Журнал - Проблемы криобиологии 2009 №3

Подождите немного. Документ загружается.

331

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹3

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹3

Рис. 1. Агрегация и РГШ тромбоцитов после 30-минут-

ной экспозиции с криозащитными растворами, отличаю-

щимися соотношением криопротекторов (1:1; 3:1 и 1:3):

а – ДМАЦ/1,2-ПД; б – ДМАЦ/глицерин; в – ДМАЦ/

ОЭГn=5; г – 1,2-ПД/глицерин; д – 1,2-ПД/ОЭГ n=5, М±σ,

n=5; – АДФ; – коллаген; – РГШ; * – отличия

статистически достоверны по сравнению с соответствую-

щим показателем для соотношения 3:1, р < 0,05.

Fig. 1. Aggregation and HSR of platelets after 30 min expo-

sure with cryoprotective solutions, differing by cryopro-

tectant ratio (1:1; 3:1 and 1:3): a – DMAC/1,2-PD; b – DMAC/

glycerol; c – DMAC/OEG n=5; d – 1,2-PD/glycerol; e – 1,2-

PD/OEG n=5, M±σ, n=5; – ADP; – collagen; – HSR;

* – differences are statistically significant compared to the

corresponding index for 3:1 ratio, p < 0.05.

раживания-отогрева. Наиболее высокий уровень

криозащитного действия установлен для раство-

ров, содержащих сочетание амид/полиол.

Данные, представленные на рис.4, свидетель-

ствуют о важном значении для результатов крио-

консервирования КТ такого фактора, как длитель-

ность экспозиции тромбоцитов с криозащитной

средой перед замораживанием. Исследования бы-

ли проведены с 10%-ми растворами, содержащими

комбинации ДМАЦ/1,2-ПД, ДМАЦ/глицерина и

ДМАЦ/ОЭГ n=5 (соотношение криопротекторов

100

120

100

120

100

120

100

120

100

120

Параметр, %

Index, %

5% ДМАЦ/

5% 1,2-ПД

5% DMAC/

5% 1,2-PD

7,5% ДМАЦ/

2,5% 1,2-ПД

7,5% DMAC/

2,5% 1,2-PD

2,5% ДМАЦ/

7,5% 1,2-ПД

2,5% DMAC/

7,5% 1,2-PD

Параметр, %

Index, %

5% ДМАЦ/

5% глицерин

5% DMAC/

5% glycerol

7,5% ДМАЦ/

2,5% глицерин

7,5% DMAC/

2,5% glycerol

2,5% ДМАЦ/

7,5% глицерин

2,5% DMAC/

7,5% glycerol

Параметр, %

Index, %

5% ДМАЦ/

5% ОЭГ n=5

5% DMAC/

5% OEG n=5

7,5% ДМАЦ/

2,5% ОЭГ n=5

7,5% DMAC/

2,5% OEG n=5

2,5% ДМАЦ/

7,5% ОЭГ n=5

2,5% DMAC/

7,5% OEG n=5

Параметр, %

Index, %

5% 1,2-ПД/

5% глицерин

5% 1,2-PD/

5% glycerol

7,5% 1,2-ПД/

2,5% глицерин

7,5% 1,2-PD/

2,5% glycerol

2,5% 1,2-ПД/

7,5% глицерин

2,5% 1,2-PD/

7,5% glycerol

Параметр, %

Index, %

5% 1,2-ПД/

5% ОЭГ n=5

5% 1,2-PD/

5% OEG n=5

7,5% 1,2-ПД/

2,5% ОЭГ n=5

7,5% 1,2-PD/

2,5% OEG n=5

2,5% 1,2-ПД/

7,5% ОЭГ n=5

2,5% 1,2-PD/

7,5% OEG n=5

a a

б b

в c

г d

д e

performed with 10% solutions, comprising combinations

of DMAC/1,2-PD, DMAC/glycerol and DMAC/OEG

n=5 (1:1 cryoprotectant ratio); 15, 30 and 60 min expo-

sure time. Platelet number in PCs samples after freez-

ing did not statistically and significantly differ, but the

integrity of ADP-induced aggregation and HSR indices

was statistically and significantly higher for PCs

samples, frozen after 30 min exposure with cryoprotec-

tive solutions. Apparently, the processes, occurring

within a positive 60 min exposure (Table 1 and 2) are

manifested in a significant loss of platelet functional

100

332

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹3

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹3

Рис. 2. Агрегация тромбоцитов после замораживания с криозащитными растворами, содержащими комбинации

криопротекторов в суммарной концентрации 5, 10 и 15%, М±σ, n=5: – АДФ (200 мкМ); – коллаген (20 мг/мл); * –

отличия статистически достоверны по сравнению с соответствующими показателями для 10%-го комбинированного

раствора, р < 0,05; # – отличия статистически достоверны по сравнению с соответствующими показателями для

15%-го комбинированного раствора, р < 0,05.

Fig. 2. Platelet aggregation after freezing with cryoprotective solutions, containing cryoprotectant combinations in total

concentration of 5, 10 and 15%, M±σ, n=5; – ADP (200 µM); – collagen (20 mg/ml); * – differences are statistically

significant compared to corresponding indices for 10% combined solution, p < 0.05; # – differences are statistically

significant compared to corresponding indices for 15% combined solution, p < 0.05.

Рис. 3. РГШ и ретракция тромбоцитов после замораживания с криозащитными растворами, содержащими комби-

нации криопротекторов, М±σ, n=5: – РГШ; – ретракция; * – отличия статистически достоверны по сравнению

с соответствующими показателями для 10%-й суммарной концентрации криопротекторов, р < 0,05; # – отличия ста-

тистически достоверны по сравнению с соответствующими показателями для 15%-й суммарной концентрации

криопротекторов, р < 0,05.

Fig. 3. Platelet HSR and clot retraction after freezing with cryoprotective solutions, containing cryoprotectant combinations,

M±σ, n=5; – HSR; – clot retraction;* – differences are statistically significant compared to corresponding indices for

10% total concentration of cryoprotectants, p < 0.05; # – differences are statistically significant compared to corresponding

indices for 15% total concentration of cryoprotectants, p < 0.05.

Степень агрегации, %

Aggregation extent, %

ДМАЦ/1,2-ПД

DMAC/1,2-PD

51015

ДМАЦ/глицерин

DMAC/glycerol

ДМАЦ/ОЭГ n=5

DMAC/OEG n=5

1,2-ПД/глицерин

1,2-PD/glycerol

1,2-ПД/ОЭГ n=5

1,2-PD/OEG n=5

5 10 15 5 10 15 10 15 10 15

Криозащитные растворы и суммарная концентрация криопротекторов, %

Cryoprotective solutions and cryoprotectants’ total concentration, %

Параметр, %

Index, %

ДМАЦ/1,2-ПД

DMAC/1,2-PD

51015

ДМАЦ/глицерин

DMAC/glycerol

ДМАЦ/ОЭГ n=5

DMAC/OEG n=5

1,2-ПД/глицерин

1,2-PD/glycerol

1,2-ПД/ОЭГ n=5

1,2-PD/OEG n=5

5 10 15 5 10 15 10 15 10 15

Криозащитные растворы и суммарная концентрация криопротекторов, %

Cryoprotective solutions and cryoprotectants’ total concentration, %

100

333

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹3

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹3

Рис. 4. Сохранность КТ после замораживания с криозащитными растворами в зависимости от времени экспозиции,

М±σ, n=5: – количество; – АДФ (200 мкМ); – РГШ; – ретракция; * – отличия статистически достоверны по

сравнению с соответствующими показателями для 30 мин, р<0,05; # – отличия статистически достоверны по

сравнению с соответствующими показателями для 60 мин, р<0,05.

Fig. 4. PCs integrity after freezing with cryoprotective solutions depending on exposure time, M±σ, n=5; – quantity; –

ADP (200 µM); – HSR; – clot retraction; * – differences are statistically significant compared to the corresponding

indices for 30 min, p < 0.05; # – differences are statistically significant compared to corresponding indices for 60 min, p < 0.05.

1:1); время экспозиции – 15, 30 и 60 мин. Количество

тромбоцитов в образцах КТ после замораживания

достоверно не отличалось, однако сохранность

показателей АДФ-индуцированной агрегации и

РГШ была достоверно выше для образцов КТ,

замороженных после 30-минутной экспозиции с

криозащитными растворами. По-видимому, про-

цессы, которые происходят в течение продолжи-

тельной – 60-минутной экспозиции (табл. 1 и 2),

проявляются в значительной потере функциональ-

ной активности тромбоцитов на этапе заморажи-

Таблица 3. Количество тромбоцитов (в процентах по отношению к

показателю для свежевыделенных КТ) после замораживания с

криозащитными растворами, содержащими комбинации

криопротекторов, М±σ, n=5

Table 3. Platelet number (percentage in respect of the index for fresh

PCs) after freezing with cryoprotective solutions, containing cryoprotectant

combinations, M±σ, n=5

вания-отогрева (рис. 4). Более

низкий уровень сохранности КТ,

замороженных после 15-минут-

ной экспозиции, позволяет пред-

положить, что тромбоцитам

необходим временной интервал,

в течение которого происходит

процесс их “адаптации” к изме-

нениям среды. Отсутствием ин-

тервала “адаптации” объясняют-

ся, по-видимому, низкие показа-

тели сохранности КТ после крио-

консервирования с комбинацией

ДМАЦ/1,2-ПД: тромбоциты за-

мораживали сразу после соеди-

нения с криоконсервантом [4].

Таким образом, результаты

проведенных исследований сви-

детельствуют о том, что 30 ми-

нут – оптимальный временной

интервал от момента соединения

Параметр, %

Index, %

10% ДМАЦ/1,2-ПД

10% DMAC/1,2-PD

15 30 60

10% ДМАЦ/глицерин

10% DMAC/glycerol

10% ДМАЦ/ОЭГ n=5

10% DMAC/OEG n=5

Время экспозиции, мин Exposure time, min

15 30 60 15 30 60

activity at freeze-thawing stage (Fig. 4). Lower level

of PCs integrity, frozen after 15 min exposure, enables

suggesting about a necessary time interval for platelets,

during which the process of their “adaptation” to me-

dium changes occurs. The absence of “adaptation”

interval apparently explains low indices of PCs integrity

after cryopreservation with DMAC/1,2-PD combina-

tion: platelets were frozen right after combining with

cryopreservative [4].

Thus, the results of performed experiments testify

to a 30 min time interval as an optimal one from the

яанраммуС

яицартнецнок

%,вороткеторпоирк

noitartnecnoclatoT

%,stnatcetorpoyrcfo

аровтсарогонтищазоиркватсоС

noitulosevitcetorpoyrcfonoitisopmoC

/ЦАМД

2,1 - ДП

/CAMD

2,1 - DP

/ЦАМД

нирецилг

/CAMD

lorecylg

/ЦАМД

5=nГЭО

/CAMD

5=nGEO

2,1 - /ДП

нирецилг

2,1 - /DP

lorecylg

2,1 - /ДП

5=nГЭО

2,1 - /DP

5=nGEO

53±291,2±3,688,3±3,39--

011,3±5,780,5±0,090,5±0,592,4±7,672,9±0,06

512,4±3,199,4±7,090,7±0,885,3±0,686,3±0,75

100

334

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹3

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹3

КТ с комбинированными криозащитными раство-

рами до начала их замораживания.

На рис. 5 представлены результаты сравни-

тельного изучения сохранности КТ после замора-

живания с криозащитными растворами, содержа-

щими 10%-ю концентрацию в плазме одного из

криопротекторов (ДМАЦ, 1,2-ПД, глицерин, ОЭГ

n=5) или 10%-ю суммарную концентрацию их раз-

личных комбинаций. Замораживание тромбоцитов

с 10% ДМСО в наших исследованиях служит до-

полнительным контролем (“золотой стандарт”

криоконсервирования КТ). После замораживания

КТ с монокриопротекторами (рис. 5, а) уровень

сохранности таких параметров, как РГШ и ретрак-

ция был ненамного, хотя и достоверно выше для

Рис. 5. Показатели сохранности КТ после замораживания с криозащитными растворами на основе монокрио-

протекторов (а) и комбинаций криопротекторов (б), М±σ, n=5: – количество; – АДФ (200 мкМ); – РГШ; –

ретракция; * – отличия статистически достоверны по сравнению с соответствующими показателями для ДМСО,

р < 0,05; # – отличия статистически достоверны по сравнению с соответствующими показателями для криопро-

текторов, которые входят в состав комбинированных криоконсервантов, р < 0,05.

Fig. 5. Indices for PCs integrity after freezing with cryoprotective solutions, based on monocryoprotectants (a) and

cryoprotectant combinations (b), M±σ, n=5; – quantity; – ADP (200 µM); – HSR; – clot retraction;* – differences

are statistically significant compared to the corresponding indices for DMSO, p < 0.05; # – differences are statistically

significant compared to the corresponding indices for cryoprotectants, being a part of combined cryopreservatives, p < 0.05;

10% ДМАЦ/1,2-ПД

10% DMAC/1,2-PD

10% ДМАЦ/глицерин

10% DMAC/glycerol

10%ДМАЦ/ОЭГ n=5

10%DMAC/OEG n=5

10% 1,2-ПД/глицерин

10% 1,2-PD/glycerol

10% 1,2-ПД/ОЭГ n=5

10% 1,2-PD/OEG n=5

Параметр, %

Index, %

Параметр, %

Index, %

10% ДМСО

10% DMSO

10% ДМАЦ

10% DMAC

10%1,2-ПД

10%1,2-PD

10% глицерин

10% glycerol

10% ОЭГ n=5

10% OEG n=5

б b

a a

moment of PCs binding with combined cryoprotective

solutions to their freezing beginning.

Fig. 5 shows the results of a comparative study of

PC integrity after freezing with cryoprotective solu-

tions, containing 10% concentration in plasm of one of

cryoprotectants (DMAC, 1,2-PD, glycerol, OEG n=5)

or 10% total concentration of their different combina-

tions. Platelet freezing with 10% DMSO serves in our

researches as an additional control (“gold standard”

for PCs cryopreservation). After PC freezing with

monocryoprotectants (Fig. 5a) the integrity level of

such parameters, as HSR and retraction was slightly,

but statistically higher for DMSO, compared to DMAC,

1,2-PD, glycerol or OEG n=5 (p<0.05); by the indices

of ADP-induced aggregation no statistically significant

335

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹3

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹3

ДМСО по сравнению с ДМАЦ, 1,2-ПД, глицерином

или ОЭГ n=5 (р < 0,05); по показателям АДФ-инду-

цируемой агрегации достоверных отличий не уста-

новлено. Вместе с тем данных о существенном

преимуществе ДМСО по сравнению с другими

криопротекторами не получено: отличия между

величинами не превышали 7–15%. Кроме того, сле-

дует подчеркнуть, что для криопротекторов

ДМАЦ, 1,2-ПД и ОЭГ n=5 более высокие резуль-

таты сохранности КТ установлены для 5–6%-х

концентраций этих веществ в криозащитных раст-

ворах [3, 5, 8].

Применение комбинаций криопротекторов в

криозащитных растворах (5%-я концентрация каж-

дого криопротектора, суммарная – 10%-я) позво-

лило существенно повысить уровень сохранности

КТ после замораживания по сравнению с моно-

криопротекторами (рис. 5, б). Этот вывод спра-

ведлив только по отношению к комбинациям

ДМАЦ с 1,2-ПД, глицерином или ОЭГ n=5. После

замораживания образцов КТ с криозащитными

растворами, содержащими 10%-е концентрации

ДМАЦ/1,2-ПД, ДМАЦ/глицерин и ДМАЦ/ОЭГ

n=5, отмечено значительное достоверное повыше-

ние показателей сохранности АДФ-агрегации,

РГШ и ретракции как при сравнении с ДМСО, так

и с монокриопротекторами, составляющими ком-

бинацию в криоконсерванте (рис. 5, б). Наиболее

высокие результаты получены при использовании

сочетания проникающего ДМАЦ и непрони-

кающего ОЭГ n=5: в результате замораживания в

образцах КТ сохранялось в среднем 95±5% тром-

боцитов, степень АДФ-агрегации составляла 55,7 ±

10,4%, РГШ – 69,7±11,5%, ретракции – 85,7±10,2%.

Для тромбоцитов, замороженных с комбинацией

ДМАЦ/ОЭГ n=5, отмечены не только высокие по-

казатели абсолютной величины РГШ, но и началь-

ная скорость “обратного хода” реакции, а также ско-

рости агрегации.

Для комбинаций полиолов в ограждающих раст-

ворах (1,2-ПД/глицерин и 1,2-ПД/ОЭГ n=5) полу-

чены неудовлетворительные результаты, особенно

для сочетания 1,2-ПД/ОЭГ n=5 (рис. 5, б).

Выводы

Результаты проведенных исследований показа-

ли преимущества замораживания тромбоцитов с

ограждающими растворами, содержащими комби-

нации криопротекторов. Сравнительный анализ

эффективности ограждающих растворов свиде-

тельствует о высоком уровне криозащитного дей-

ствия сочетания криопротекторов ДМАЦ/ОЭГ

n=5, ДМАЦ/1,2-ПД и ДМАЦ/глицерин. Использо-

вание в ограждающих растворах 5%-й концентра-

differences were revealed. However no data about a

significant advantage of DMSO, compared to other

cryoprotectants were obtained: differences between

values did not exceed 7–15%. In addition, of note is

the fact, that for DMAC, 1,2-PD and OEG n=5 the

higher results of PCs integrity were established for 5–

6% concentrations of these substances in cryopro-

tective solutions [3, 5, 8].

The application of cryoprotective combinations in

cryoprotective solutions (5 and 10% concentrations of

each cryoprotectant and a total one, correspondingly)

allowed a considerable augmentation of PCs integrity

level after freezing, compared to monocryoprotectants

(Fig. 5b). This conclusion is true only in respect of the

combinations of DMAC with 1,2-PD, glycerol or OEG

n=5. After PCs samples’ freezing with cryoprotective

media, comprising 10% concentrated DMAC/1,2-PD,

DMAC/glycerol and DMAC/OEG n=5, there was

noted a considerable statistically significant augmenta-

tion of integrity indices of ADP-aggregation, HSR and

clot retraction both when comparing with DMSO and

with monocryoprotectants, making the composition in

a cryopreservative solution (Fig. 5b). The best results

were obtained when using the combination of pene-

trative DMAC and non-penetrative OEG n=5: as a

result of freezing in PCs samples there were preserved

95±5% platelets in average, the degree of ADP-aggre-

gation, HSR and clot retraction made 55.7±10.4,

69.7±11.5, 85.7±10.2%, correspondingly. For platelets,

frozen with DMAC/OEG n=5 combination there were

noted not only high indices of HSR absolute value, but

an initial rate of reaction “reversal”, as well as aggre-

gation rate.

For polyol combinations in cryoprotective solutions

(1,2-PD/glycerol and 1,2-PD/OEG n=5) there were

obtained negative results, especially for 1,2-PD/OEG

n=5 combination (Fig. 5b).

Conclusions

The results of the researches performed showed

the advantages of platelet freezing with cryopreser-

vative solutions, containing cryoprotectant combina-

tions. A comparative analysis of the efficiency of cryo-

protective solutions testifies to a high level of cryopro-

tective effect of combining cryoprotectants DMAC/

OEG n=5, DMAC/1,2-PD and DMAC/glycerol. Using

5% concentration of each cryoprotectants in cryopro-

tective solutions (10% total concentration) enabled to

significantly increase the level of PCs integrity after

freezing, compared to the results of platelet cryopreser-

vation with monocryoprotectants. The highest level of

PCs integrity was achieved when using combinations

of penetrative DMAC and non-penetrative OEG n=5

in cryopreservative.

336

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹3

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹3

ции каждого криопротектора (10%-я суммарная

концентрация) позволило значительно повысить

уровень сохранности КТ после замораживания по

сравнению с результатами криоконсервирования

тромбоцитов с монокриопротекторами. Наиболее

высокий уровень сохранности КТ получен при

использовании комбинации проникающего ДМАЦ

и непроникающего ОЭГ n=5 в криоконсерванте.

Литература

Аграненко В.А., Файнштейн Ф.Э., Голубева В.Л. и др.

Криоконсервированные тромбоциты и их клиническая

эффективность // Пробл. гематологии и переливания

крови.– 1987.– Т. 32, №5.– С. 8–12.

Азовская С.А., Волкова Р.И., Сокольцов В.Ф. Криоконсер-

вирование тромбоцитов и их функциональная полноцен-

ность // Гематология и трансфузиология.– 1995.– Т. 40,

№5.– С. 44–46.

Компаниец А.М. Консервирование концентратов

тромбоцитов и их лечебная эффективность: Автореф.

дис. … д-ра мед. наук.– М., 1992.– 52 с.

Компанієць А.М., Книш О.В., Гуріна Т.М. та інш. Дос-

лідження морфофункціональної збереженості тромбо-

цитів на етапах кріоконсервування // Пробл. криобио-

логии.– 2006. – Т. 16, №2.– С. 182–191.

Компаниец А.М., Николенко А.В., Луговой В.И. Криокон-

сервирование тромбоцитов с веществами ряда поли-

олов // Труды Междунар. конф. по криобиологии. –

Харьков, 1992. – С. 86.

Лебедева Е.А., Ефимова С.Ю. Клиническая эффек-

тивность концентрата тромбоцитов у гематологических

больных // Пробл. гематологии и переливания крови.–

2000.– №2.– С. 27–28.

Николенко А.В., Компаниец А.М., Луговой В.И. Криопро-

текторные свойства полиолов и их производных при

замораживании тромбоцитов // Пробл. криобиологии.–

1995.– №4.– С. 36–40.

Николенко А.В. Криопротекторные свойства полиолов

и их производных при замораживании тромбоцитов:

Дис. … канд. биол. наук. – Харьков, 1991. – 129 с.

Порешина Л.П., Компаниец А.М., Кутьина М.В. и др. Алло-

иммунизация HLA и рефрактерность к трансфузиям

тромбоцитов у гематологических больных // Иммуно-

логия.– 1993.– №4.– С. 79–84.

Ронин В.С. Способ окраски тромбоцитов для подсчета в

счетной камере // Лаб. дело.– 1983.– №1.– С. 61–62.

Степанова И.П., Белов Е.В., Селиванов Е.А. и др. Сос-

тояние и актуальные задачи службы крови в России //

Материалы научно-практ. конф. “Актуальные вопросы

гематологии и трансфузиологии”. – СПб, 2000. – С. 4–7.

Пат. № 15014 Україна, МПК8 А0N 1/02. Спосіб видалення

кріопротектора із суспензії тромбоцитів / В.І. Грищенко,

А.М. Компанієць, О.В. Книш. Заявлено 18.11.05; Опубл.

15.06.06, Бюл. №6.

Agranenko V.A., Kompaniets A.M. Factors influencing on the

efficacy of platelet transfusion therapy // Proceedings of

XXIII Congress of ISBT.– Amsterdam, 1994.– P. 94.

Arnaud F.G, Pegg D.E. Cryopreservation of human platelets

with 1.4 M glycerol at –75 degrees C in PVC blood packs //

Thromb. Res.– 1990.– Vol. 57, N6.– P. 919–924.

Arnaud F. Frozen/thawed platelets: importance of osmotic

tolerance and platelet subpopulations // Cryobiology. – 1999.–

Vol. 38, N3.– P. 192–199.

Arnaud F.G., Pegg D.E. Cryopreservation of human platelets

with propane-1,2-diol // Cryobiology. – 1990. – Vol. 27, N2.–

P. 130–136.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

References

Agranenko V.A., Fainshtein F.E., Golubeva V.L. et al. Cryo-

preserved platelets and their clinical efficiency // Problemy

Gematologii i Perelivaniya Krovi.– 1987.– Vol. 32, N5.– P. 8–12.

Azovskaya S.A., Volkova R.I., Sokol’tsov V.F. Platelet

cryopreservation and their functional integrity // Gematol.

Transfuziol.– 1995.– Vol. 40, N5.– P. 44–46.

Kompaniets A.M. Preservation of platelet concentrates and

their therapeutic efficiency: Author’s abstract of thesis of

doctor of medical sciences.– Moscow, 1992.– 52 p.

Kompaniets A.M., Knysh O.V., Gurina T.M. et al. Study of

morphofunctional integrity of platelets at cryopreservation

stages // Problems of Cryobiology.– 2006.– Vol. 16, N2.–

P. 182–191.

Kompaniets A.M., Nikolenko A.V., Lugovoy V.I. Platelet

cryopreservation with substances of polyol series // Proc.

of Intern. Conference on Сryobiology.– Kharkov, 1992.– P. 86.

Lebedeva E.A., Efimova S.Yu. Clinical efficiency of platelet

concentrate in haematological patients // Problemy Gematologii

i Perelivaniya Krovi.– 2000.– N2.– P. 27–28.

Nikolenko A.V., Kompaniets A.M., Lugovoy V.I. Cryoprotective

properties of polyols and their derivatives during freezing of

platelets // Problems of Cryobiology.– 1995.– N4.– P. 36–40.

Nikolenko A.V. Cryoprotective properties of polyols and their

derivatives during platelet freezing: Thesis of candidate of

biol. sciences.– Kharkov, 1991.– 129 p.

Poreshina L.P., Kompaniets A.M., Kutjina M.V. et al. HLA

alloimmunisation and refractoriness to platelet transfusions

in haematological patients // Immunologiya.– 1993.– N4.– P. 79–

84.

Ronin V.S. Way for platelet staining to calculate in counting

chamber // Lab. Delo.– 1983.– N1.– P. 61–62.

Stepanova I.P., Belov E.V., Selivanov E.A. et al. State and

actual tasks of blood service in Russia // Proc. of scientific

and practical conference “Actual Questions of Haematology

and Transfusiology”.– St.-Petersburg, 2000.– P. 4–7.

Patent N 15014 Ukraine IPC

A0N 1/02. Way of cryoprotectant

removal from platelet suspension / V.I. Grischenko, A.M.

Kompaniets, O.V. Knysh.– Applied 18.11.05, Published

15.06.06.– Bull. N6.

Agranenko V.A., Kompaniets A.M. Factors influencing on the

efficacy of platelet transfusion therapy // Proceedings of

XXIII Congress of ISBT.– Amsterdam, 1994.– P. 94.

Arnaud F.G, Pegg D.E. Cryopreservation of human platelets

with 1.4 M glycerol at –75 degrees C in PVC blood packs //

Thromb. Res.– 1990.– Vol. 57, N6.– P. 919–924.

Arnaud F. Frozen/thawed platelets: importance of osmotic

tolerance and platelet subpopulations // Cryobiology. – 1999.–

Vol. 38, N3.– P. 192–199.

Arnaud F.G., Pegg D.E. Cryopreservation of human platelets

with propane-1,2-diol // Cryobiology. – 1990. – Vol. 27, N2.–

P. 130–136.

Balint B., Paunovic D., Vucetic D. at al. Controlled-rate versus

uncontrolled-rate freezing as predictors for platelet cryopre-

servation efficacy // Transfusion.– 2006.– Vol. 46, N2.–

P. 230–235.

Born G.V.R., Cross M.J. The aggregation of blood platelets //

J. Physiol. (London).– 1963.– Vol. 168, N1.– P. 178–195.

British Committee for Standards in Haematology, Blood

Transfusion Task Force: Guidelines for the use of platelet

transfusions // Br. J. Haematol.– 2003.– Vol. 122, N2.– P. 10–

23.

Cardigan R., Turner C., Harrison P. Current methods of as-

sessing platelet function: relevance to transfusion medicine //

Vox Sang.– 2005.– Vol. 88, N3.– P. 153–163.

Dijkstra-Tiekstra M.J., de Korte D., Pietersz R.N. et al.

Comparison of various dimethylsulphoxide-containing solu-

tions for cryopreservation of leucoreduced platelet concen-

trates // Vox Sang.– 2003.– Vol. 85, N4.– P. 276–282.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

21.

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹3

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹3

337

Balint B., Paunovic D., Vucetic D. at al. Controlled-rate versus

uncontrolled-rate freezing as predictors for platelet cryopre-

servation efficacy // Transfusion.– 2006.– Vol. 46, N2.–

P. 230–235.

Born G.V.R., Cross M.J. The aggregation of blood platelets //

J. Physiol. (London).– 1963.– Vol. 168, N1.– P. 178–195.

British Committee for Standards in Haematology, Blood

Transfusion Task Force: Guidelines for the use of platelet

transfusions // Br. J. Haematol.– 2003.– Vol. 122, N2.– P. 10–

23.

Cardigan R., Turner C., Harrison P. Current methods of as-

sessing platelet function: relevance to transfusion medicine //

Vox Sang.– 2005.– Vol. 88, N3.– P. 153–163.

Dijkstra-Tiekstra M.J., de Korte D., Pietersz R.N. et al.

Comparison of various dimethylsulphoxide-containing solu-

tions for cryopreservation of leucoreduced platelet concen-

trates // Vox Sang.– 2003.– Vol. 85, N4.– P. 276–282.

Gao D.Y., Neff K., Xiao H.Y. et al. Development of optimal

techniques for cryopreservation of human platelets. I. Platelet

activation during cold storage (at 22 and 8 degrees C) and

cryopreservation // Cryobiology.– 1999.– Vol. 38, N3.– P. 225–

35.

Han T. Stutzman L., Cohen E., Kim U. Effect of platelet trans-

fusion on hemorrhage in patients with acute leukemia //

Cancer.– 1966.– Vol. 19, N3.– Р. 19–37.

Levin R.H. Handbook for platelet transfusion therapy.–

Bethesda.: National Cancer Institute, 1964.– 31 p.

McCulloch J., Vescle D.V., Benjamin P.J. et al. Therapeutic

efficacy and safety of platelet treated with a photochemical

process for pathogen inactivation the Sprint Trial // Blood. –

2004.– Vol. 104, N5.– P. 1534–1542.

Pedrazzoli P., Perotti C., Noris P. et al. Autologus platelet

transfusion in patients receiving high-dose chemotherapy

and circulating progenitor cell transplantation for stage II/III

breast cancer // Haematologica.– 1998.– Vol. 83, N8.– P. 718–

723.

Slichter S.J. Mechanisms and management of platelet refrac-

toriness // In: Transfusion Medicine in the 1990s / Ed. by

Nance S.J.– Arlington, 1990.– P. 95–178.

Slichter S.J. Platelet transfusion: future directions // Vox

Sang.– 2004.– Vol. 8, Suppl. 2.– P. S47–S51.

Sullivan M.T., Cotten R, Read E.J., Wallace E.L. Blood

collection and transfusion in the United States in 2001 //

Transfusion.– 2007.– Vol. 47, N3.– P. 366–368.

Surgenor D.M., Schnitzer S.S. The nation’s blood resource:

A summary report. NIH Publication #85-2028.– Rockville, MD:

National Institutes of Health, 1985.

Taylor M.A. Cryopreservation of platelets: an in vitro

comparison of four methods // J.Clin. Pathol.– 1981.– Vol. 34,

N1.– Р. 71–75.

Valeri C.R., Rango G., Khuri S. Freezing human platelets

with 6 percent dymethyl sulfoxide with removal of the

supernatant solution before freesing and sstorage at –80°C

without postthaw processing // Transfusion.– 2005.– Vol. 45,

N12.– Р. 1890–1898.

Van Imhoff G., Arnaud F., Postmus P. et al. Autologus

cryopreserved platelets and prophylaxis of bleeding in

autologus bone marrow transplantation // Blut.– 1983.–

Vol. 47, N2.– P. 203–209.

Yokomuro M., Ebine K., Shiroma K. et al. Safety and efficacy

of autologus platelet transfusion in cardiac surgery: compa-

rison of cryopreservation, blood collection on the day before

surgery and blood collection during surgery // Cryobiology.–

1999.– Vol. 38, N3.– P. 236–242.

Поступила 20.10.2009

Рецензент Г.А. Божок

17.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

24.

25.

26.

27.

28.

29.

30.

31.

32.

33.

34.

Gao D.Y., Neff K., Xiao H.Y. et al. Development of optimal

techniques for cryopreservation of human platelets. I. Platelet

activation during cold storage (at 22 and 8 degrees C) and

cryopreservation // Cryobiology.– 1999.– Vol. 38, N3.– P. 225–

35.

Han T. Stutzman L., Cohen E., Kim U. Effect of platelet trans-

fusion on hemorrhage in patients with acute leukemia //

Cancer.– 1966.– Vol. 19, N3.– Р. 19–37.

Levin R.H. Handbook for platelet transfusion therapy.–

Bethesda.: National Cancer Institute, 1964.– 31 p.

McCulloch J., Vescle D.V., Benjamin P.J. et al. Therapeutic

efficacy and safety of platelet treated with a photochemical

process for pathogen inactivation the Sprint Trial // Blood. –

2004.– Vol. 104, N5.– P. 1534–1542.

Pedrazzoli P., Perotti C., Noris P. et al. Autologus platelet

transfusion in patients receiving high-dose chemotherapy

and circulating progenitor cell transplantation for stage II/III

breast cancer // Haematologica.– 1998.– Vol. 83, N8.– P. 718–

723.

Slichter S.J. Mechanisms and management of platelet refrac-

toriness // In: Transfusion Medicine in the 1990s / Ed. by

Nance S.J.– Arlington, 1990.– P. 95–178.

Slichter S.J. Platelet transfusion: future directions // Vox

Sang.– 2004.– Vol. 8, Suppl. 2.– P. S47–S51.

Sullivan M.T., Cotten R, Read E.J., Wallace E.L. Blood

collection and transfusion in the United States in 2001 //

Transfusion.– 2007.– Vol. 47, N3.– P. 366–368.

Surgenor D.M., Schnitzer S.S. The nation’s blood resource:

A summary report. NIH Publication #85-2028.– Rockville, MD:

National Institutes of Health, 1985.

Taylor M.A. Cryopreservation of platelets: an in vitro

comparison of four methods // J.Clin. Pathol.– 1981.– Vol. 34,

N1.– Р. 71–75.

Valeri C.R., Rango G., Khuri S. Freezing human platelets

with 6 percent dymethyl sulfoxide with removal of the

supernatant solution before freesing and sstorage at –80°C

without postthaw processing // Transfusion.– 2005.– Vol. 45,

N12.– Р. 1890–1898.

Van Imhoff G., Arnaud F., Postmus P. et al. Autologus

cryopreserved platelets and prophylaxis of bleeding in

autologus bone marrow transplantation // Blut.– 1983.–

Vol. 47, N2.– P. 203–209.

Yokomuro M., Ebine K., Shiroma K. et al. Safety and efficacy

of autologus platelet transfusion in cardiac surgery: compa-

rison of cryopreservation, blood collection on the day before

surgery and blood collection during surgery // Cryobiology.–

1999.– Vol. 38, N3.– P. 236–242.

Accepted in 20.10.2009

22.

23.

24.

25.

26.

27.

28.

29.

30.

31.

32.

33.

34.

338

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹3

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹3

* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:

п/в Кулиничи, Харьковский район, Харьковская область,

Украина, 62404; тел.: (+38057) 740-31-66, электронная почта:

lab_cryo@ukr.net

* To whom correspondence should be addressed: PO Kulinichi,

Kharkov region, Ukraine 61480; tel.: +380 57 740 3166; e-mail:

lab_cryo@ukr.net

Институт животноводства УААН, г. Харьков

Институт растениеводства УААН, г. Харьков

УДК 635.076:57.043

Л.В. ГОРБУНОВ

, Т.П. ШИЯНОВА

Криоконсервирование черенков плодово-ягодных культур

UDC 635.076:57.043

L.V. GORBUNOV

, T.P. SHIYANOVA

Cryopreservation of Fruit-Berry Culture Cuttings

Установлено, что на жизнеспособность деконсервированных черенков оказывают значительное влияние температура,

длительность хранения, влажность, скорости охлаждения и отогрева. Определены допустимые значения влажности, параметры,

обеспечивающие максимальную жизнеспособность черенков березы, черной смородины, малины, вишни, соответствующие

32–40; 40–50; 37–40; 33–45% в положительном диапазоне температур и 14–28, 30–40, 23, 37% – в отрицательном. Снижение

влажности приводит к эффекту плазмолиза, а превышение – внутриклеточному кристаллообразованию. При использовании

различных режимов сушки и охлаждения со скоростью 0,1°C/ч до –20 °С с последующим погружением в жидкий азот возможна

реализация жизнеспособности деконсервированных черенков смородины и березы 100 %, малины – 88%, вишни – 57%.

Ключевые слова: черенки плодово-ягодных культур, криоконсервирование, жизнеспособность, длительность хранения,

влажность, скорости охлаждения и отогрева.

Встановлено, що на життєздатність деконсервованих живців впливають температура, тривалість зберігання, вологість,

швидкість охолодження і відігрівання. Визначені припустимі значення вологості, параметри, що забезпечують максимальну

життєздатність живців берези, чорної смородини, малини, вишні, що відповідають 32–40; 40–50; 37–40; 33–45% у позитивному

діапазоні температур і 14–28, 30–40, 23, 37% – у негативному. Зниження вологості призводить до ефекту плазмолізу, а

перевищення – до внутрішньоклітинного кристалоутворення. При використанні різних режимів сушіння й охолодження зі

швидкістю 0,1°C/год до –20°С і з наступним зануренням у рідкий азот можлива життєздатність деконсервованих живців

смородини і берези 100%, малини – 88%, вишні – 57%.

Ключові слова: живці плодово-ягідних культур, кріоконсервування, життєздатність, тривалість зберігання, вологість,

швидкості охолодження і відігрівання.

It has been established that temperature, storage period, humidity, rates of cooling and thawing significantly affect viability of

frozen-thawed cuttings. The found permissible values of humidity, parameters, providing maximal viability of birch, black currant

berry, raspberry, cherry cuttings are 32–40; 40–50; 37–40; 33–45% within the positive range of temperatures and 14–28, 30–40, 23,

37% within the negative range. Decrease of humidity results in plasmolysis, and exceeding does in intracellular crystal-formation.

During application of different regimens of drying and cooling with the rate of 0.1°C/hr down to –20°C with further plunging into

liquid nitrogen the viability of frozen-thawed cuttings of currant berry and birch made 100%, 88% for raspberry and 57% for cherry.

Key words: cuttings of fruit-berry cultures, cryopreservation, viability, storage period, humidity, rate of cooling and warming.

При постоянном сокращении мировых расти-

тельных ресурсов сохранение генофонда культур-

ных и дикорастущих видов растений является

актуальной проблемой. Особенно важен вопрос

сохранения генплазмы плодовых культур в побегах,

почках, семенах, пыльце, меристемах и культуре

in vitro [1, 2, 6, 8–10]. В практике садоводства в ос-

новном используют вегетативные способы размно-

жения, поскольку при размножении семенами в

потомстве изменяется генотип исходного сорто-

типа растения [1].

Наилучший способ сохранения генофонда веге-

тативно размножающихся растений – криоконсер-

вирование верхушечных меристем побегов. Дан-

Gene fund preservation of cultural and wild-grow-

ing plant species at a steady reduction of world plant

resources is an actual problem.

The question of preservation of gene plasma of

fruit cultures in shoots, buds, seeds, pollen, meristems

and in vitro culture [1, 2, 6, 8–10] is especially impor-

tant. In practical gardening the vegetative reproduction

methods are generally used, whereas during seed

reproduction a genotype of plant initial variety changes

in progeny [1].

The best method of gene fund preservation of clonal

plants is cryopreservation of apical meristems of

cuttings. This method has many advantages, but it is

associated with development of special laboratory

Institute of Animal Breeding of Ukrainian Academy of

Agricultural Sciences, Kharkov, Ukraine

Institute of Plant Production of Ukrainian Academy of Agricul-

tural Sciences, Kharkov, Ukraine

ÊÐÈÎÊÎÍÑÅÐÂÈÐÎÂÀÍÈÅ

ÁÈÎÎÁÚÅÊÒÎÂ

CRYOPRESERVATION

OF BIOLOGICAL SYSTEMS

339

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹3

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹3

ный способ имеет много преимуществ, но связан с

созданием необходимой специальной лабораторной

базы, значительными затратами рабочего времени

квалифицированных специалистов, сложностью

выполнения процедуры регенерации меристем,

однако по существующим финансовым и мате-

риальным условиям деятельности Национального

генбанка Украины обеспечить сохранность сущест-

вующих образцов невозможно.

В 1959 г. И.И.Туманов и соавт. установили, что

ветви хорошо закаленных древесных и кустарни-

ковых морозостойких растений могут быть успеш-

но заморожены до температуры жидкого азота [6].

В дальнейшем этот факт подтвердил A. Sakai [8].

После оттаивания черенки березы, черной сморо-

дины, вишни, яблони возобновляли рост, раскры-

вали листья, укоренялись.

Для обеспечения жизнеспособности деконсер-

вированных образцов на уровне 20–30% их высу-

шивали со скоростью 1°C/ч до 28–30 % влажности

с последующим охлаждением черенков винограда

и яблони от –5 до –30°С [7, 8, 10]; смородины и

крыжовника от –5 до –90°С [2]. Затем их помещали

в пары жидкого азота. Вместе с тем в работе [3]

показано, что снижение влажности используемых

образцов до 30% приводит к значительному сниже-

нию уровня их жизнеспособности.

Вероятно, для образцов каждого вида культур-

ных растений следует подбирать определенный

диапазон влажности, режим замораживания с опти-

мальной скоростью, конечную температуру охлаж-

дения и время выдержки перед погружением в

жидкий азот, способ отогрева.

Цель работы – определение области допусти-

мых значений, обеспечивающих максимальную

жизнеспособность деконсервированных черенков

плодово-ягодных культур.

Материалы и методы

Объектом исследования были черенки черной

смородины “Дачница” (Ribes nigrum L.); вишни

“Степная” (Prunus cerasus L.); малины “Новость

Кузмина”(Rubus idaeus L.); яблони “Белый налив”

(Malus domestica L.); сливы “Ренклод”, “Угорка”

(Prunus domestica L.); винограда “Лидия” (Vitis

labrusca L.). Для контроля выбранных способов

криоконсервирования использовали черенки бере-

зы (Betula pubescens) из-за их высокой криорезис-

тентности [3, 5, 6].

Черенки нарезали из однолетних побегов и

делили на отдельные образцы по 10 ± 2 шт. длиной

5–12 см, диаметром 0,5–1,2 см. Черенки имели от

2 до 5 вегетативных почек. Перед высушиванием

проверяли жизнеспособность и начальную влаж-

ность образцов. Для исследования отбирали образ-

цы с жизнеспособностью не менее 100%.

facilities, significant work breakdown of qualified

specialists, complication of carrying out the meristem

regeneration, however it is impossible to provide

viability of presenting samples according to financial

and material conditions of activity of the National

genebank of Ukraine.

In 1959 Tumanov et al. established that branches

of well-tempered woody and brushwood frost-resis-

tant plants might be successfully frozen down to

temperature of liquid nitrogen [6]. Further this fact

was confirmed by Sakai [8]. After thawing the cut-

tings of birch, black currant, cherry and apple tree

renewed growth, opened up leaves and took the roots.

For providing viability of frozen-thawed samples

at the level of 20–30% they were dried with 1°C/hr

rate up to 28–30% of humidity with further cooling

of apple and grape cuttings from –5 to –30°C [7, 8,

10], currant and gooseberry ones from –5 to 90°C

[2]. Then they were placed into liquid nitrogen vapors.

Herewith it has been shown in the paper [3] that redu-

ced humidity of used samples down to 30% results in

significant decrease of their viability level.

Probably the certain range of humidity, freezing

regimen with optimal rate, final temperature of

cooling and exposure time prior to plunging into liquid

nitrogen, thawing method for the samples of each

variety of culture plants should be selected.

The research aim was to determine the ranges of

permissible values, providing maximal viability of

frozen-thawed cuttings of fruit-berry cultures.

Materials and methods

The research objects were the cuttings of

Dachnitsa (Ribes nigrum L.) black currant; Stepnaya

(Prunus cerasus L.) cherry; Novost’ Kuz’mina

(Rubus idaeus L.) raspberry; Belyy Naliv (Malus

domestica L.) apple; Renklod, Ugorka (Prunus

domestica L.) prunes and Lidiya (Vitis labrusca L.)

grape. As the control for chosen cryopreservation

methods the birch (Betula pubescens) cuttings were

used due to their high cryoresistance [3, 5, 6].

The cuttings were cut from one year shoots and

divided into separated samples for 10 ± 2 units of 5–

12 cm length and 0.5–1.2 cm diameter. The cuttings

had from 2 to 5 vegetative buds. Prior to drying the

viability and initial humidity of samples were examined.

There were selected the samples with not less than

100% viability for studying.

The samples’ humidity change was determined

after drying, cryopreservation, rehydration with mea-

suring and calculated according to the formula:

= ((m

– m

)/m

)×100%,

where m

– initial mass of native sample, g; m

– final

mass of sample after dehydration to constant mass, g

340

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹3

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹3

Изменение влажности образцов определяли

после высушивания, криоконсервирования, регидра-

тации взвешиванием и рассчитывали по формуле:

= ((m

– m

)/ m

)×100%,

где m

– начальная масса нативного образца, г; m

–

конечная масса образца после обезвоживания до

постоянной массы, г.

Затем черенки делили на группы для высушива-

ния по трем режимам: активный, полуактивный,

пассивный. Степень влажности нативных черенков

изменяли от 50 до 30% в соответствии с указан-

ными режимами высушивания: активный С1

–

сушильная камера, температура 20 ± 2°C, влаж-

ность воздуха 25 ± 5%, выдержка 3-е суток;

полуактивный С2

– температура 5 ± 2°C, влаж-

ность воздуха 75 ± 5%; пассивный С3

– темпера-

тура – 2 ± 2°C, влажность воздуха 85 ± 5% [3]. Для

сохранения влажности концы черенков перед

охлаждением обрабатывали воском или парафином.

Разные скорости замораживания, необходимые

для криоконсервирования черенков, получали в два

этапа. На первом этапе применяли режим замора-

живания, основанный на ступенчатом охлаждении

со скоростью 0,1...0,01°C/ч. Образцы помещали в

бытовые термосы вместимостью 1,5 и 2 л, затем в

рефрижераторы и охлаждали до температур –5...

–30°С с интервалом 5°С и выдержкой 1, 3 и 7 суток

соответственно. На втором этапе часть образцов,

после их охлаждения до –20 и –30°С, извлекали из

термосов, помещали в холщевые мешочки и погру-

жали в жидкий азот со скоростью 600–800°C/мин.

Образцы хранили в рефрижераторах при темпера-

турах –5, –20 и –30°С, а также в жидком азоте с

выдержкой от одних суток до одного года.

После замораживания образцов до –196°С при-

меняли три режима оттаивания. Оттаивание образ-

цов по 1-му режиму, со скоростью 70°C/мин, прово-

дили на воздухе при температуре 20°С. Вто-

рой режим, со скоростью 1–3°C/мин, реализовыва-

ли при помещении образцов в бытовой термос,

который размещали в холодильник при темпера-

туре 5°С. Третий режим основан на ступенчатом

оттаивании со скоростью 0,1°C/ч: на 1-й ступени

до температуры –30°С, 2 -й – до –20°С, 3-й – до

–10°С, 4-й – до –5 °С, 5-й – до 5°С. При достижении

заданной температуры на каждой ступени выдер-

живали образцы в течение суток.

Режимы охлаждения и отогрева регистрировали

хромель-копелевой термопарой при скоростях 0,01–

0,1°С/ч тестером EC-890G, 70–800°C/мин – графо-

построителем Н-307.

Влияние эффектов низкотемпературной субли-

мации внутриклеточной воды и плазмолиза изучали

на основе исследования параметров сохранности и

жизнеспособности черенков, которые контро-

Then the cuttings were divided into the groups for

drying by three regimens: active, semi-active, passive.

The humidity rate of native cuttings was changed from

50 down to 30% according to these drying regimens:

C1 active – the drying chamber with temperature of

20 ± 2°C, 25 ± 5% air humidity and 3 days of

exposure; C2 semi-active – temperature of 5 ± 2°C

and 75 ± 5% air humidity; C3 passive – temperature

of –2 ± 2°C and 85 ± 5% air humidity [3]. The tips of

cuttings were treated with wax or paraffin wax prior

to cooling for humidity preservation.

The various rates of freezing necessary for cryo-

preservation of cuttings were obtained in two stages.

At stage 1 the freezing regimen, based on stepwise

cooling with 0.1...0.01°C/hr rate was used. The

samples were placed into domestic thermos flasks of

1.5 and 2 l, then into freezers and cooled down to

–5...–30°C with 5°C interval and 1, 3 and 7 days of

exposure, correspondingly. At stage 2 a part of samp-

les after their cooling down to –20 and –30°C were

taken out of thermos flasks, placed into linen bags

and plunged into liquid nitrogen with 600–800°C/min

rate. The samples were stored in freezers under –5,

–20 and –30°C and in liquid nitrogen with exposure

from a day to a year.

After sample freezing down to –196°C three tha-

wing regimens were used. Samples for the 1

regi-

mens were thawed with the rate of 70°C/min in air

under 20°C. At 2

regimen with 1–3°C/min samples

were put into domestic thermos flask, placing into

freezer under 5°C. The 3

regimen was based on

stepwise thawing with 0.1°C/hr rate: at 1

, 2nd, 3rd,

4th and 5th stages it was warmed to –30, –20, –10,

–5 and 5°C, correspondingly. When achieving the

fixed temperature at each stage the samples were

exposed during a day.

The cooling and thawing regimens were recorded

by chromel-copel thermocouple at 0.01–0.1°C/hr

rates with EC-890G tester and 70–800°C/min with

H-307 plotter.

Effects of low temperature sublimation of intra-

cellular water and plasmolysis were investigated on

the base of studying the survival and viability para-

meters of cuttings, which were controlled after each

drying and freezing stage. The cuttings were placed

for hydration into exicator above distilled water, expo-

sed during 12 days under 5°C and then grown in vitro

(in the glass of water at 25°C). Swelling and growth

of buds testified to viability of the studied sample.

The percentage of sample viability was estimated as

a ratio of cuttings’ number with opened buds to their

total number in the sample in vitro.

The integrity index was determined by histologic

sections of buds and cuttings, morphoanatomic studies

with use of MBS-9 microscope under 28-fold magni-

fication (preparing of buds and wood with determining

of their damage area by color) [5].