липидном бислое мембран. Какуже говорилось, именно образова-

ние и увеличение дефектов в липидном слое под действием приложенно-

го электрического поля лежат в основе явления электрического пробоя.

Нарушение структурных (матричных) свойств липидного би-

слоя. Наиболее изучены три характеристики липидного слоя мембран,

от которых зависят его свойства как жидкой фазы (матрицы), обеспечи-

вающей функционирование мембранных белков и рецепторов:

поверх-

ностный

заряд,

вязкость

площадь

липидного

слоя.

Все эти характерис-

тики изучаются с помощью флюоресцентных и спиновых зондов.

Перекисное окисление липидов и действие мембранных фосфоли-

паз приводят к накоплению в липидной фазе мембран жирных кислот,

которые придают мембране при нейтральных рН отрицательный заряд.

Увеличение отрицательных зарядов на поверхности мембраны облегча-

ет связывание с мембраной положительно заряженных ионов и белковых

молекул, несущих положительные заряды, и, наоборот, уменьшает взаи-

модействие мембран с другими отрицательно заряженными молекулами

или мембранами. Связывая больше Са

", мембраны с большим числом

отрицательных зарядов на поверхности становятся более доступны для

действия фосфолипаз, но зато хуже связывают ионы Ре

', которые уско-

ряют пероксидацию липидов.

Вместе с тем при перекисном окислении липидов увеличивается

вязкость липидного слоя мембран. Значительное увеличение вязкости

происходит при увеличении содержания в мембранах холестерина. Воз-

растание вязкости приводит кторможению встроенных в мембраны фер-

ментов, таких, как Ыа

—К

—АТФаза и Са

—АТФаза. Это в свою очередь

изменяет ионный баланс клетки и может привести к нарушениям метабо-

лизма. Одна из теорий происхождения атеросклероза заключается в том,

что увеличение содержания холестерина в крови больных или активация

перекисного окисления липидов сопровождается возрастанием вязкос-

ти мембран клеток сосудистой стенки, в частности плазматической мем-

браны мышечных клеток. Это приводит к нарушению работы кальциевой

помпы и увеличению концентрации кальция в цитоплазме гладкомы-

шечных клеток. В итоге усиливается клеточное деление и развивается ате-

росклеротическая бляшка.

С помощью флюоресцентных зондов было показано, что при пере-

кисном окислении уменьшаются площадь поверхности липидного слоя

мембран, а также площадь, занимаемая фосфолипидами на поверхнос-

ти липопротеидов плазмы крови. Это связано с окислением части жирно-

кислотных цепей фосфолипидов и выходом их в водную фазу. Одним из

результатов такого явления оказывается увеличение относительной кон-

центрации холестерина в липидном монослое на поверхности липопро-

теидов, подвергнутых перекисному окислению. Липопротеиды низкой

плотности (ЛНП) в результате этого переносят еще больше холестерина

в клеточные мембраны сосудистой стенки, чем неокисленные ЛНП, и их

атерогенность возрастает. Липопротеиды высокой плотности (ЛВП), в

норме акцептирующие холестерин с мембран клеток и обладающие анти-

атерогенным действием, в результате перекисного окисления полностью

теряют способность акцептировать холестерин. Возрастание атероген-

ных (холестериндонорных) свойств ЛНП и утрата антиатерогенных (хо-