Журнал - Проблемы криобиологии 2009 №3

Подождите немного. Документ загружается.

321

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹3

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹3

Анализ полученных результатов и данных лите-

ратуры позволяет предположить, что комбини-

рование в среде замораживания проникающего

криопротектора с непроникающим способствует

коррекции криопротекторной эффективности пос-

леднего в положительную сторону вследствие

ослабления осмотического стресса при заморажи-

вании, который налагается концентрированием

непроникающего криопротектора. В данной ситуа-

ции имеет место предотвращение достижения

клетками критически минимального объема,

поэтому барьерная функция мембран не должна

нарушаться. Такие клетки способны выдерживать

гипотонический стресс на конечной стадии быст-

рого размораживания, который является причиной

проявления эффекта “упаковки” в цикле быстрого

замораживания-отогрева.

Выводы

1. В условиях быстрого замораживания-отог-

рева в солевой среде с ПЭГ-1500 или декстраном,

а также в изоосмотической сахарозо-солевой сре-

де выявляется различие степени повреждения

эритроцитов в образцах с низким и высоким гема-

токритом (эффект “упаковки”).

2. Включение в солевую среду с полимерами

ДМСО в концентрации 15% приводит к устранению

эффекта “упаковки”. В то же время при заморажи-

вании в изоосмотической сахарозо-солевой среде

достаточно 5% ДМСО для устранения данного эф-

фекта.

3. Полученные данные показывают, что про-

явление и устранение эффекта “упаковки” зависят

от соотношения в среде замораживания NaCl, про-

никающих и непроникающих криопротекторов. Чем

выше ионная сила среды, тем большая концент-

рация проникающего криопротектора необходима

для устранения эффекта “упаковки”.

penetrative one. In this case the achieving of a critically

minimum volume by cells is prevented, therefore a

barrier function of membranes should not be disor-

dered. These cells are capable to survive a hypotonic

stress at a final stage of rapid freeze-thawing, which

is the reason of “packing” effect manifestation during

freeze-thawing cycle.

Conclusions

1. Under rapid freeze-thawing in saline medium

with PEG-1500 or dextran, as well as in isoosmotic

sucrose-saline one there is found out the difference of

damage extent of erythrocytes in the samples with low

and high hematocrits (“packing” effect).

2. Including 15% DMSO into saline medium with

polymers results in “packing” effect elimination. At

the same time during freezing in isoosmotic sucrose-

saline medium 5% DMSO is sufficient for this effect

elimination.

3. The data obtained show the manifestation and

eli-mination of “package” effect to be dependent on

NaCl, penetrative and non-penetrative cryoprotectant

ratio in freezing medium. The higher is the medium

ionic strength, the bigger concentration of penetrative

cryoprotectant is required to eliminate “packing”

effect.

References

Ashmarin I.P., Vasiliev I.P., Ambrosov V.A. Rapid methods of

statistical processing and experiment planning.– Leningrad:

1975.– 76 p.

Mezhidov S.Kh., Belyaeva I.M., Vorotilin A.M., Moiseyev V.A.

Effect of a combination of polyvinyl pyrrolidone and 1,2-pro-

panediol on the survival of RBC during cryopreservation //

Problems of Cryobiology.– 1996.– N2.– P. 22–25.

Mezhidov S.Kh., Moiseyev V.A. Effect of combined treatment

by highly molecular cryoprotectants and 1,2-propanediol on

survival of red blood cells during cryopreservation // Problems

of Cryobiology.– 1995.– N3.– P. 46–48.

Mikhnovich E.P., Rozhdestvenskaya M.A., Nedel’sky G.T.

Erythrocyte cryopreservation at –196°C with penetrative and

non-penetrative substances // Actual questions of cryo-

biology and cryomedicine.– Kiev: Nauk. dumka, 1974.– P. 161–

164.

Clapisson G., Salinas C., Malacher P. et al. Cryopreservation

with hydroxyethylstarch (HES) + dimethylsulphoxide (DMSO)

gives better results than DMSO alone// Bull Cancer.– 2004.–

Vol. 91, N4.– P. E97–102.

Connor W., Ashwood-Smith M.J. Cryoprotection of mamma-

lian cells in tissue culture with polymers; possible mechanisms//

Cryobiology.–1973.– Vol. 10, N6.– P. 488–496.

Dalgliesh R.J. Effect of an interaction between haematocrit

and cryoprotectant concentration on freeze-thaw haemo-

lysis of bovine erythrocytes// Cryobiology.–1976.–Vol. 13,

N2.–P. 254–257.

Farrant J., Walter C.A., Lee H., McGann L.E. Use of two–

step cooling procedures to examine factors influencing cell

survival following freezing and thawing// Cryobiology.–1977.–

Vol. 14, N4.– P. 273–286.

Литература

Ашмарин И.П., Васильев И.П., Амбросов В.А. Быстрые

методы статистической обработки и планирование экс-

периментов.– Л., 1975.– 76 с.

Межидов С.Х., Беляева И.М., Воротилин А.М., Моисеев В.А.

Влияние сочетания поливинилпирролидона и 1,2–пропан-

диола на сохранность эритроцитов при криоконсерви-

ровании // Пробл. криобиологии.– 1996.– №2.– С. 22–25.

Межидов С.Х., Моисеев В.А. Влияние сочетания высоко-

молекулярных криопротекторов с 1,2–пропандиолом на

сохранность эритроцитов при криоконсервировании//

Пробл. криобиологии.– 1995.– №3.– С. 46–48.

Михнович Е.П., Рождественская М.А., Недельский Г.Т.

Криоконсервация эритроцитов при –196°С с проника-

ющими и непроникающими веществами// Актуальные

вопросы криобиологии и криомедицины.– Киев: Наук.

думка, 1974.– С. 161–164.

322

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹3

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹3

Clapisson G., Salinas C., Malacher P. et al. Cryopreservation

with hydroxyethylstarch (HES) + dimethylsulphoxide (DMSO)

gives better results than DMSO alone// Bull Cancer.– 2004.–

Vol. 91, N4.– P. E97–102.

Connor W., Ashwood-Smith M.J. Cryoprotection of mamma-

lian cells in tissue culture with polymers; possible mechanisms//

Cryobiology.–1973.– Vol. 10, N6.– P. 488–496.

Dalgliesh R.J. Effect of an interaction between haematocrit

and cryoprotectant concentration on freeze-thaw haemo-

lysis of bovine erythrocytes// Cryobiology.–1976.–Vol. 13,

N2.–P. 254–257.

Farrant J., Walter C.A., Lee H., McGann L.E. Use of two–

step cooling procedures to examine factors influencing cell

survival following freezing and thawing// Cryobiology.–1977.–

Vol. 14, N4.– P. 273–286.

Lionetti F.J., Hunt S.M., Gore J.M., Curby W.A. Cryopreser-

vation of human granulocytes// Cryobiology.–1975.–Vol. 12,

N3.– P. 181–191.

Liu K.Y., Dong W.C., Wang Y.L. et al. Study on non–program-

med process using dimethyl sulfoxide and hydroxyethyl

starch as cryoprotectants in cryopreservation of cord blood

hematopoietic cells // Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi.–

2004.–Vol. 12, N5.– P. 670–673.

Levin R.L. The limiting effects of heat and mass transfer on

the osmotic behavior of cells during freezing and thawing //

Cryobiology.–1982.–Vol. 19, N6.– P. 669.

Leibo S.P. Freezing damage of bovine erythrocytes: Simu-

lation using glycerol concentration changes at subzero tempe-

ratures // Cryobiology.–1976.–Vol. 13, N6.– P. 587–598.

Luo K., Wu G., Wang Q. et al. Effect of dimethylsulfoxide

and hydroxyethyl starch in the preservation of fractionated

human marrow cells // Cryobiology.–1994.– Vol. 31, N4.–

P. 349–354.

Maruyama M., Kenmochi T., Sakamoto K. et al. Simplified

method for cryopreservation of islets using hydroxyethyl

starch and dimethyl sulfoxide as cryoprotectants// Transplant.

Proc.– 2004.– Vol. 36, N4.– P. 1133–1134.

Mazur P., Cole K.W. Influence of cell concentration on the

contribution of unfrozen fraction and salt concentration to

the survival of slowly frozen human erythrocytes// Cryobio-

logy.–1985.– Vol.22, N6.– P. 509–336.

Meryman H.T. Cryoprotective agents// Cryobiology.– 1971.–

Vol. 8, N2.– P.173–183.

Meryman H.T. Osmotic stress as a mechanism of freezing

injury// Cryobiology.–1971.– Vol. 8, N5.– P. 489–500.

Morris G.J., Farrant J. Interactions of cooling rate and

protective additive on the survival of washed human erythro-

cytes frozen to –196 degrees C // Cryobiology.–1972.–Vol. 9,

N3.– P. 173–181.

Nei T. Effect of initial of cell concentration of the post-thaw

hemolysis of frozen erythrocytes // Cryobiology.– 1976.– Vol. 13,

N6.– P. 651.

Nei T. Mechanism of hemolysis of erythrocytes by freezing

at near–zero temperatures. 2. Investigations of factors affec-

ting hemolysis by freezing // Cryobiology.–1968.– Vol. 4, N4.–

P. 303–308.

Pegg D.E. The effect of cell concentration on the recovery of

human erythrocytes after freezing and thawing in the pre-sence

of glycerol // Cryobiology.–1981.– Vol. 18, N3.– P. 221–228.

Pegg D.E., Diaper M.P. The packing effect in erythrocyte

freezing // Cryo-Letters.–1983.– Vol.4, N2.– P. 129–136.

Pegg D.E., Diaper M.P., Skaer H.L., Hunt C.J. The effect of

cooling rate and warming rate on the packing effect in human

erythrocytes frozen and thawed in the presence of 2 M gly-

cerol // Cryobiology.–1984.–Vol. 21, N5.– P. 491–502.

Reiners B., Zintl F., Plenert W. Use of human albumin as an

additional cryoprotective agent in freeze preservation of he-

matopoietic stem cells // Folia Haematol Int Mag Klin. Morphol.

Blutforsch.–1987.– Vol. 114, N2.– P. 264–272.

Lionetti F.J., Hunt S.M., Gore J.M., Curby W.A. Cryopreser-

vation of human granulocytes// Cryobiology.–1975.–Vol. 12,

N3.– P. 181–191.

Liu K.Y., Dong W.C., Wang Y.L. et al. Study on non–program-

med process using dimethyl sulfoxide and hydroxyethyl

starch as cryoprotectants in cryopreservation of cord blood

hematopoietic cells // Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi.–

2004.–Vol. 12, N5.– P. 670–673.

Levin R.L. The limiting effects of heat and mass transfer on

the osmotic behavior of cells during freezing and thawing //

Cryobiology.–1982.–Vol. 19, N6.– P. 669.

Leibo S.P. Freezing damage of bovine erythrocytes: Simu-

lation using glycerol concentration changes at subzero tempe-

ratures // Cryobiology.–1976.–Vol. 13, N6.– P. 587–598.

Luo K., Wu G., Wang Q. et al. Effect of dimethylsulfoxide

and hydroxyethyl starch in the preservation of fractionated

human marrow cells // Cryobiology.–1994.– Vol. 31, N4.–

P. 349–354.

Maruyama M., Kenmochi T., Sakamoto K. et al. Simplified

method for cryopreservation of islets using hydroxyethyl

starch and dimethyl sulfoxide as cryoprotectants// Transplant.

Proc.– 2004.– Vol. 36, N4.– P. 1133–1134.

Mazur P., Cole K.W. Influence of cell concentration on the

contribution of unfrozen fraction and salt concentration to

the survival of slowly frozen human erythrocytes// Cryobio-

logy.–1985.– Vol.22, N6.– P. 509–336.

Meryman H.T. Cryoprotective agents// Cryobiology.– 1971.–

Vol. 8, N2.– P.173–183.

Meryman H.T. Osmotic stress as a mechanism of freezing

injury// Cryobiology.–1971.– Vol. 8, N5.– P. 489–500.

Morris G.J., Farrant J. Interactions of cooling rate and

protective additive on the survival of washed human erythro-

cytes frozen to –196 degrees C // Cryobiology.–1972.–Vol. 9,

N3.– P. 173–181.

Nei T. Effect of initial of cell concentration of the post-thaw

hemolysis of frozen erythrocytes // Cryobiology.– 1976.– Vol. 13,

N6.– P. 651.

Nei T. Mechanism of hemolysis of erythrocytes by freezing

at near–zero temperatures. 2. Investigations of factors affec-

ting hemolysis by freezing // Cryobiology.–1968.– Vol. 4, N4.–

P. 303–308.

Pegg D.E. The effect of cell concentration on the recovery of

human erythrocytes after freezing and thawing in the pre-sence

of glycerol // Cryobiology.–1981.– Vol. 18, N3.– P. 221–228.

Pegg D.E., Diaper M.P. The packing effect in erythrocyte

freezing // Cryo-Letters.–1983.– Vol.4, N2.– P. 129–136.

Pegg D.E., Diaper M.P., Skaer H.L., Hunt C.J. The effect of

cooling rate and warming rate on the packing effect in human

erythrocytes frozen and thawed in the presence of 2 M gly-

cerol // Cryobiology.–1984.–Vol. 21, N5.– P. 491–502.

Reiners B., Zintl F., Plenert W. Use of human albumin as an

additional cryoprotective agent in freeze preservation of he-

matopoietic stem cells // Folia Haematol Int Mag Klin. Morphol.

Blutforsch.–1987.– Vol. 114, N2.– P. 264–272.

Rowley S.D., Feng Z., Chen L. et al. A randomized phase III

clinical trial of autologous blood stem cell transplantation

comparing cryopreservation using dimethylsulfoxide vs

dimethylsulfoxide with hydroxyethylstarch// Bone Marrow

Transplant.– 2003.– Vol. 31, N11.– P. 1043–1051.

Stiff P.J., Koester A.R., Weidner M.K. et al. Autologous bone

marrow transplantation using unfractionated cells cryopre-

served in dimethylsulfoxide and hydroxyethyl starch without

controlled-rate freezing// Blood.–1987.– Vol. 70, N4.– P. 974–

978.

Stiff P.J., Murgo A.J., Zaroulis C.G. et al. Unfractionated

human marrow cell cryopreservation using dimethylsulfoxide

and hydroxyethyl starch// Cryobiology.–1983.–Vol. 20, N1.–

P. 17–24.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

24.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

24.

25.

26.

27.

323

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹3

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹3

Rowley S.D., Feng Z., Chen L. et al. A randomized phase III

clinical trial of autologous blood stem cell transplantation

comparing cryopreservation using dimethylsulfoxide vs

dimethylsulfoxide with hydroxyethylstarch// Bone Marrow

Transplant.– 2003.– Vol. 31, N11.– P. 1043–1051.

Stiff P.J., Koester A.R., Weidner M.K. et al. Autologous bone

marrow transplantation using unfractionated cells cryopre-

served in dimethylsulfoxide and hydroxyethyl starch without

controlled–rate freezing// Blood.–1987.– Vol. 70, N4.– P. 974–

978.

Stiff P.J., Murgo A.J., Zaroulis C.G. et al. Unfractionated

human marrow cell cryopreservation using dimethylsulfoxide

and hydroxyethyl starch// Cryobiology.–1983.–Vol. 20, N1.–

P. 17–24.

Wagner C.T., Burnett M.B., Livesey S.A., Connor J. Red blood

cell stabilization reduces the effect of cell density on recovery

following cryopreservation // Cryobiology.–2000.–Vol. 41,

N3.–P. 178–194.

Wagner C.T., Martowicz M.L., Livesey S.A., Connor J. Bio-

chemical stabilization enhances red blood cell recovery and

stability following cryopreservation // Cryobiology.– 2002.–

Vol. 45, N2.– P. 153–166.

Woolgar A.E. Hemolysis of human red blood cells by freezing

and thawing in solutions containing sucrose: relationship with

posthypertonic hemolysis and solute movements // Cryobiolo-

gy.–1974.– Vol. 11, N1.– P. 44–51.

Поступила 14.07.2008

Рецензент Н.Г. Землянских

Wagner C.T., Burnett M.B., Livesey S.A., Connor J. Red blood

cell stabilization reduces the effect of cell density on recovery

following cryopreservation// Cryobiology.–2000.–Vol. 41,

N3.–P. 178–194.

Wagner C.T., Martowicz M.L., Livesey S.A., Connor J. Bio-

chemical stabilization enhances red blood cell recovery and

stability following cryopreservation // Cryobiology.– 2002.–

Vol. 45, N2.– P. 153–166.

Woolgar A.E. Hemolysis of human red blood cells by freezing

and thawing in solutions containing sucrose: relationship with

posthypertonic hemolysis and solute movements // Cryobiolo-

gy.–1974.– Vol. 11, N1.– P. 44–51.

Accepted in 14.07.2008

25.

26.

27.

28.

29.

30.

28.

29.

30.

324

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹3

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹3

* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:

ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.:+38

(057) 373-30-07, факс: +38 (057) 373-30-84, электронная почта:

cryo@online.kharkov.ua

* To whom correspondence should be addressed: 23,

Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373

3007, fax: +380 57 373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua

Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-

tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine

Институт проблем криобиологии и криомедицины

НАН Украины, г. Харьков

УДК 612.111.7:615.014.41

О.А. БОГДАНЧИКОВА, А.М. КОМПАНИЕЦ*

Криоконсервирование тромбоцитов.

1. Разработка криоконсервантов на основе комбинаций

криопротекторов и исследование их эффективности

UDC 612.111.7:615.014.41

O.A. BOGDANCHIKOVA, A.M. KOMPANIETS*

Platelet Cryopreservation.

1. Development of Cryopreservative Solutions,

Based on Cryoprotectant Combination and Study of Their Efficiency

В работе исследована криозащитная эффективность криоконсервантов на основе комбинаций различных криопротекторов

при замораживании тромбоцитов. Установлены комбинации криопротекторов: 10% диметилацетамид (ДМАЦ)/1,2-пропандиол,

ДМАЦ/глицерин и ДМАЦ/ оксиэтилированный глицерин (n = 5), которые значительно повышают сохранность крио-

консервированных тромбоцитов по сравнению с результатами замораживания под защитой монокриопротекторных сред,

содержащих одно из перечисленных веществ, в том числе 10% диметилсульфоксида.

Ключевые слова: тромбоциты, криоконсервирование, комбинированные криозащитные среды, агрегация, реакция на

гипотонический шок, ретракция тромбоцитарного сгустка.

В роботі досліджено кріозахисну ефективність кріоконсервантів на основі комбінацій різних кріопротекторів при

заморожуванні тромбоцитів. Визначено комбінації кріопротекторів: 10% диметилацетамід (ДМАЦ)/1,2-пропандіол, ДМАЦ/

гліцерин і ДМАЦ/оксиетильований гліцерин (n = 5), що дозволяють підвищити збереженість кріоконсерваних тромбоцитів в

порівнянні з результатами заморожування під захистом монокріопротекторних середовищ, що містять одну з зазначених

речовин, включаючи 10% диметилсульфоксиду.

Ключові слова: тромбоцити, кріоконсервування, комбіновані кріозахисні середовища, агрегація, реакція на гіпотонічний

шок, ретракція тромбоцитарного згустку.

Cryoprotective efficiency of cryopreservative solutions, based on combining different cryoprotectants during platelet freezing,

was studied in the research. There were established the cryoprotectant combinations such as: 10% dimethyl acetamide (DMAC)/1,2-

propane diol (1,2-PD), DMAC/glycerol and DMAC/oxyethylated glycerol (n = 5), significantly increasing the integrity of cryopreserved

platelets, compared to the results of freezing under protection of monocryoprotective media, containing one of the mentioned above

substances, including 10% dimethyl sulfoxide.

Key-words: platelets, cryopreservation, combined cryoprotective solutions, aggregation, hypotonic shock reaction, platelet clot

retraction.

Трансфузии концентратов тромбоцитов (КТ) яв-

ляются эффективным методом лечения и профи-

лактики геморрагических осложнений, обусловлен-

ных снижением количества тромбоцитов (тромбо-

цитопения) или их дисфункцией (тромбоцитопатия)

[1, 3, 6, 19, 28].

Систематическое применение трансфузий

тромбоцитов, начавшееся в 60-е годы ХХ столетия

благодаря разработке методов получения КТ с

помощью пластикатных контейнеров, имело чрез-

вычайно важное значение для клинической меди-

цины, поскольку впервые решало проблему купиро-

вания тромбоцитопенических геморрагий, являв-

шихся причиной 60–70% летальных исходов у

больных с гемобластозами и депрессиями крове-

творения [22, 23]. Последующие годы отмечены

Transfusions of platelet concentrates (PCs) are

efficient methods in treatment and prevention of hemor-

rhagic complications, stipulated by either decreased

platelet count (thrombocytopenia) or their dysfunction

(thrombocytopathy) [1, 3, 6, 19, 28].

Systematic application of platelet transfusions, star-

ting in the 60s of 20

century due to designing the me-

thods for obtaining the PC in plastic containers, was

of great importance for clinical medicine, since for the

first time it solved the problem of thrombocytopenic

hemorrhage arresting, being the cause of 60–70%

lethal outcomes in patients with hemoblastoses and

hemopoietic depressions [22, 23]. The following years

were marked by a constant augmentation of needs of

clinics in this transfusion medium and to the beginning

of 21

century the number of PCs transfusions was

325

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹3

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹3

постоянным увеличение потребностей лечебных

учреждений в этой трансфузионной среде и к

началу ХХI столетия число трансфузий КТ нас-

только возросло, что их обеспечение стало огром-

ной нагрузкой для банков крови во всем мире [2,

11, 29]. Только в США с 1971 по 1980 годы число

переливаний КТ увеличилось с 410 тыс. до 2 млн

860 тыс. в год [30], а в 2001 году составило 10 млн

196 тыс. [29]. Подобная динамика прослеживается

в отчетах банков крови европейских стран.

Причины такого интенсивного роста кроются в

том, что трансфузии тромбоцитов позволили не

только значительно снизить летальность, обуслов-

ленную тромбоцитопеническим геморрагическим

синдромом у больных с различной патологией

(гемобластозы, апластическая анемия, злокачест-

венные новообразования, лучевая болезнь и т. д.),

но и сделали возможным проведение в полном

объеме противоопухолевой терапии, в том числе в

период выраженной депрессии кроветворения;

способствовали разработке и совершенствованию

интенсивных лечебных программ в гематологии,

онкологии, трансплантологии; проведению опера-

тивных вмешательств в сердечно-сосудистой хи-

рургии, ортопедии, травматологии и т. д. [3, 6, 26,

33, 34].

Тем не менее, и в наши дни проведение транс-

фузии КТ, особенно в экстренных случаях, сопря-

жено с определенными трудностями, в первую

очередь, из-за отсутствия эффективных методов

их долгосрочного хранения. В связи с широким

использованием переливания тромбоцитов возник-

ли серьезные проблемы: развитие аллоиммуни-

зации и рефрактерности больных к трансфузиям

КТ, риск передачи опасных гемотрансмиссивных

инфекций (вирусные гепатиты, ВИЧ и др.), развитие

трансфузионных реакций и осложнений [10, 13, 25,

27]. Решению этих проблем могли бы способство-

вать криоконсервирование и долгосрочное хране-

ние тромбоцитов, которые позволили бы при необ-

ходимости проводить дополнительное обследо-

вание на наличие возбудителей инфекционных

заболеваний, исключить возможность бактериаль-

ной контаминации при хранении, создать банки

аутологичных, а также HLA- и HPA-типированных

аллогенных тромбоцитов, транспортировать КТ на

большие расстояния и т. д. [28, 33, 34].

Работы по созданию методов криоконсервиро-

вания тромбоцитов для клинической практики,

ведущиеся уже около 50 лет, оказались не столь

успешными, как других клеток и тканей. В настоя-

щее время существуют методы замораживания

КТ с криопротекторами диметилсульфоксидом

(ДМСО) [2, 14, 31, 32], диметилацетамидом

(ДМАЦ) [1, 3], глицерином [8, 14, 31], 1,2-пропандио-

лом (1,2-ПД) [3, 5, 8, 15]. В качестве криопротекто-

such increased, that their providing became a huge

charge for blood banks around the world [2, 11, 29].

Only in the USA from 1971 to 1980 the number of PC

transfusion augmented from 410 thousand to 2 million

860 thousand per year [30], but in 2001 it made 10

million 196 thousand [29]. The same dynamics is traced

in the reports of European blood banks.

The reasons of such an intensive growth are in the

fact, that platelet transfusions enabled not only to

significantly decrease the lethality, stipulated by throm-

bocytopenic hemorrhagic syndrome in patients with

different pathology (hemoblastoses, aplastic anemia,

malignant neoplasms, radiation sickness, etc.), but

made it possible to perform a full-scale antitumoral

therapy, including the period of manifested hemopoietic

depression as well; contributed to the designing and

optimising of intensive treatment programs in hema-

tology, oncology, transplantology; performance of

cardio-vascular, orthopedic and traumatological surge-

ries, etc. [3, 6, 26, 33, 34].

However, nowadays the performance of PC trans-

fusion, especially in case of emergency is associated

to certain complications, first of all, because of the

absence of any efficient methods for their long-term

storage. Due to the wide utilisation of platelet transfu-

sion a serious problems arise such as: development of

patients’ alloimmunisation and refractoriness to PC

transfusions, the risk to transmit dangerous hemotrans-

missive infections (viral hepatitis, HIV etc.), develop-

ment of transfusion reactions and complications [10,

13, 25, 27]. Cryopreservation and long-term storage

of platelets, which would enable, if necessary, to per-

form an additional examination for the presence of

infectious agents; to exclude the possibility of bacterial

contamination during storage; to establish banks of

autologous, as well as HLA- and HPA-matched allo-

genic platelets; to transport PCs for long distances etc.,

might contribute to solve these problems [28, 33, 34].

The researches on designing the methods for

platelet cryopreservation in clinical practice, being im-

plemented nearly within 50 years, occurred to be not

so successful as for the other cells and tissues. Nowa-

days there are the methods of PCs’ freezing with dime-

thyl sulfoxide (DMSO) [2, 14, 31, 32], dimethyl

acetamide (DMAC) [1, 3], glycerol [8, 14, 31], 1,2-

propane diol (1,2-PD) [3, 5, 8, 15] cryoprotectants. As

cryoprotectants were studied many other compounds,

including non-penetrative ones: dextran, hydroxyethy-

lated starch [31] etc. However the cryopreserved pla-

telets do not find a wide application in medical prac-

tice because of their low therapeutic efficiency (30–

40% of corresponding index for fresh PCs) [1, 26, 33,

34].

However, the interest of researchers to this compli-

cated problem has significantly increased [15, 22], but

still focused to optimising conditions for platelet freezing

326

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹3

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹3

ров исследованы многие другие соединения, в том

числе непроникающие – декстран, гидроксиэти-

лированный крахмал [31] и т. д. Однако криоконсер-

вированные тромбоциты не находят широкого при-

менения в лечебной практике из-за их низкой ле-

чебной эффективности (30–40% от соответствую-

щего показателя для свежевыделенных КТ) [1, 26,

33, 34].

Вместе с тем интерес исследователей к этой

сложной проблеме значительно повышается [15,

22], хотя по-прежнему в основном сконцентрирован

на оптимизации условий замораживания тромбоци-

тов с ДМСО – “золотым стандартом” методов

криоконсервирования КТ [17, 21, 33].

Анализ многочисленных публикаций и наш опыт

работы позволяют прийти к заключению, что воз-

можности оптимизации результатов криоконсерви-

рования КТ на основании применения какого-то од-

ного из криопротекторов, по-видимому, себя исчер-

пали [4, 21].

Цель исследования – разработка криоконсер-

вантов для замораживания тромбоцитов на основе

комбинаций различных криопротекторов, исследо-

вание их цитотоксичности и криозащитной эффек-

тивности.

Материалы и методы

Концентрат тромбоцитов для исследований

выделяли из отдельных доз донорской крови,

заготовленной на консерванте “Глюгицир”, мето-

дом из лейкотромбоцитарного слоя с использова-

нием рефрижераторных центрифуг и системы

пластикатных контейнеров (“Гемакон” и “Компо-

пласт”) [3]. Донорскую кровь до выделения КТ

хранили в течение 8–10 ч при температуре 20°C

до получения результатов обследования дозы на

наличие инфекций. Перед проведением исследова-

ний по криоконсервированию КТ сохраняли при

22±2°C в течение 12–16 ч при постоянном переме-

шивании на автоматической мешалке со скорос-

тью 2 об/мин.

В работе использованы криопротекторы ДМСО,

ДМАЦ, 1,2-ПД, глицерин и оксиэтилированный

глицерин со степенью полимеризации n=5 (ОЭГ

n=5), очищенные и идентифицированные в ИПКиК

НАН Украины.

Исследование влияния ограждающих раство-

ров на функциональные свойства тромбоцитов на

этапе экспозиции проведено с растворами, содер-

жащими следующие комбинации криопротекторов:

ДМАЦ/1,2-ПД, ДМАЦ/ОЭГ n=5, ДМАЦ/глицерин,

1,2-ПД/глицерин, 1,2-ПД/ОЭГ n=5 (5, 10 и 15%-е

начальные суммарные концентрации криопротек-

торов в плазме при их соотношении 1:1), а также

растворы, содержащие 10%-е концентрации выше-

перечисленных комбинаций криопротекторов в

with DMSO, the “golden standard” of PCs cryopreser-

vation methods [17, 21, 33].

Analysis of numerous publications and our expe-

rience enable concluding about the fact, that the possi-

bilities to optimise the results of PCs cryopreservation,

based on applying one of cryoprotectants, probably

exhausted themselves [4, 21].

The aim of research was to develop the cryopreser-

vative solutions for platelet freezing, based on combi-

ning different cryoprotectants, study of their cyto-

toxicity and cryoprotective efficiency.

Materials and methods

Platelet concentrate for research was isolated from

separated doses of donor blood, collected in “Glygi-

cir” anticoagulant, by buffy-coat method, using refri-

gerate centrifuges and system of plastic containers

(“Hemakon”, “Kompoplast”) [3]. Donor blood prior

to PCs isolation was stored within 8–10 hrs at 20°C

up to obtaining results of dose examination for infection

presence. Before performing researches on cryopre-

servation, the PCs were stored at 22±2°C within 12–

16 hrs at a constant mixing with automatic agitator

with 2 rot/min rate.

DMSO, DMAC, 1,2-PD, glycerol and oxyethylated

glycerol with polymerisation degree n=5 (OEG n=5),

purified and identified at the Institute for Problems of

Cryobiology and Cryomedicine of the National Acade-

my of Sciences of Ukraine, were used in the research.

The effect of protective solutions on platelet functio-

nal properties at the exposure stage was studied using

the solutions, containing the following combinations of

cryoprotectants: DMAC/1,2-PD, DMAC/OEG n=5,

DMAC/glycerol, 1,2-PD/glycerol, 1,2-PD/OEG n=5 (5,

10 and 15% initial total cryoprotectant concentrations

in plasm at the ratio 1:1), as well as the solutions,

comprising 10% concentrations of the mentioned above

combinations in 1:3 and 3:1 ratio. Exposure time of

PCs samples with solutions was 15, 30 and 60 min.

During PCs freezing there were studied the

cryoprotective solutions of following composition:

DMAC/1,2-PD, DMAC/OEG n=5, DMAC/glycerol,

1,2-PD/glcyerol, 1,2-PD/OEG n=5 (5, 10 and 15% total

cryoprotectant concentrations in plasma). The studied

solutions under a constant agitating were slowly mixed

with PCs samples in 1:1 ratio, the exposure time before

freezing was 15, 30 and 60 min. In order to additionally

control the efficiency of combined cryoprotective solu-

tions, the PCs samples were frozen in a parallel way

with DMSO, DMAC, 1,2-PD, glycerol and OEG n=5,

10% cryoprotectant concentration in plasma after

30 min exposure.

Platelet concentrates were frozen in rectangular

polymer containers (on fluoroplastic base) (30×100 mm

size, 10 ml capacity). Containers with PCs samples

were placed horizontally on a foam platform, situated

327

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹3

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹3

соотношении 1:3 и 3:1. Время экспозиции образцов

КТ с растворами – 15, 30 и 60 мин.

При замораживании КТ исследованы ограж-

дающие растворы следующего состава: ДМАЦ/

1,2-ПД, ДМАЦ/ОЭГ n=5, ДМАЦ/глицерин, 1,2-ПД/

глицерин, 1,2-ПД/ОЭГ n=5 (5, 10 и 15%-е суммар-

ные концентрации криопротекторов в плазме). Ис-

следуемые растворы медленно при постоянном пе-

ремешивании смешивали с образцами КТ в

соотношении 1:1, время экспозиции перед замора-

живанием – 15, 30 и 60 мин. Для дополнительного

контроля эффективности комбинированных

ограждающих растворов образцы КТ параллельно

замораживали с ДМСО, ДМАЦ, 1,2-ПД, глицери-

ном и ОЭГ n=5: концентрация криопротекторов в

плазме составляла 10%, экспозиция – 30 мин.

Образцы КТ замораживали в полимерных

контейнерах (на основе фторопласта) прямоуголь-

ной формы (размеры 30×100 мм, вместимость

10 мл). Контейнеры с образцами КТ размещали

горизонтально на пенопластовой платформе, распо-

ложенной на поверхности азота, выдерживали на

платформе 15 мин, затем погружали в жидкий азот.

Изменение температуры в замораживаемых

образцах КТ определяли с помощью медь-конс-

тантановой термопары, рассчитанная скорость

охлаждения на разных этапах – от 16 до 30°С/мин.

Контейнеры с замороженными образцами КТ хра-

нили в жидком азоте от 24 ч до 1 года.

Образцы отогревали на водяной бане при 37°С

при постоянном покачивании.

После размораживания подсчитывали коли-

чество восстановленных тромбоцитов в образцах

[10]. Сохранность функциональной активности

криоконсервированных КТ оценивали после уда-

ления криопротекторов из суспензии тромбоцитов

методом [12] по следующим параметрам in vitro:

реакция на гипотонический шок (РГШ) [3], АДФ-

и коллаген-индуцированная агрегации (фотомет-

рический метод) [18], ретракция сгустка. Получен-

ные результаты измерений выражали в процентном

соотношении к соответствующим показателям для

свежевыделенных КТ.

Величины РГШ и агрегации измеряли на анали-

заторе “Colysagraph” (США) с графической регис-

трацией процесса на самописце “Endim” 622.01

(Германия). В работе использовали следующие

индукторы агрегации: растворы АДФ (конечная

концентрация 200 мкМ, “Serva”, США) и коллагена

(конечная концентрация 20 мг/мл, “Технология-

СТАНДАРТ”, Беларусь).

Ретракцию тромбоцитарного сгустка определя-

ли следующим образом: к 1 мл суспензии тром-

боцитов, содержащей 1×10

/мкл, вводили 0,1 мл

5%-го СаCl

, тщательно перемешивали и помеща-

ли в термостат (37°С). Через 1 ч измеряли объем

on nitrogen surface, exposed for 15 min on platform,

then immersed into liquid nitrogen.

Temperature change in PCs frozen samples was

determined using a copper-constantan thermocouple,

the calculated cooling rate at various stages was from

16 to 30°C/min. Containers with PCs frozen samples

were stored in liquid nitrogen from 24 hrs to 1 year.

Samples were thawed on water bath at 37°C at a

constant shaking.

After freeze-thawing the number of recovered

platelets in samples was calculated [10]. The integrity

of functional activity of cryopreserved PCs was esti-

mated after cryoprotectant removal from platelet sus-

pension according to the method [12] by the following

parameters in vitro: hypotonic shock reaction (HSR)

[3], ADP- and collagen-induced aggregation (photo-

metric method) [18], clot retraction. The obtained

measurement results were expressed in percentage

to the corresponding indices for fresh PCs.

HSR and aggregation values were measured with

“Colysagraph” analyser (USA) with graphic registering

of process with “Endim” 622.01 plotter (Germany).

The following aggregation inducers such as: ADP (200

µM final concentration, “Serva”) and collagen solutions

(20 mg/ml final concentration, “Tekhnologiya-STAN-

DART”, Belarus), were used in the research.

Platelet clot retraction was determined as follows:

0.1 ml 5% CaCl

was injected to 1 ml of suspension,

containing 1×10

/µl platelet, thoroughly mixed and

placed into thermostat (37°C). The retracted plasma

volume was measured in 1 hr. Retractile activity was

manifested in percentage ratio of retracted plasm volu-

me to total volume of studied platelet suspension

(1.1 ml).

Obtained results were statistically processed with

Microsoft Excel software using Student criterion.

Results and discussion

Extreme platelet sensitivity to different effects,

especially to the one of chemical substances, signifi-

cantly limits the cryoprotectant range and that of their

concentrations, used under freezing. Despite all the

cryoprotectants, involved in the research, are studied

in details [1, 2, 4, 7, 14, 15, 17, 31], this is complicated

to forecast the platelet integrity after exposure with

the solutions, containing the combinations of compounds

with different chemical origin (amides, polyols),

differing by physical and chemical parameters,

penetration rate through cell membrane, etc.

In order to estimate the effect character of com-

bined cryoprotective solutions on platelet functional

properties at the exposure stage there were selected

two parame-ters: platelet aggregation degree, induced

by ADP and collagen and HSR value. These para-

meters are informative and adequate criteria, indirectly

characterising the integrity of hemostatic function of

328

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹3

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹3

ретрагированной плазмы. Ретрактильную актив-

ность выражали в процентном соотношении объе-

ма ретрагированной плазмы к общему объему ис-

следуемой взвеси тромбоцитов (1,1 мл).

Статистическую обработку полученных резуль-

татов проводили с помощью программы Microsoft

Excel с применением критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Чрезвычайная чувствительность тромбоцитов

к разным воздействиям, особенно к действию

химических веществ, существенно ограничивает

спектр криопротекторов и диапазон их концентра-

ций, используемых при замораживании. И хотя все

задействованные в работе криопротекторы де-

тально изучены [1, 2, 4, 7, 14, 15, 17, 31], сложно

спрогнозировать сохранность тромбоцитов после

экспозиции с растворами, содержащими комбина-

ции соединений различной химической природы

(амиды, полиолы), отличающиеся физико-хими-

ческими параметрами, скоростью проникновения

через клеточную мембрану и др.

Для оценки характера воздействия комбиниро-

ванных растворов криопротекторов на функцио-

нальные свойства тромбоцитов на этапе экспози-

ции выбраны два параметра: степень агрегации

тромбоцитов, индуцированная АДФ и коллагеном,

и величина РГШ. Эти параметры являются

информативными и адекватными критериями, кос-

венно характеризующими сохранность гемоста-

тической функции тромбоцитов (агрегация) и их

способность циркулировать в кровяном русле

после переливания (РГШ) [20].

Установлено, что в результате экспозиции об-

разцов КТ с исследуемыми растворами криопро-

текторов показатели агрегации и РГШ тромбоци-

тов снижаются (табл.1 и 2). Степень их изменения

определяется концентрацией криопротекторов и

временем экспозиции с ними. Так, после 15 и 30-

минутной экспозиции образцов КТ с 5%-ми концен-

трациями криопротекторов в растворах снижение

величины агрегации и РГШ было недостоверным

по сравнению со свежевыделенными тромбоцита-

ми. Значительное уменьшение величины исследуе-

мых параметров было получено для 15%-х кон-

центраций криопротекторов в растворах, а также

для всех исследуемых концентраций криопротекто-

ров при времени экспозиции 60 мин. Наименьшее

влияние на показатели агрегации оказывали раст-

воры, содержащие комбинацию 1,2-ПД/глицерина,

кроме того, отмечена активация агрегации тромбо-

цитов после экспозиции с данной средой (табл.1).

Оценка влияния различных соотношений крио-

протекторов в комбинированных растворах (1:1, 3:1

и 1:3, суммарная концентрация криопротекторов

10%) на показатели агрегации и РГШ после 30-ми-

platelets (aggregation) and their capability to circulate

in blood after transfusion (HSR) [20].

As a result of PCs samples’ exposure with the

studied cryoprotective solutions the indices of platelet

aggregation and HSR were established to reduce

(Table 1 and 2 ). The extent of their change is deter-

mined by cryoprotectant concentration and exposure

time with them. Thus, after 15 and 30 min exposure of

PCs samples with 5% cryoprotectant concentrations

in solutions a decrease in aggregation and HSR values

was statistically insignificant compared to the freshly

isolated platelets. A significant reduction of the value

of studied parameters was obtained for 15% cryopro-

tectant concentrations in solutions, as well as for all

the studied cryoprotectant concentrations at 60 min

exposure time. The solutions, containing 1,2-PD/glyce-

rol combination, caused the lowest effect on aggrega-

tion indices, in addition there was noted the activation

of platelet aggregation after exposure with this medium

(Table 1).

The estimation of different cryoprotectant ratio

effect in combined solutions (1:1, 3:1 and 1:3, 10% total

concentration of cryoprotectants) on the aggregation

and HSR indices after 30 min exposure enabled estab-

lishing the tendency to decrease in these parameters

when augmenting DMAC and OEG n=5 concen-

trations in solutions up to 7.5% (Fig. 1). The data obtai-

ned testify to the fact, that DMAC and OEG n=5

significantly contribute to suppressing the platelet func-

tional activity, as for glycerol, it occurs in a less extent

and quite insignificant changes proceed under 1,2-PD

effect.

When comparing the data obtained with the results

of studying the effect of some cryoprotectants

(DMAC, 1,2-PD, glycerol, OEG n=5 etc.) on aggre-

gation, HSR and other parameters of platelet morpho-

functional integrity at exposure stage [4, 5, 7, 8], the

cryoprotectant combination in cryoprotective solution

was noted as not potentiating their toxic effect on the

studied parameters.

Cryoprotective efficiency of combined solutions

under platelet freezing was estimated by the complex

of viability criteria in vitro: platelet number in a sample,

indices of aggregation, HSR and platelet clot retraction.

High level of platelet number recovery in PCs samp-

les after freeze-thawing was provided by the following

solutions: DMAC/1,2-PD, DMAC/glycerol and

DMAC/OEG n=5 (Table 3). For the solutions, contai-

ning the combination of 1,2-PD/glycerol and 1,2-PD/

OEG n=5 there were found out the significant losses

in blood platelets after freeze-thawing.

The highest integrity level of ADP- and collagen-

induced aggregation, HSR and platelet clot retraction

indices was obtained when freezing PCs with the

solutions, containing DMAC/1,2-PD, DMAC/glycerol

and DMAC/OEG n=5 combinations in 10% total

329

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹3

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹3

нутной экспозиции позволила установить тенден-

цию к снижению этих параметров при увеличении

концентраций ДМАЦ и ОЭГ n=5 в растворах до

7,5% (рис. 1). Полученные данные свидетельст-

вуют о том, что значительный вклад в подавление

функциональной активности тромбоцитов вносят

ДМАЦ и ОЭГ n=5, в меньшей степени – глицерин,

незначительно – 1,2-ПД.

При сравнении полученных данных с результа-

тами изучения влияния отдельных криопротек-

Таблица 1. Агрегация тромбоцитов после экспозиции с растворами,

содержащими комбинации криопротекторов, М±σ, n=5

Table 1. Platelet aggregation after exposure with solutions,

containing cryoprotectant combinations, M±σ, n=5

Примечания: * – отличия статистически достоверны по сравнению с соответствующим показателем для свежевыделенных

КТ, р<0,05;

– отличия статистически достоверны по сравнению с соответствующим показателем для ДМСО, р<0,05.

Notes: * – differences are statistically significant compared to the corresponding index for fresh PCs, p<0.05;

– differences are

statistically significant compared to the corresponding index for DMSO, p<0.05.

concentration (Fig. 2 and 3). Combined solutions with

5% total cryoprotectant concentration are charac-

terised by a low level of cryoprotective effect, insuffi-

cient for PCs freezing. With an increase in a total

cryoprotective concentration in DMAC/1,2-PD and

DMAC/glycerol solutions up to 15%, the level of PCs

samples’ integrity augmented, compared to the data

for 5% solutions. The results of PCs integrity for 15%

DMAC/OEG n=5 are statistically and significantly

lower, than the ones for PCs freezing with 10% con-

ватсоС

огонтищазоирк

аровтсар

fonoitisopmoC

evitcetorpoyrc

noitulos

яанраммуС

яицартнецнок

,вороткеторпоирк

noitartnecnoclatoT

,stnatcetorpoyrcfo

%,яицагергА

%,noitagerggA

)Мкм002(ФДА

002(PDA µ )M

)лм/гм02(негаллоK

)lm/gm02(negalloC

ним,иицизопскэямерВ

nim,emitnoitisopxE

510306510306

ОСМД

OSMD

55±496±09 * 11±28 * 6±596±3931±98 *

0101±198±788±18 * 5±498±199±48 *

515±97 * 7±97 * 5±57 * 7±4821±38 * 01±57 *

2,1/ЦАМД - ДП

2,1/CAMD - DP

57±498±598±887±497±698±19

016±698±7931±989±798±79 * 4±28 *

516±58 * 9±38 * 9±77 * 8±889±786±97 *

нирецилг/ЦАМД

lorecylg/CAMD

55±499±098±38 * 4±3901±193±97 *

016±097±58 * 6±77 * 7±198±093±48 *

516±58 * 6±08 * 6±27 * 4±58 * 4±08 * 11±27 *

5=nГЭО/ЦАМД

5=nGEO/CAMD

57±497±296±08 * 7±496±298±28 *

014±09 * 7±499±77 * 0,8±199±2911±18

517±08 * *9±677±86 * 5±38 * 7±87 * 9±86 *

2,1 - нирецилг/ДП

2,1 - lorecylg/DP

54±7901±1016±497±799±2014±09 *

017±898±3013±39 *

01±5911±901

11±09

5101±3921±696±58 *

8±7931±999±98

2,1 - 5=nГЭО/ДП

2,1 - 5=nGEO/DP

55±099±198±88 * 4±594±4911±78

016±195±29 * 2±38 * 7±496±297±78 *

515±78 * 7±08 * 8±97 * 7±889±787±28 *

330

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹3

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹3

торов (ДМАЦ, 1,2-ПД, глицерин,

ОЭГ n=5 и др.) на агрегацию,

РГШ и другие параметры морфо-

функциональной полноценности

тромбоцитов на этапе экспозиции

[4, 5, 7, 8] отмечено, что сочета-

ние криопротекторов в ограждаю-

щих растворах не потенцирует их

токсическое действие на иссле-

дуемые параметры.

Криозащитную эффективность

комбинированных растворов при

замораживании тромбоцитов оце-

нивали по комплексу критериев

in vitro жизнеспособности: коли-

чество тромбоцитов в образце, по-

казатели агрегации, РГШ и ре-

тракции тромбоцитарного сгуст-

ка.

Высокий уровень восстанов-

ления количества тромбоцитов в

образцах КТ после разморажива-

ния обеспечивали растворы:

ДМАЦ/1,2-ПД, ДМАЦ/глицерин и

ДМАЦ/ОЭГ n=5 (табл. 3). Для

растворов, содержащих комбина-

цию криопротекторов 1,2-ПД/гли-

церин и 1,2-ПД/ОЭГ n=5 выявлены

значительные потери кровяных

пластинок после размораживания.

Наиболее высокий уровень со-

хранности показателей АДФ- и кол-

лаген-индуцированной агрегации,

РГШ и ретракции тромбоцитов

получен при замораживании КТ с

растворами, содержащими комби-

нации ДМАЦ/1,2-ПД, ДМАЦ/

глицерин и ДМАЦ/ОЭГ n=5 в

10%-й суммарной концентрации

(рис. 2 и 3). Комбинированные

растворы с 5%-й суммарной кон-

центрацией криопротекторов, ха-

рактеризуются низким уровнем

криозащитного действия, недоста-

точным для замораживания КТ. С

увеличением суммарной концент-

ватсоС

огонтищазоирк

аровтсар

fonoitisopmoC

evitcetorpoyrc

noitulos

яанраммуС

,ПKяицартнецнок

noitartnecnoclatoT

%,APCfo

%,ШГР

%,RSH

ним,иицизопскэямерВ

nim,mretnoitisopxE

510306

ОСМД

OSMD

57±496±393±58 *

01±98 *5 5±78 * 6±57 *

514±18 * 6±18 * 4±47 *

2,1/ЦАМД - ДП

2,1/CAMD - DP

511±397±593±29

016±19 * 7±398±58 *

5101±689±684±97 *

нирецилг/ЦАМД

lorecylg/CAMD

55±298±194±58 *

018±2911±095±58 *

516±38 * 8±384±97 *

5=nГЭО/ЦАМД

5=nGEO/CAMD

53±298±395±88 *

016±88 * 8±099±08 *

515±28 * 6±08 * 6±57 *

2,1 - нирецилг/ДП

2,1 - lorecylg/DP

56±297±598±88

016±399±497±78 *

513±78 * 6±68 * 6±97 *

2,1 - 5=nГЭО/ДП

2,1 - 5=nGEO/DP

54±68 * 3±98 * 01±68 *

016±38 * 6±48 * 4±18 *

514±38 * 3±08 * 2±87 *

Примечания: * – отличия статистически достоверны по сравнению с соответ-

ствующим показателем для свежевыделенных КТ, р<0,05;

– отличия статистически

достоверны по сравнению с соответствующим показателем для ДМСО, р<0,05.

Notes: * – differences are statistically significant compared to the corresponding index

for fresh PCs, p<0.05; # – differences are statistically significant compared to the

corresponding index for DMSO, p<0.05.

Таблица 2. РГШ тромбоцитов после экспозиции с растворами,

содержащими комбинации криопротекторов, М±σ, n=5

Table 2. Platelet HSR after exposure with solutions,

containing cryoprotectant combinations, M±σ, n=5.

рации криопротекторов в растворах ДМАЦ/1,2-ПД

и ДМАЦ/глицерин до 15% уровень сохранности

образцов КТ повышался по сравнению с данными

для 5%-х растворов. Результаты сохранности КТ

для 15% ДМАЦ/ОЭГ n=5 достоверно ниже резуль-

татов замораживания КТ с 10%-й концентрацией

веществ в криозащитных растворах, что, по-види-

мому, является следствием токсического действия

более высоких концентраций криопротекторов как

на этапе экспозиции, так и в процессе замо-

centration of substances in cryoprotective solutions,

being apparently the result of a toxic effect of higher

concentrations of cryoprotectants at both exposure and

freeze-thawing stages. The highest level of cryopro-

tective effect was established for the solutions, contai-

ning amide/polyol combination.

The data, presented in Fig. 4, testify to the impor-

tance for the PCs cryopreservation results of such a

factor as the duration of platelet exposure with cryopro-

tective medium before freezing. The experiments were