Журнал - Проблемы криобиологии 2010 №4

Подождите немного. Документ загружается.

439

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №4

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №4

ным представлениям данный пул стромальных кле-

ток-предшественников включает мультипотентные

МСК [6]. При последующем пересеве было отме-

чено формирование новых колоний в культуре, что

свидетельствовало о пролиферации ранних МСК.

После 3–4-х пассажей субкультуры состояли пре-

имущественно из веретенообразных фибробласто-

подобных клеток с небольшим овальным ядром,

которые пролиферировали и формировали харак-

терные потоки.

Одним из основных критериев состава клеточ-

ной популяции является экспрессия специфических

поверхностных маркеров. Исследованные фибро-

бластоподобные клетки КМ человека, субкульти-

вированные в ходе 4-х пассажей, характеризова-

лись иммунофенотипом CD29

, CD44

, CD73

CD105

(рис. 1).

При этом содержание клеток, экспрессировав-

ших данные маркеры, в исследуемой культуре

составляло более 90%. Одновременно они не экс-

прессировали маркеры гемопоэтических стволо-

вых клеток CD34, а также общий маркер гемопоэ-

тических клеток CD45 (рис. 1). Представленный

иммунофенотип характерен для МСК [7]. Следует

Рис. 1. Результаты проточной цитофлуориметрии культуры МСК КМ взрослого человека (4-й пассаж).

Fig. 1. Results of flow cytometry analysis of human adult BM MSCs culture (the 4

passage).

ers of hematopoietic stem cells CD34, as well as

common marker of hematopoietic cells CD45 (Fig. 1).

The presented immunophenotype has been shown for

MSCs [7]. It should be noted that the similar immu-

nophenotype was assessed for MSCs, derived from

adult human derma and adipose tissue [1].

During culturing of MSCs in the medium, that

stimulate cell differentiation in adipose lineage, the

change in cells morphology after 7–10 days was

observed: the cells gained roundish (oval) shape. Fur-

ther culturing resulted in the accumulation of intrac-

ellular lipids, positively stained with Oil Red O. Dur-

ing stimulation of BM MSCs to the differentiation into

osteogenic lineage the expression of alkaline phos-

phatase by cells as well as matrix mineralization,

positively stained with silver nitrate by von Kossa

(non-presented data) were observed.

After cryopreservation, thawing and removal of

cryoprotectants no significant loss of cells was found,

the survival of cells in suspension was not less than

65%. During the culture, cryopreserved cells adhered

to plastic and proliferated. It has been noted that

MSCs directly after cryopreservation formed subcon-

fluent monolayer in average 3 days later if compared

440

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №4

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №4

отметить, что аналогичный иммунофенотип был

установлен и для МСК, источником которых явля-

лись дерма и жировая ткань взрослого человека [1].

При переводе МСК в среду культивирования,

стимулирующую дифференцировку клеток в

адипогенном направлении, наблюдалось изменение

их морфологии через 7–10 суток культивирования,

клетки приобретали округлую (овальную) форму.

Дальнейшее культивирование приводило к накопле-

нию внутриклеточных липидов, которые позитивно

окрашивались масляным красным (Oil Red O). При

стимуляции МСК КМ к дифференцировке в остео-

генном направлении наблюдались экспрессия

клетками щелочной фосфатазы, а также минерали-

зация матрикса, позитивно окрашивающегося

нитратом серебра по Ван Коссу (данные не пред-

ставлены).

После криоконсервирования, отогрева и удале-

ния криопротектора существенной потери клеток

выявлено не было, сохранность суспензии состав-

ляла не менее 65%. При переносе в культуру крио-

консервированные клетки адгезировали к пластику

и пролиферировали. Отмечено, что МСК непосред-

ственно после криоконсервирования формировали

субконфлуентный монослой в среднем на 3-е суток

позднее по сравнению с контролем (некриоконсер-

вированными клетками), что, вероятно, связано с

периодом репаративных процессов в клетках. В

ходе дальнейшего субкультивирования в стандарт-

ных условиях криоконсервированные клетки

активно пролиферировали и не отличались от не-

криоконсервированных.

Исследование иммунофенотипа МСК КМ че-

ловека после криоконсервирования показало, что

он не отличался от такового до криоконсервирова-

ния. Более 90% клеток экспрессировали CD29,

CD44, CD73, CD105 и оставались негативными на

CD45 и CD34.

Изучение в условиях in vitro дифференциро-

вочного потенциала культивированных МСК КМ

показало, что криоконсервирование не влияло на

способность исследуемых клеток к направленным

остео- и адипогенной дифференцировкам. Экспрес-

сия клетками щелочной фосфатазы, а также мине-

рализация матрикса в остеогенной культуре сви-

детельствовали о функциональной активности диф-

ференцировавшихся остеобластов (рис. 2).

В адипогенной культуре выявлены клетки,

содержащие вакуоли с нейтральными жирами, что

указывало на дифференцировку криоконсервиро-

ванных МСК в адипогенном направлении (рис. 3).

Таким образом, выделение и последующая экс-

пансия стромальных клеток из первичной суспензии

КМ в условиях монослойного культивирования

Рис. 2. Дифференцировка МСК КМ в остеогенном на-

правлении после криоконсервирования: а – экспрессия

клетками щелочной фосфатазы; б – окрашивание мине-

рализованного матрикса нитратом серебра по Ван Кос-

су, ×100.

Fig. 2. Differentiation of BM MSCs into osteogenic lineage

after cryopreservation: a – expression by the cells of alka-

line phosphatase; b – staining of mineralized matrix with

silver nitrate according to von Kossa, ×100.

а a

б b

with the control (non-cryopreserved cells), which is

likely related to the period of reparative processes

in cells. During further sub-culturing under standard

conditions the cryopreserved cells actively prolifer-

ated and did not differ from non-cryopreserved ones.

The study of immune phenotype of human BM MSCs

after cryopreservation has shown that it did not dif-

fer from that prior to cryopreservation. More than

90% cells expressed CD29, CD44, CD77, CD105

and remained negative on CD45 and CD34.

Investigation of differentiation potential of cultured

BM MSCs in vitro demonstrated that cryopreserva-

tion did not affect the ability of the studied cells to

directed osteo- and adipogenic differentiation. The

alkaline phosphatase expression as well as matrix

441

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №4

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №4

позволили получить практически однородные куль-

туры, обогащенные клетками c иммунофенотипом

и дифференцировочным потенциалом, характер-

ными для МСК. Процесс криоконсервирования с

использованием 10% ДМСО, медленного двухсту-

пенчатого замораживания и быстрого отогрева поз-

воляет в значительной степени сохранить коли-

чество МСК КМ с характерным иммунофеноти-

пом и способностью к индуцированной дифферен-

цировке в остео- и адипогенном направлениях.

Следует отметить, что специфические свойства

криоконсервированных МСК КМ оставались ста-

бильными в ходе последующей экспансии.

Выводы

1. Стромальные клетки, изолированные из

костного мозга взрослого человека, после экспан-

сии in vitro демонстрируют специфический имму-

нофенотип и способность к мультилинейной диффе-

ренцировке, свойственные МСК.

2. Криоконсервирование МСК КМ человека пу-

тем медленного двухступенчатого замораживания

под защитой 10% ДМСО позволяет сохранить их

иммунофенотип и способность к индуцированным

in vitro остео- и адипогенной дифференцировкам.

Рис. 3. Дифференцировка МСК КМ в адипогенном на-

правлении после криоконсервирования (окрашивание

Oil Red O), ×100.

Fig. 3. Differentiation of BM MSCs in adipogenic lineage

after cryopreservation (Oil Red O staining), ×100.

mineralization in osteogenic culture testified to func-

tional activity of differentiated osteoblasts (Fig. 2).

In adipogenic culture the cells contained vacuoles

with neutral lipids, indicating the differentiation of

cryopreserved MSCs into adipogenic lineage (Fig. 3).

Thus the isolation and following expansion of stro-

mal cells from primary BM suspension under mon-

olayer culture conditions enabled the obtaining of

nearly homogenous cultures, enriched with the cells

with immunophenotype and differentiation potential,

inherent to MSCs. Cryopreservation with 10% DMSO

with the application of slow two-step freezing and

rapid thawing enables in a great extent to preserve

the number of BM MSCs with typical immunophe-

notype and ability to induced differentiation into

osteo- and adipogenic lineages. It should be noted

that specific properties of cryopreserved BM MSCs

remained stable during following expansion.

Conclusions

1. Stromal cells isolated from adult human bone

marrow after in vitro expansion demonstrate the

specific immunophenotype and ability to multi-lineage

differentiation, typical to MSCs.

2. Cryopreservation of human BM MSCs by the

application of slow two-step freezing under protec-

tion of 10% DMSO enables the preservation of their

immunophenotype and ability to the induced in vitro

osteo- and adipogenic differentiation.

Литература

Петренко А.Ю., Петренко Ю.А., Скоробогатова Н.Г. и

др. Стромальные клетки костного мозга, жировой ткани

и кожи человека в ходе экспансии проявляют иммуно-

фенотип и дифференцировочный потенциал мезенхи-

мальных стволовых клеток // Трансплантологія.– 2008.–

Т. 10, №1.– С. 84–86.

Скоробогатова Н.Г., Петренко Ю.А., Волкова Н.А.,

Петренко А.Ю. Изучение способности к дифферен-

References

Petrenko A.Yu., Petrenko Yu.A., Skorobogatova N.G. et al.

Stromal cells of bone marrow, adipose tissue and human skin

during expansion manifest immune phenotype and

differentiation potential of mesenchymal stem cells //

Transplantologiya.– 2008.– Vol. 10, N1.– P. 84–86.

Skorobogatova N.G., Petrenko Yu.A., Volkova N.A., Petren-

ko A.Yu. Study of ability to differentiation into osteogenic and

adipogenic lineages of human bone marrow mesenchymal

stromal cells of clonal origin // Biotechnology.– 2010.– Vol.3,

N3.– P. 72–77.

Bianco P., Riminucci M., Gronthos S., Robey P.G. Bone

marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential

applications // Stem Cells.– 2001.– Vol. 19, N3.– P. 180–192.

Bosch P., Musgrave D.S., Lee J.Y. et al. Osteoprogenitor

cells within skeletal muskle // J. Orthop. Res.– 2000.– Vol. 18,

N6.– P. 933–944.

Bruder S.P., Jaiswal N., Haynesworth S.E. Growh kinetics,

self-renewal, and the osteogenic potential of purified human

mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and

following cryopreservation // J. Cell Biochem.– 1997.– Vol. 64,

N2.– P. 278–294.

Deans R.J., Moseley A.B. Mesenchymal stem cells: Biology

and potential clinical uses // Exp. Hematol.– 2000.– Vol. 28,

N8.– P. 875–884.

Dominici M., Le Blanc K., Mueller I. et al. Minimal criteria for

defining multipotent mesenchymal stromal cells. The

International Society for Cellular Therapy position statement //

Cytotherapy.– 2006.– Vol. 8, N4.– Р. 315–317.

442

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №4

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №4

цировке в остеогенном и адипогенном направлениях

мезенхимальных стромальных клеток костного мозга

человека клонального происхожения // Биотехнология.–

2010.– Т. 3, №3.– С. 72–77.

Bianco P., Riminucci M., Gronthos S., Robey P.G. Bone

marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential

applications // Stem Cells.– 2001.– Vol. 19, N3.– P. 180–192.

Bosch P., Musgrave D.S., Lee J.Y. et al. Osteoprogenitor

cells within skeletal muskle // J. Orthop. Res.– 2000.– Vol. 18,

N6.– P. 933–944.

Bruder S.P., Jaiswal N., Haynesworth S.E. Growh kinetics,

self-renewal, and the osteogenic potential of purified human

mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and

following cryopreservation // J. Cell Biochem.– 1997.– Vol. 64,

N2.– P. 278–294.

Deans R.J., Moseley A.B. Mesenchymal stem cells: Biology

and potential clinical uses // Exp. Hematol.– 2000.– Vol. 28,

N8.– P. 875–884.

Dominici M., Le Blanc K., Mueller I. et al. Minimal criteria for

defining multipotent mesenchymal stromal cells. The

International Society for Cellular Therapy position statement //

Cytotherapy.– 2006.– Vol. 8, N4.– Р. 315–317.

Histological and histohemical methods. Theory and practice.

Second edition / Ed. by J.A. Kilrnan.– Oxford: Pergamon

Press, 1990.– 433 p.

Tuan R.S., Boland G., Tuli R. Adult mesenchymal stem cells

and cell-based tissue engineering // Arthritis Res. Ther.–

2003.– Vol. 5, N1.– P. 32–45.

Xiang Ying, Zheng Qiang, Jia Bing-bing et al. Ex vivo

expansion and pluripotential differentiation of cryopreserved

human bone marrow mesenchymal stem cells // J. Zhejiang

Univ. Sci. B.– 2007.– Vol. 8, N2.– P. 136–146.

Поступила 02.08.2010

Рецензент Т.Г. Дубрава

Histological and histohemical methods. Theory and practice.

Second edition / Ed. by J.A. Kilrnan.– Oxford: Pergamon

Press, 1990.– 433 p.

Tuan R.S., Boland G., Tuli R. Adult mesenchymal stem cells

and cell-based tissue engineering // Arthritis Res. Ther.–

2003.– Vol. 5, N1.– P. 32–45.

Xiang Ying, Zheng Qiang, Jia Bing-bing et al. Ex vivo

expansion and pluripotential differentiation of cryopreserved

human bone marrow mesenchymal stem cells // J. Zhejiang

Univ. Sci. B.– 2007.– Vol. 8, N2.– P. 136–146.

Accepted in 02.08.2010

10.

443

* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:

ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.: (+380

57) 373-30-07, факс: (+380 57) 373-30-84, электронная почта:

bogdanchik_11@mail.ru

* To whom correspondence should be addressed: 23,

Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373

3007, fax: +380 57 373 3084, e-mail: bogdanchik_11@mail.ru

Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-

tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine

Институт проблем криобиологии и криомедицины

НАН Украины, г. Харьков

УДК 612.111.7:615.014.41

О.А БОГДАНчИКОВА, В.А. КИРЕЕВ, А.Т. ХОДЬКО, А.М. КОМПАНИЕЦ*

Криоконсервирование тромбоцитов.

2. Эффективность криоконсервантов на основе комбинаций

криопротекторов при различных режимах замораживания

UDC 612.111.7:615.014.41

O.A. BOGDANCHIKOVA, V.A. KIREEV, A.T. KHOD’KO, A.M. KOMPANIETS*

Platelet Cryopreservation.

2. Efficiency of Cryopreservatives Based on Cryoprotectant

Combinations Under Different Freezing Regimens

В работе исследовано влияние различных режимов замораживания концентрата тромбоцитов с комбинированными

криозащитными средами на сохранность показателей морфофункциональной полноценности тромбоцитов. Наиболее высокие

и стабильные результаты получены при режиме замораживания с высокими скоростями охлаждения, а также при отсутствии

переохлаждения и быстром прохождении плато кристаллизации.

Ключевые слова: концентрат тромбоцитов, комбинированные криозащитные среды, режимы замораживания, скорости

охлаждения, плато кристаллизации, переохлаждение.

У роботі досліджено вплив різних режимів заморожування концентрату тромбоцитів з комбінованими кріозахисними

середовищами на збереженість показників морфофункціональної повноцінності тромбоцитів. Найбільш високі і стабільні

результати отримані при режимі заморожування з високими швидкостями охолодження, а також при відсутності переохолодження

і швидкому проходженні плато кристалізації.

Ключові слова: концентрат тромбоцитів, комбіновані кріозахисні середовища, режими заморожування, швидкості

охолодження, плато кристалізації, переохолодження.

The effect of different freezing regimens of platelet concentrate with combined cryoprotective media on the indices of platelet

morphofunctional integrity was studied in the research. The highest and the most stable results were obtained at freezing regimen with

high cooling rates as well as with the absence of overcooling and rapid passing through the crystallization plateau.

Key words: platelet concentrate, combined cryoprotective media, freezing regimens, cooling rates, crystallization plateau, overcooling.

problems

cryobiology

Vol. 20, 2010, №4

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №4

Анализ научных публикаций по проблеме крио-

консервирования концентратов тромбоцитов (КТ)

свидетельствует о том, что основное внимание ис-

следователей было уделено выбору криопротекто-

ра и созданию на его основе эффективной криоза-

щитной среды [20]. Результаты изучения различ-

ных скоростей охлаждения и их влияния на криокон-

сервирование КТ описаны лишь в единичных рабо-

тах. Представлены данные замораживания КТ с

низкими [3, 4, 9, 16, 22] и высокими [13, 14] скорос-

тями охлаждения в различных криозащитных

средах; предложены ступенчатые режимы замора-

живания КТ с разными скоростями охлаждения в

определенных температурных диапазонах [12] и

инициацией кристаллизации для предотвращения

переохлаждения внеклеточной среды [5, 12, 15, 17].

В практике криоконсервирования КТ для кли-

нических целей наибольшее распространение полу-

чил способ замораживания контейнеров с суспен-

зией тромбоцитов в морозильной камере (–80°C)

или парах жидкого азота (–120…–150°C) [19, 21,

Analysis of scientific publications on the task of

the cryopreservation of platelet concentrates (PCs)

testified to the fact that the main attention of the resear-

chers was targeted to the cryoprotectant selection and

development of effective cryoprotective medium on

its base [20]. The results on studying different cooling

rates and their effect on PC cryopreservation were

described only in the single papers. There were pre-

sented the data on freezing of PCs with low [3, 4, 9,

16, 22] and rapid [13, 14] cooling rates in various cryo-

protective media; there were proposed the step-wise

freezing regimens of PCs with different cooling rates

within the established temperature ranges [12] and

crystallization initiation for prevention of extracellular

medium overcooling [5, 12, 15, 17].

In the practice of PC cryopreservation for the

clinical purposes the container freezing method with

platelet suspension in freezing chamber (−80°C) or

liquid nitrogen vapors (−120…−150°C) [19, 21, 23] was

widespread. The cooling rate under these conditions

is not controlled and may vary from 1 to 35°C/min.

444

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №4

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №4

It should be noted that practically all the researches

directed to the search of platelet freezing the optimal

regimens were based on the application of one of the

cryoprotectants as: dimethyl sulfoxide (DMSO), dime-

thyl acetamide (DMAc), glycerol, 1,2-propane diol

(1,2-PD) etc.

Recently the perspective of combined cryoprotec-

tive media application at platelet freezing [2, 6] has

been shown, the cryopreservative composition with a

high level of cryoprotective effect has been determined

[3].

The research aim was to study the effect of different

regimens of PC freezing with combined cryoprotective

media on the indices of platelet morphofunctional

integrity.

Materials and methods

PCs derived from 500 ml of donor’s blood (hemo-

preservative “Glygicir”) by leukocyte-platelet layer

method [1] were the research object. Prior to carrying-

out the experiment PCs were stored for 12–16 hrs in

the automated mixer (IPC&C) with 2 rot/min mixing

rate at 22 ± 2°C.

Cryoprotectants DMSO, DMAc, 1,2-PD, glycerol

and oxyethylated glycerol with polymerization degree

n = 5 (OEG

n = 5

), purified and identified at the IPC&C

of the National Academy of Sciences of Ukraine were

used in the research.

For studying the effect of freezing regimens on the

result of cryopreserved PC integrity the DMAC/1,2-PD,

DMAC/glycerol, DMAC/OEG

n=5

(1:1) combined me-

dia in 10% total initial cryoprotectant concentration in

plasma were used.

Prior to freezing the PC samples were slowly

(under a constant agitating) mixed with cryoprotective

media in 1:1 ratio and exposed for 30 min at room

temperature. The concentration of each cryoprotectant

in the frozen platelet suspension made 2.5%.

The platelet suspension samples (6 ml) were frozen

in 10 ml rectangular polymer containers (30×100 mm).

Three regimens of cooling were investigated: 1 – in

liquid nitrogen vapors at –40…−45°C; 2 – in liquid

nitrogen vapors at –188…−193°C; 3 – direct plunging

into liquid nitrogen (−196°C). The samples were cooled

in wide-neck Dewar’s vessel, by placing the containers

onto foam thermo-insulating stowage fixed on the

certain experimentally established level above the

liquid nitrogen surface (model laboratory freezer). The

frozen samples of PCs were stored from 3 days to 3

months.

The temperature change was recorded with dif-

ferential copper constantan thermocouple (diameter

of copper and constantan conductors is 0.15 mm) pla-

ced in the center of frozen sample of the simulating

model system. When measuring the standard thermo-

couple junction was in flask at 0°C. Error of tempe-

23]. Скорость охлаждения в таких условиях не регу-

лируется и может варьировать от 1 до 35°C/мин.

Следует отметить, что практически все иссле-

дования, направленные на поиск оптимальных ре-

жимов замораживания тромбоцитов, основаны на

использовании в криозащитном растворе одного из

криопротекторов: диметилсульфоксида (ДМСО),

диметилацетамида (ДМАц), глицерина, 1,2-про-

пандиола (1,2-ПД) и т.д.

В работах последних лет показана перспектив-

ность использования комбинированных криозащит-

ных сред при замораживании тромбоцитов [2, 6],

определен состав криоконсервантов с высоким

уровнем криозащитного действия [3].

Цель работы – исследование влияния различ-

ных режимов замораживания КТ с комбинирован-

ными криозащитными средами на сохранность

показателей морфофункциональной полноценности

тромбоцитов.

Материалы и методы

Объектом исследования служили КТ, выделен-

ные из 500 мл донорской крови (гемоконсервант

“Глюгицир”) методом из лейкотромбоцитарного

слоя [1]. Перед проведением эксперимента КТ хра-

нили в течение 12–16 ч на автоматической мешал-

ке (ИПКиК НАН Украины) со скоростью пере-

мешивания 2 об/мин при 22 ± 2°С .

В работе использовали криопротекторы ДМСО,

ДМАц, 1,2-ПД, глицерин и оксиэтилированный гли-

церин со степенью полимеризации n = 5 (ОЭГ

n = 5

очищенные и идентифицированные в ИПКиК НАН

Украины.

Для изучения влияния режимов замораживания

на результат сохранности криоконсервированных

КТ использовали комбинированные среды ДМАц/

1,2-ПД, ДМАц/глицерин, ДМАц/ОЭГ

n=5

(1:1) в

10%-й суммарной начальной концентрации крио-

протекторов в плазме.

Перед замораживанием образцы КТ медленно

(при постоянном перемешивании) соединяли с

криозащитными средами в соотношении 1:1 и

выдерживали 30 мин при комнатной температуре.

Концентрация каждого криопротектора в замора-

живаемой суспензии тромбоцитов составляла 2,5%.

Образцы суспензии тромбоцитов (6 мл) замо-

раживали в полимерных контейнерах прямоугольной

формы (30×100 мм) вместимостью 10 мл. Исследо-

вали три режима замораживания: 1 – в парах жид-

кого азота при температуре –40…–45°С; 2 – в па-

рах жидкого азота при температуре –188… –193°C;

3 – непосредственное погружение в жидкий азот

(–196°C). Образцы КТ охлаждали в широкогорлом

сосуде Дьюара, располагая контейнеры на пено-

пластовой термоизолирующей укладке, фиксиро-

ванной на определенном экспериментально уста-

445

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №4

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №4

новленном уровне над зеркалом жидкого азота

(лабораторная модель замораживателя). Заморо-

женные образцы КТ хранили в жидком азоте от 3

суток до 3 месяцев.

Изменение температуры регистрировали диф-

ференциальной медь-константановой термопарой

(диаметр медного и константанового проводников

0,15 мм), расположенной в центре замораживаемо-

го образца модельной системы-имитатора. При из-

мерениях эталонный спай термопары находился в

термосе при температуре 0°C. В данных условиях

погрешность измерения температуры в диапазоне

20…–40°C составляла не более ± 0,35°C.

Образцы КТ размораживали на водяной бане

при температуре 37°С и подсчитывали в них коли-

чество тромбоцитов [10]. Сохранность показате-

лей морфофункциональной полноценности крио-

консервированных КТ оценивали после удаления

криопротекторов [11] по комплексу тестов in vitro:

реакция на гипотонический шок (РГШ) [7], агре-

гация, индуцированная аденозин-дифосфат динат-

риевой солью (АДФ, 200 мкМ, “Serva” Германия)

[18], ретракция тромбоцитарного сгустка [7]. Сте-

пень РГШ и агрегации измеряли на анализаторе

“Colysagraph” (“Damon/IEC Division”, США) с гра-

фической регистрацией процесса на самописце

“Endim” 622.01 (Германия). Полученные данные

выражали в процентном соотношении к соответст-

вующим показателям свежевыделенных КТ, кото-

рые принимали за 100%.

Статистический анализ результатов проводили

с помощью программного пакета “Statgraphic plus

for Windows” версия 5.1 с использованием критерия

Манна-Уитни.

Результаты и обсуждение

На первом этапе исследований был проведен

анализ термограмм охлаждения имитаторов – мо-

дельной криобиологической системы, представля-

ющей собой 5%-й раствор ДМСО или 5%-е ком-

бинированные растворы криопротекторов ДМАц/

1,2-ПД, ДМАц/глицерин, ДМАц/ОЭГ

n=5

в плазме

(рис. 1).

В результате реализации режимов заморажива-

ния 1 и 2 получены термограммы, демонстри-

рующие разные скорости охлаждения до и после

периода начальной кристаллизации, различную дли-

тельность плато кристаллизации, наличие или от-

сутствие переохлаждения. Анализ термограмм ох-

лаждения модельных криобиологических систем

в парах жидкого азота при температуре –40…

–45°C (табл. 1) и –188…–193°C (табл. 2) свидетель-

ствует о том, что режим замораживания 1 обеспе-

чивает низкие скорости охлаждения (1–3°С/мин),

а режим 2 – высокие (12–25°С/мин). При низких

скоростях охлаждения отмечалась длительная за-

rature measurement within the range of 20…–40°C

made less than ± 0.35°C under these conditions.

The samples of PCs were frozen-thawed on water

bath at 37°C and a number of platelets were calculated

[10]. Preservation of the morphofunctional indices of

cryopreserved PC was estimated after cryoprotec-

tants’ removal [11] by in vitro tests: hypotonic shock

reaction (HSR) [7]; aggregation, induced by adenosine

diphosphate disodium salt (ADP, 200 µM, Serva Ger-

many) [18]; retraction of platelet clot [7]. HSR and

aggregation rate was measured with Colysagraph

(Damon/IEC Division, USA) analyser with graphic re-

cording of the process with Endim plotter 622.01

(Germany). The obtained data were expressed as the

percentage ratio to the corresponding indices of freshly

isolated PCs assumed as 100%.

The statistical analysis of results was carried-out

with Statgraphic plus for Windows software version

5.1 using Mann-Whitney’s criterion.

Results and discussion

At the first stage of the researches we analysed

the cooling thermograms of the model cryobiological

system simulators, representing either 5% solution of

DMSO or 5% combined solutions of DMAc/1,2-PD,

DMAc/glycerol, DMAc/OEG

n = 5

cryoprotectants in

plasma (Fig. 1).

After the realization of freezing regimens 1 and 2

the thermograms were obtained, which demonstrated

different cooling rates prior to and after initial crystal-

lization; various duration of crystallization plateau;

either presence or absence of supercooling. The ana-

Рис. 1. Термограммы, полученные при охлаждении

5%-го раствора ДМСО в парах жидкого азота при темпе-

ратуре –40…–45°C (кривая 1) и –188…–193°C (кривая 2),

n = 3.

Fig. 1. Thermograms, obtained when cooling 5% DMSO

solution in liquid nitrogen vapors within the ranges −40…

−45°C (curve 1) and −188…–193°C (curve 2), n = 3.

-80

-60

-40

-20

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Время, мин Time, min

Температура, °C

Temperature, °C

ртемараП

retemaraP

ОСМД

OSMD

ГЭО/цАМД

5=n

GEО/cAMD

5=n

нирецилг/цАМД

lorecylg/cAMD

2,1/цАМД - ДП

2,1/cAMD - DP

ьтсорокС

,яинеджалхо

ним/сударг

,etargnilooC

nim/eerged

02тО

Тод

рк

02morF

Тotnwod

53,1±52,215,1±8,112±9,211±7,41

ТтО

рк

7-...6-од

ТmorF

7-...6-otnwod

9,1±50,458,0±7,157,1±58,32±5

7-...6-тО

04-од

7-...6-morF

04-otnwod

2,5±520,5±7,4256,4±52,223,5±2,02

рк

0,3-2,2-4,2-3-

,Т

C000

ним,иицазиллатсиркоталпанакжредаЗ

nim,uaetalpnoitazillatsyrctayaleD

52,0±57,0573,0±521,252,0±0,152,0±5,1

ртемараП

retemaraP

ОСМД

OSMD

ГЭО/цАМД

5=n

GEО/cAMD

5=n

нирецилг/цАМД

lorecylg/cAMD

2,1/цАМД - ДП

2,1/cAMD - DP

ьтсорокС

,яинеджалхо

ним/сударг

,etargnilooC

nim/eerged

02тО

Тод

рк

02morF

Тotnwod

7,0±4,26,0±1,25,0±0,33,0±7,2

ТтО

рк

7-...6-од

ТmorF

7-...6-otnwod

2,0±53,02,0±4,080,0±72,080,0±52,0

7-...6-тО

04-од

7-...6-morF

04-otnwod

5,0±2,16,0±0,25,0±2,18,0±8,1

рк

3-2-5,2-4,2-

∆ ,Т

101

C2,1

ним,иицазиллатсиркоталпанакжредаЗ

nim,uaetalpnoitazillatsyrctayaleD

2±022±712±112±61

446

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №4

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №4

lysis of cooling thermograms of model cryobiological

systems in liquid nitrogen vapors at –40…−45°C (Table 1)

and –188…−193°C (Table 2) testifies to the fact that

freezing regimen 1 provides low cooling rates (1–

3 degree/min), and regimen 2 does high ones (12–

25 degree/min). At low cooling rates there was noted

the long-term temperature delay at the level of crystalli-

zation plateau (11–20 min) with previous superrcooling

of extracellular medium (Table 1); at high rates the

duration of crystallization plateau reduced and super-

Таблица 1. Параметры термограмм охлаждения криозащитных сред в парах азота при температуре –40…–45°C

Table 1. Thermogramms’ parameters of cryoprotective media cooling in liquid nitrogen vapors under –40…–45°C

Примечание: Т

кр

– температура начала кристаллизации; ДТ – степень переохлаждения.

Note: T

– crystallization onset temperature; ∆T – supercooling rate.

держка температуры на уровне плато кристалли-

зации (11–20 мин) с предшествующим переохлаж-

дением внеклеточной среды (см. табл. 1); при

высоких – длительность плато кристаллизации со-

кращалась, переохлаждение отсутствовало (см.

табл. 2). При замораживании образцов непосред-

ственным погружением в жидкий азот скорость

охлаждения составляет 210 градусов/мин (харак-

теристика данного режима замораживания 3 не

представлена).

Таблица 2. Параметры термограмм охлаждения криозащитных сред в парах азота при температуре –188…–193°C

Table 2. Thermogramms’ parameters of cryoprotective media cooling in liquid nitrogen vapors under −188…−193°C

Примечание: Т

кр

– температура начала кристаллизации; ДТ – степень переохлаждения.

Note: T

– crystallization onset temperature; ∆T – supercooling rate.

ватсоС

атнавреснокоирк

noitisopmoC

evitavreserpoyrcfo

яинавижаромазмижеР

nemigergnizeerF

123

2,1/цАМД - ДП

2,1/cAMD - DP

2,9±0,686,2±0,192,4±7,98

нирецилг/цАМД

lorecylg/cAMD

0,4±7,190,5±0,099,5±3,68

ГЭО/цАМД

5=n

GEО/cAMD

5=n

5,6±3,090,5±5,592,8±0,19

ОСМД

OSMD

9,5±8,298,3±4,393,4±4,68

447

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №4

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №4

Таблица 3. Количество криоконсервированных тромбоцитов в

зависимости от режима замораживания (% от свежевыделенных,

М ± у, n=5)

Table 3. Frozen-thawed platelet amount depending on freezing regimen

(% of fresh platelets, М ± у, n=5)

Наличие или отсутствие в модели

криобиологической системы (плазма/

криопротектор) тромбоцитов практи-

чески не влияет на параметры термо-

грамм охлаждения, что позволяет ис-

пользовать полученные эксперимен-

тальные данные при анализе резуль-

татов криоконсервирования суспензии

тромбоцитов.

После криоконсервирования образ-

цов КТ с применением разных режи-

мов замораживания в 5%-м растворе

ДМСО и 5%-х комбинированных крио-

защитных средах ДМАц/1,2-ПД,

ДМАц/глицерин и ДМАц/ОЭГ

n=5

опре-

делена высокая количественная со-

хранность тромбоцитов (табл. 3). Сме-

на режима замораживания КТ не ока-

cooling was absent (Table 2). During the sample freez-

ing by direct plunging into liquid nitrogen the cooling

rate was 210 degree/min (details of freezing regimen

3 are not presented).

Either presence or absence of the platelets in the

model of cryobiological system (plasma/cryoprotectant)

do not practically affect the parameters of cooling ther-

mogram, enabling to use the obtained experimental data

when analyzing the platelet suspension cryopreserva-

tion results.

After cryopreservation of PC samples using diffe-

rent freezing regimens in 5% DMSO solution and 5%

combined cryoprotective media as DMAc/1,2-PD,

DMAc/glycerol, DMAc/OEG

n = 5

there was established

a high level of platelet number preservation (Table 3).

The change of PC freezing regimen did not significantly

affect the level of platelet number preservation in the

frozen-thawed samples.

The indices of platelet morphofunctional integrity

(ADP-aggregation, HSR and retraction clot rate) de-

pended on cooling parameters such as: cooling rate

within the different temperature ranges, supercooling

rate, duration of crystallization plateau.

The rate of ADP-induced aggregation of platelets,

cryopreserved with combined media was significantly

higher with freezing regimen 2 if compared with the

freezing regimen 1 (Fig. 2), whereas in case of DMSO

the established differences were not similar. The ana-

lysis of typical aggregatograms (Fig. 3) testifies to the

fact that freezing regimen 2 enables to obtain the higher

post-thaw values of platelet aggregation activity: ADP

aggregation rate, initial rate of aggregate formation,

shape changing phase (lag-phase, discosphere transfor-

mation), that indirectrly points to the presence of disco-

cytes in platelet frozen-thawed suspension. The highest

studied parameters were obtained for the DMAc/

OEG

n = 5

cryopreservative.

It was established the dependence of HSR rate

preservation on freezing regimens (Fig. 4). A higher

зывала существенного влияния на результат

количественной сохранности тромбоцитов в декон-

сервированных образцах.

Показатели морфофункциональной полноцен-

ности тромбоцитов – степень АДФ-агрегации, сте-

пень РГШ и ретракции сгустка зависели от таких

параметров охлаждения, как скорость охлаждения

в разных температурных диапазонах, степень

переохлаждения, длительность плато кристалли-

зации.

Степень АДФ-индуцированной агрегации тром-

боцитов, криоконсервированных с комбиниро-

ванными средами, была значительно выше при

режиме замораживания 2 по сравнению с режимом 1

(рис. 2), тогда как для ДМСО подобных различий

не установлено. Анализ типичных агрегатограмм

(рис. 3) свидетельствует о том, что режим замора-

живания 2 позволяет получить после криоконсер-

вирования более высокие параметры агрегацион-

ной активности тромбоцитов: степени АДФ-агре-

гации, начальной скорости образования агрегатов,

фазы изменения формы (lag-фаза) – дискосферо-

трансформации, которая косвенно подтверждает

наличие дискоцитов в суспензии деконсервирован-

ных тромбоцитов. Самые высокие исследуемые пара-

метры получены для криоконсерванта ДМАц/ОЭГ

n = 5

Установлена зависимость сохранности степени

РГШ от режимов замораживания (рис. 4). Для ком-

бинированных криозащитных сред ДМАц/1,2-ПД

и ДМАц/ОЭГ

n=5

большая степень РГШ получена

при использовании режима замораживания 2 (54,9 ±

5,5 и 69,7 ± 11,5% соответственно); ДМСО – режи-

ма 1 (49,0 ± 9,6%). Для криоконсерванта ДМАц/

глицерин подобной зависимости не установлено.

После криоконсервирования образцов КТ с

растворами ДМАц/1,2-ПД, ДМАц/глицерин и

ДМАц/ОЭГ

n = 5

ретракция тромбоцитарного сгуст-

ка была значительно выше при режиме заморажи-

вания 2.

448

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №4

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №4

Рис. 3. Типичные агрегатограммы, полученные при регистрации АДФ-индуцируемой агрегации тромбоцитов до

и после замораживания в парах жидкого азота: а – режим 1; б – режим 2; 1 – ДМАц/1,2-ПД; 2 – ДМАц/глицерин; 3 –

ДМАц/ОЭГ

n=5

; 4 – ДМСО.

Fig. 3. Typical aggregatograms, obtained under recording of ADP-induced platelet aggregation prior to and after freezing

in liquid nitrogen vapors: a – regimen 1; b – regimen 2; 1 – DMAc/1,2-PD; 2 – DMAc/ glycerol; 3 – DMAc/ОEG

n = 5

; 4 –

DMSO.

После замораживания образцов КТ путем пря-

мого погружения контейнеров в жидкий азот

(режим 3) тромбоциты практически полностью

утрачивали агрегационную способность, харак-

теризовались низкой степенью РГШ и ретракции

тромбоцитарного сгустка (см. рис. 2, 4, 5).

Анализ особенностей термограмм двух режи-

мов замораживания и их сопоставление с резуль-

татами криоконсервирования КТ позволяют пред-

положить, что неблагоприятными факторами при

режиме замораживания 1 являются длительное

плато кристаллизации и наличие переохлаждения.

Это подтверждается сходными показателями мор-

фофункциональной полноценности тромбоцитов,

полученными после замораживания образцов КТ

с медленной регулируемой скоростью охлаждения

на программном замораживателе [2]. Криокон-

сервирование КТ с использованием режима замо-

раживания 2 предпочтительнее, так как обеспе-

чивает более высокие показатели морфофункцио-

нальной полноценности тромбоцитов. Полагаем,

что размещение контейнеров с суспензией тромбо-

цитов на укладке в парах жидкого азота при темпе-

ратуре –188…–193°C обеспечивает сильное ло-

кальное охлаждение стенок контейнера, что позво-

ляет в режиме замораживания 2 полностью избе-

гать переохлаждения и способствует быстрому

прохождению плато кристаллизации (1–2,5 мин).

Отметим, что такой прием используется при управ-

лении началом фазового перехода вода-лед для

предотвращения нежелательного переохлаждения

внеклеточной среды [8].

Криоконсервирование тромбоцитов в присут-

ствии ДМСО происходило успешнее при использо-

вании как медленного регулируемого охлаждения

HSR rate in the case of using DMAc/1,2-PD and

DMAc/OEG

n = 5

combined cryoprotective media was

obtained during the use of freezing regimen 2 (54.9 ±

5.5 and 69.7 ± 11.5%, correspondingly); DMSO with

regimen 1 (49.0±9.6%). No similar dependence was

found for DMAc/glycerol cryopreservative.

-0,5

0,5

1,5

2,5

3,5

4,5

0 100 200 300 400 500 600 700

Светопропускание, отн. ед.

Light transmission, relative units

Время, с Time, sec

-0,5

0,5

1,5

2,5

3,5

4,5

0 100 200 300 400 500 600 700

Светопропускание, отн. ед.

Light transmission, relative units

Время, с Time, sec

Рис. 2. Степень агрегации криоконсервированных тром-

боцитов, индуцированной АДФ в зависимости от режи-

ма замораживания (М ± у, n = 5): – режим 1; – режим 2;

– режим 3; #, * – отличия статистически достоверны

по сравнению с соответствующим показателем для режи-

мов 1 и 2 соответственно, Р

< 0,05.

Fig. 2. ADP induced aggregation extent of frozen-thawed

platelets, depending on freezing regimen (М ± у, n=5): –

regimen 1; – regimen 2; – regimen 3; #, * – differences

are statistically significant if compared with corresponding

index for regimens 1 and 2, correspondingly, P

< 0,05.

100

Степень агрегации, %

Aggregation level, %

Контроль

Control

ДМАц/

1,2-ПД

DMAс/

1,2-PD

ДМАц/

глицерин

DMAс/

glycerol

ДМАц/

ОЭГ

n = 5

DMAс/

ОEG

n = 5

ДМСО

DMSO