Журнал - Проблемы криобиологии 2009 №3

Подождите немного. Документ загружается.

361

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹3

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹3

Chen K., Wei Y., Sharp G.C., Braley-Mullen H. Induction of

experimental autoimmune thyroiditis in IL-12

-/-

mice // J.

Immunol.– 2001.– Vol. 167, N3.– P. 1720–1727.

Fistfalen M.E., De Groot Z.J. Molecular Endocrinology. Basic

Concepts and Clinical Correlation / Ed. B.D. Weintraub.– New

York, 1995.– P. 319–370.

Goltsev A.N., Babenko N.N., Dubrava T.G. et al. Modification

of the state of bone marrow hematopoietic cells after

cryopreservation // International Journal of Refrigeration.–

2006.– Vol. 29, N3.– Р. 358–367.

Goltsev A.N., Grischenko V.I., Sirous M.A. et al. Cryopreser-

vation: an optimizing factor for therapeutic potential of feto-

placental complex products // Biopreservation and

Biobanking.– 2009.– Vol. 7, N1.– P. 29–38.

Kvanstrom M., Jenmalm M.C., Ekerfelt C. Effect of cryo-

preservation on expression of Th1 and Th2 cytokines in blood

mononuclear cells from patients with different cytokine

profiles, analysed with three common assays: an overall

decrease of interleukin-4 // Cryobiology.– 2004.– Vol. 49, N2.–

P. 157–168.

Morrison S., Hemmati H., Wandyez A., Weissmon I. The

purification characterization of fetal liver hematopoietic stem

cells // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.– 1995.– Vol. 92, N22.–

P. 10302–10306.

Parish N.M., Cooke A. Mechanisms of autoimmune thyroid

disease // Drug Discovery Today: Disease Mechanisms.–

2004.– Vol. 1, N3.– P. 337–344.

Ringden O., Uzunel M., Rasmusson I. et al. Mesenchymal

stem cells for treatment of therapy-resistant graft-versus-

host disease // Transplantation.– 2006.– Vol. 81, N10.–

P. 1390–1397.

Sanchez А., Pagan R., Alvarez A.M. et al. Transforming

growth factor-β (TGF-β) and EGF promote cord-like structures

that indicate terminal differentiation of fetal hepatocytes in

primary culture// Exp. Cell Res.– 1998.– Vol. 242, N1.– P. 27–

37.

Taylor M.J., Duffy T.J., Hunt C.J. et al. Transplantation and in

vitro perfusion of rat islets of Langerhans after slow cooling

and warming in the presence of either glycerol or dimethil

sulfoxide // Cryobiology.– 1983.– Vol. 2, N2.– P. 185–204.

Tyndall A., Passwerg J., Gratwohl A. Haemopoietic stem cell

transplantation in the treatment of severe autoimmune

diseases 2000 // Ann. Rheum. Dis.– 2001.– Vol. 60, N7.–

Р. 702–707.

Witebsky E., Rose N.R., Terplan K., Rain J.R. Chronic

thyroiditis and autoimmunization // J.A.M.A.– 1957.– Vol.164,

N13.– P. 1439–1447.

Поступила 19.05.2009

Рецензент Е.А. Гордиенко

26.

27.

28.

29.

30.

31.

32.

33.

34.

35.

36.

37.

Chen K., Wei Y., Sharp G.C., Braley-Mullen H. Induction of

experimental autoimmune thyroiditis in IL-12

-/-

mice // J.

Immunol.– 2001.– Vol. 167, N3.– P. 1720–1727.

Fistfalen M.E., De Groot Z.J. Molecular Endocrinology. Basic

Concepts and Clinical Correlation / Ed. B.D. Weintraub.– New

York, 1995.– P. 319–370.

Goltsev A.N., Babenko N.N., Dubrava T.G. et al. Modification

of the state of bone marrow hematopoietic cells after

cryopreservation // International Journal of Refrigeration.–

2006.– Vol. 29, N3.– Р. 358–367.

Goltsev A.N., Grischenko V.I., Sirous M.A. et al. Cryopreser-

vation: an optimizing factor for therapeutic potential of feto-

placental complex products // Biopreservation and

Biobanking.– 2009.– Vol. 7, N1.– P. 29–38.

Kvanstrom M., Jenmalm M.C., Ekerfelt C. Effect of cryo-

preservation on expression of Th1 and Th2 cytokines in blood

mononuclear cells from patients with different cytokine

profiles, analysed with three common assays: an overall

decrease of interleukin-4 // Cryobiology.– 2004.– Vol. 49, N2.–

P. 157–168.

Morrison S., Hemmati H., Wandyez A., Weissmon I. The

purification characterization of fetal liver hematopoietic stem

cells // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.– 1995.– Vol. 92, N22.–

P. 10302–10306.

Parish N.M., Cooke A. Mechanisms of autoimmune thyroid

disease // Drug Discovery Today: Disease Mechanisms.–

2004.– Vol. 1, N3.– P. 337–344.

Ringden O., Uzunel M., Rasmusson I. et al. Mesenchymal

stem cells for treatment of therapy-resistant graft-versus-

host disease // Transplantation.– 2006.– Vol. 81, N10.–

P. 1390–1397.

Sanchez А., Pagan R., Alvarez A.M. et al. Transforming

growth factor-β (TGF-β) and EGF promote cord-like structures

that indicate terminal differentiation of fetal hepatocytes in

primary culture// Exp. Cell Res.– 1998.– Vol. 242, N1.– P. 27–

37.

Taylor M.J., Duffy T.J., Hunt C.J. et al. Transplantation and in

vitro perfusion of rat islets of Langerhans after slow cooling

and warming in the presence of either glycerol or dimethil

sulfoxide // Cryobiology.– 1983.– Vol. 2, N2.– P. 185–204.

Tyndall A., Passwerg J., Gratwohl A. Haemopoietic stem cell

transplantation in the treatment of severe autoimmune

diseases 2000 // Ann. Rheum. Dis.– 2001.– Vol. 60, N7.–

Р. 702–707.

Witebsky E., Rose N.R., Terplan K., Rain J.R. Chronic

thyroiditis and autoimmunization // J.A.M.A.– 1957.– Vol.164,

N13.– P. 1439–1447.

Accepted in 19.05.2009

26.

27.

28.

29.

30.

31.

32.

33.

34.

35.

36.

37.

362

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹3

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹3

* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:

ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.:+38

(057) 373-41-35, факс: +38 (057) 373-30-84, электронная почта:

cryo@online.kharkov.ua

* To whom correspondence should be addressed: 23, Pereyaslavskaya

str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 4135, fax: +380 57

373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua

Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-

tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine

Институт проблем криобиологии и криомедицины

НАН Украины, г. Харьков

УДК 616.72-018.3:615.361.018.5.013.8

А.К. ГУЛЕВСКИЙ*, В.И. ГРИЩЕНКО, Е.Г. ИВАНОВ

Стимуляция репаративной регенерации суставного хряща

под влиянием низкомолекулярной фракции

кордовой крови (до 5 кДа)

UDC 616.72-018.3:615.361.018.5.013.8

A.K. GULEVSKY*, V.I. GRISCHENKO, E.G. IVANOV

Stimulation of Reparative Regeneration of Articular Cartilage

Under the Effect of Cord Blood Low Molecular

Fraction (below 5 kDa)

Изучали особенности репаративной регенерации суставного хряща у крыс под влиянием низкомолекулярной фракции

(до 5 кДа), выделенной из криогемолизата кордовой крови, и препарата сравнения “Актовегина”. Установлены особенности

биохимического состава хрящевой ткани в условиях эксперимента. Рентгенологически выявлено положительное морфоло-

гическое изменение состояния хрящевой ткани. Проведенное исследование показало нормализацию двигательной активности

крыс к 28 суткам эксперимента.

Ключевые слова: репаративная регенерация, хрящ, жидкий азот, кордовая кровь, “Актовегин”, оксипролин, тирозин,

гексозамин, гексуроновые кислоты, гиалуроновая кислота, хондроитинсульфаты, гепарин.

Вивчали особливості репаративної регенерації суглобного хряща у щурів під впливом низькомолекулярної фракції (до 5

кДа), виділеної з кріогемолізату кордової крові, та препарату порівняння “Актовегіну”. Встановлені особливості біохімічного

складу хрящьової тканини в умовах експерименту. Рентгенологічно виявлена позитивна морфологічна зміна стану хрящьової

тканини. Проведене дослідження показало нормалізацію рухової активності щурів на 28 добу експерименту.

Ключові слова: репаративна регенерація, хрящ, рідкий азот, кордова кров, “Актовегін”, оксипролін, тирозин, гексозамін,

гексуронові кислоти, гіалуронова кислота, хондроїтінсульфати, гепарин.

There were studied the features of reparative regeneration of articular cartilage in rats under the effect of low molecular fraction

(below 5 kDa), isolated from cord blood cryohemolysate and the reference substance “Actovegin”. The peculiarities of biochemical

composition of cartilage tissue under experimental conditions were established. Positive morphological change in cartilage tissue state

was radiologically shown. The research performed demonstrated the normalisation of locomotor activity in rats to the 28

day of

research.

Key-words: reparative regeneration, cartilage, liquid nitrogen, Actovegin, oxyproline, tyrosine, hexosamine, hexuronic acids, hyaluronic

acid, chondroitin sulfates, heparin.

Одной из актуальных задач современной трав-

матологии является эффективное лечение повреж-

дений суставного хряща различной этиологии.

Среди лекарственных препаратов, способствую-

щих репаративной регенерации хряща, наиболее

эффективны те, в состав которых включены гиа-

луроновая кислота, хондроитинсульфат и глюкоза-

мин (“Артрон”, “Хондроксид”, “Терафлекс”). Их

действие связано с активацией ферментных систем

хондроцитов, ответственных за синтез элементов

матрикса хряща по типу обратной связи [4–6]. Кро-

ме того, существуют препараты, активирующие

энергетический обмен в хондроцитах за счет низ-

комолекулярной фракции (до 5 кДа) из крови телят

(“Солкосерил” и “Актовегин”). В результате наших

исследований [2] сделано предположение, что

препарат на основе низкомолекулярной фракции (до

One of the actual tasks in current traumatology is

an efficient treatment of articular cartilage damages

of different etiology. Among the drugs, contributing to

the cartilage reparation, the most efficient are those,

comprising hyaluronic acid, chondroitin sulfate and

glucosamine (“Arthron”, “Chondroxide”, “Theraflex”).

Their effect is associated to the activation of chondro-

cyte enzyme systems, responsible for the feedback

synthesis of cartilage matrix elements [4–6]. In

addition, there are the preparations, activating an ener-

getic metabolism in chondrocytes due to a low mole-

cular fraction (below 5 kDa) from calf blood (“Solco-

seryl” and “Actovegin”). As a result of our research

[2], the preparation, based on a low molecular fraction

(below 5 kDa) of bovine blood, isolated from cattle

cord blood cryohemolysate, was suggested as capable

to stimulate the cartilage tissue regeneration.

363

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹3

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹3

5 кДа) крови коров, выделенной из криогемолизата

кордовой крови крупного рогатого скота, может

стимулировать регенерацию хрящевой ткани.

Цель работы – изучение особенностей регене-

рации суставного хряща крыс после механической

травмы, применения низкомолекулярной фракции

из кордовой крови коров и “Актовегина”.

Материалы и методы

Низкомолекулярную фракцию кордовой крови

(ФКК) коров выделили по методу [2]. Исследова-

ние выполняли на 40 крысах-самцах линии Wistar

массой 290–310 г.

Животных распределили на 4 группы по 10 осо-

бей в каждой: 1 – здоровые животные (норма); 2 –

животные с травмой хряща, не получавшие лечения

(контроль); 3 – экспериментальные животные с

травмой хряща, которым в течение всего срока

исследования внутримышечно вводили ФКК в дозе

1,17 мг на 100 г массы тела (группа ФКК); 4 – экс-

периментальные животные с травмой хряща, кото-

рым в течение всего срока исследования внутри-

мышечно вводили “Актовегин” (Nycomed, Авст-

рия) в дозе 1,17 мг на 100 г массы тела (группа

“Актовегин”).

Механический дефект хряща был осуществлен

[3, 7] электрической бормашиной с наконечником

в форме усеченного конуса (длина рабочей поверх-

ности наконечника составляет 4 мм, диаметр вни-

зу – 0,7 мм, вверху – 0,5 мм) высверливанием

отверстия в хряще (дистальный отдел бедренной

кости от межмыщелковой зоны вглубь метадиа-

физа) длиной 4 мм и диаметром до 0,7 мм.

На 7, 14, 21 и 28-е сутки с момента моделиро-

вания механического повреждения хряща колен-

ного сустава оценивали состояние двигательной

активности крыс по методу [1], а также определяли

содержание биохимических компонентов матрикса

в регенерате хряща: тирозина [6], гексозамина [8],

оксипролина [12], гексуроновых кислот [9], гиалу-

роновых кислот, гепарина и хондроитинсульфатов

(гликозаминогликаны) [6]. Сразу после моделиро-

вания механической травмы хряща и на 28-е сутки

наблюдения с помощью аппарата РУМ-4 (Россия)

проведено рентгенологическое исследование пов-

режденного участка.

Эксперименты проведены в соответствии с

“Общими принципами экспериментов на живот-

ных”, одобренными II Национальным конгрессом

по биоэтике (20.09.04, Киев, Украина) и согласован-

ными с положениями “Европейской конвенции о

защите позвоночных животных, используемых для

экспериментальных и других научных целей”

(Страсбург, 1985).

The research aim is to study the regeneration

peculiarities of articular cartilage in rats after mecha-

nical trauma, application of low molecular fraction from

bovine cord blood and “Actovegin”.

Materials and methods

The low molecular bovine cord blood fraction

(CBF) was isolated according to the method [2]. The

research was done in 40 Wistar male rats of 290–310 g.

Animals were divided into 4 groups by 10 indivi-

duals in each: 1 – healthy animals (the norm); 2 – the

animals with cartilage trauma, non-treated (the cont-

rol); 3 – experimental animals with cartilage trauma

with CBF intramuscular injection in the dose of 1.17 mg

per 100 g of body weight within the whole research

period (CBF group); 4 – those with cartilage trauma

with intramuscular injection of “Actovegin” (Nycomed,

Austria) in the dose of 1.17 mg per 100 g of body

weight within the whole research period (“Actovegin”

group).

Mechanical cartilage defect was done [3, 7] using

an electric drill with a handpiece in the form of flatte-

ned cone (4 mm length of handpiece operative surface,

0.7 and 0.5 mm of upper and lower diameters, corres-

pondingly) by drilling the hole in the cartilage (femur

distal part from an intercondylar area into the depth of

methadiaphys) of 4 mm length and up to 0.7 mm dia-

meter.

To the 7

, 14

, 21

and 28

days from the moment

of modelling of knee joint cartilage mechanical damage

there was assessed the state of locomotor activation

in rats by the method [1], as well as the content of

biochemical component of matrix in cartilage regene-

rate: tyrosine [6], hexosamine [8], oxyproline [12],

hexuronic acids [9], hyaluronic acids, heparin and

chondroitin sulfate (glycosaminglycans) [6] was deter-

mined. Right after modelling the cartilage mechanical

damage and to the 28

observation day using the

RUM-4 device (Russia) there was performed an X-ray

study of a damaged site.

Experiments were done according to the “General

ethical principles of experiments in animals”, approved

by the 2

National Congress on Bioethics (Kiev, 2004)

and agreed with the statements of the “European

Convention for the Protection of Vertebrate Animals

Used for Experimental and Other Scientific Purposes”

(Strasbourg, 1985).

The data were statistically processed with the

Microsoft Excel 2003 software using the Mann-

Whitney U-test.

Results and discussion

Cord blood and the one of animals of early onto-

genesis has quite a high biological potential, stipulated

Контроль ФКК "Актовегин"

364

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹3

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹3

Данные статистически обрабатывали с по-

мощью программы Microsoft Excel 2003 с использо-

ванием U-критерия Манна-Уитни.

Результаты и обсуждение

Кордовая кровь и кровь животных раннего

онтогенеза обладает чрезвычайно высоким биоло-

гическим потенциалом, который обусловлен сба-

лансированностью специфичных компонентов,

поддерживающих и активирующих клеточный

метаболизм. Особый интерес в этом отношении

представляет низкомолекулярная фракция (до

5 кДа) кордовой крови крупного рогатого скота,

которая способна стимулировать клеточный мета-

болизм, что в частности было установлено для

“Солкосерила” и “Актовегина”, полученных из

онтогенетически близкого источника – крови мо-

лочных телят[2].

Установлено, что ФКК стимулирует образова-

ние хрящевой ткани после механической травмы,

однако рентгенологический анализ показал, что

даже на 28-е сутки дефект хряща сохраняется. В

группе животных с введением ФКК площадь

повреждения на 28-е сутки составляла 7 мм

, что

достоверно меньше, чем в контроле и больше , чем

в группе с введением “Актовегина” (рис. 1).

Интенсивность образования хрящевой ткани

определяется биосинтезом в хондроцитах матрик-

са гексозамина, гексуроновых кислот, тирозина,

оксипролина, гиалуроновой кислоты, гепарина,

хондроитинсульфатов и активностью фиброблас-

тов, синтезирующих соединительнотканные эле-

менты регенерата хряща [6, 10, 11].

Данные о содержании гликозаминогликановых

и протеогликановых компонентов в ткани хряща

на 21-е сутки после нанесения травмы представ-

лены в таблице.

Под влиянием ФКК и “Актовегина” в регене-

рате хряща достоверно увеличивается содержание

всех исследуемых биохимических компонентов

матрикса хрящевой ткани, особенно гиалуроновой

кислоты. После введения “Актовегина” уровень

последней в регенерате хряща выше в 6,3 раза,

чем в группе животных, не получавших лечения.

Под влиянием ФКК содержание гиалуроновой

кислоты увеличивается всего в 3,3 раза по сравне-

нию с группой животных, не получавших лечения.

Однако к 21-м суткам наблюдения после примене-

ния ФКК и “Актовегина” содержание гиалуроновой

кислоты значительно ниже, чем в группе здоровых

животных.

Установлено, что под влиянием ФКК содержа-

ние хондроитинсульфатов увеличивается в 4,2 раза

по сравнению с группой животных, не получавших

лечения, а под влиянием препарата сравнения “Ак-

товегина” – в 2,4 раза. Вместе с тем к 21-м суткам

Рис. 1. Площадь повреждения хряща на 28-е сутки,

вычисленная по рентгенограммам: * – p < 0,05 по срав-

нению с группой животных, не получавших лечения.

Fig. 1. Injury cartilage area to 28

day, calculated with X-

ray patterns: *− p < 0.05 if compared with the group of non-

treated animal

Площадь повреждения, мм

Injury area, mm

CBF “Actovegin”Control

with the balance of specific components, supporting

and activating their cell metabolism. Of special interest

in this respect is low molecular fraction (below 5 kDa)

of cattle cord blood, enabling to sharply increase the

cell energetic potential, in particular this was established

for “Solcoseryl” and “Actovegin” originated from the

ontogenetically close source, vealer blood [2].

It has been established that CBF stimulates the

formation of cartilage tissue after mechanical trauma

but X-ray analysis has shown the preservation of

cartilage defect even to the 28

day. In the group of

CBF-injected animals the area of damage to the 28

day made 7 mm

, that was statistically lower than in

the control and higher if compared with the group with

“Actovegin” (Fig. 1).

Intensity of cartilage formation is determined by

biosynthesis in chondrocytes of matrix of hexosamine,

gexuronic acids, tyrosine, oxyproline, hyaluronic acid,

heparin and chondroitin-sulfates and activity of

fibroblasts, synthesizing connective tissue elements of

cartilage regenerate [6, 10, 11].

The data on the content of glucosamine glycans

and proteoglycan components in cartilage tissue after

trauma initiation are presented in the table.

Under CBF effect and “Actovegin” in the cartilage

regenerate the content of all the studied biochemical

components of cartilage tissue matrix increases, es-

pecially of hyaluronic acid. After “Actovegin” introduc-

tion the level of the latter in cartilage regenerate is 6.3

times higher than in the group of non-treated animals.

Under CBF effect the content of hyaluronic acid in-

creases only in 3.3 times if compared with the group

of non-treated animals. However to the 21

observation

day after application of CBF and “Actovegin” the content

365

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹3

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹3

Содержание основных элементов матрикса в регенерате хряща после его механической травмы на 21-е сутки

Content of matrix basic elements in cartilage regenerate after its mechanic trauma to the 21

day

Примечание: * – p < 0,05 по сравнению с группой животных, не получавших лечения.

Note: * − p < 0.05 if compared with the group of non-treated animals.

наблюдения содержание хондроитинсульфатов в

хрящевой ткани опытных животных существенно

ниже, чем в группе здоровых.

Аналогичную картину наблюдали при исследо-

вании гексозамина, уровень которого при использо-

вании ФКК и “Актовегина” повышался соответст-

венно в 1,7 и 1,8 раза по сравнению с контрольной

группой животных. Важно отметить, что при вве-

дении ФКК и препарата сравнения уровень гексо-

замина достоверно не отличался от такового в

группе здоровых животных, что свидетельствует

о стимуляции метаболизма.

В опытных группах и группе животных, не полу-

чавших лечения, отмечено различное содержание

гепарина. В частности, под влиянием ФКК его со-

держание в регенерате хряща увеличивается в

2,1 раза. Содержание гепарина в регенерате хряща

при введении ФКК и “Актовегина” незначительно

отличается от такового в группе здоровых живот-

ных.

Аналогичные изменения выявлены при исследо-

вании содержания в регенерате хряща гексуроно-

вых кислот: под влиянием ФКК и препарата срав-

нения оно увеличивается в 1,6 и 1,7 раза соответ-

ственно по сравнению с группой животных, не полу-

чавших лечения. После применения ФКК и

“Актовегина” уровень гексуроновых кислот в реге-

нерате хряща был ниже в 1,3 и 1,4 раза соответст-

венно, чем в группе здоровых животных.

Для изучения механизма действия ФКК и

“Актовегина” на регенерацию хряща оценивали

содержание основных компонентов матрикса не

только в самом регенерате хряща опытных живот-

ных, но и в хрящевой ткани здоровой конечности

of hyaluronic acid is significantly lower than in the group

of healthy animals.

It has been established that under the effect of CBF

the content of chontroitin-sulfates increases in 4.2 times

versus the group of non-treated animals, and under

the effect of “Actovegin” it was in 2.4 times higher. In

addition to the 21

observation day the content of

chondroitin sulfates in cartilage tissue of experimental

animals was significantly lower than in the group of

healthy ones.

The same picture was observed when investigating

hexosamine, the level of which when using CBF and

“Actovegin” increased, correspondingly, in 1.7 and 1.8

times if compared with the control group of animals. It

is important to note that during introduction of CBF

and the preparation to compare the level of hexosamine

did not statistically differ from that in the group of

healthy animals, that testified to a high stimulation of

metabolism.

In experimental groups and the one of non-treated

animals different content of heparin was noted. In

particular, under the CBF effect its content in cartilage

regenerate increases in 2.1 times. Heparin content in

cartilage regenerate when introducing CBF and “Acto-

vegin” slightly differs from that in the group of healthy

animals.

The same changes were found when investigating

the content of hexuronic acids in cartilage regenerate:

under CBF effect and the preparation to compare it

increases in 1.6 and 1.7 times, correspondingly with

the group of non-treated animals. After application of

CBF and “Actovegin” the level of hexuronic acids in

cartilage regenerate was lower in 1.3 and 1.4 times,

correspondingly versus the group of healthy animals.

хынтовижыппурГ

spuorglaminA

%/гм,нимазоскеГ

%/gm,enimasoxeH

еывонорускеГ

%/гм,ытолсик

sdicacinoruxeH

%/gm

яавонорулаиГ

%/гм,атолсик

,dicacinorulayH

%/gm

нитиордноХ -

%/гм,ытафьлус

,setaflusnitiordnohC

%/gm

%/гм,нирапеГ

%/gm,nirapeH

хывородзаппурГ

)1(хынтовиж

laminayhtlaeH

)1(puorg

20,0±36,0 * 960,0±4,1 * 430,0±43,0 * 400,0±32,0 * 900,0±12,0 *

ен,хынтовижаппурГ

яинечелхишвачулоп

)2(

nonfopuorG - detaert

)2(slamina

920,0±43,030,0±16,020,0±40,0700,0±40,0700,0±70,0

)3(KKФ

)3(FBC

230,0±46,0 * 670,0±10,1 * 20,0±41,0 * 210,0±71,0 * 310,0±51,0 *

)4("нигевоткА"

)4("nigevotcA"

540,0±66,0 * 170,0±80,1 * 710,0±62,0 * 900,0±1,0 * 10,0±51,0 *

ьнактяавещярХ

йоннаворимвартен

итсонченок

foeussitegalitraC

non - bmildezitamuart

410,0±6,0 * 280,0±34,1 * 810,0±13,0 * 800,0±22,0 * 300,0±32,0 *

366

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹3

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹3

тех же крыс. Из данных таблицы, можно заклю-

чить, что ФКК и препарат сравнения достоверного

влияния на содержание компонентов матрикса не

оказывают, что, вероятнее всего, свидетельствует

о их направленном биологически активном

действии на пораженную хрящевую ткань.

В дальнейшем изучали влияние ФКК и “Акто-

вегина” на концентрацию в регенерате хряща окси-

пролина и тирозина, по уровню которых можно

определить содержание коллагеновых и неколлаге-

новых белков хряща [6, 10, 11], являющихся крите-

рием активности фибробластов и хондроцитов в

травмированном хряще [4, 12].

Из рис. 2 видно, что содержание тирозина в

регенерате хряща групп животных с введением

ФКК и “Актовегина” вдвое выше по сравнению с

группой животных, не получавших лечения. В

случае применения ФКК и “Актовегина” уровень

тирозина к 21-м суткам после нанесения травмы

ниже в 1,9 раза, чем в группе здоровых животных.

Содержание оксипролина в регенерате хряща

после применения ФКК в 2 раза выше по сравне-

нию с группой животных, не получавших лечения,

в то время как после введения препарата сравнения

значительных изменений по сравнению с контроль-

ными животными не выявлено. Установлено, что

содержание оксипролина в регенерате хряща после

применения ФКК меньше в 1,2 раза, чем в группе

здоровых животных. Очевидно, что ФКК значи-

тельно стимулирует синтез оксипролина в поражен-

ной хрящевой ткани. Как и при исследовании

протеогликановых компонентов, не выявлены дос-

товерные отличия в содержании данных амино-

кислот в хряще здоровой конечности опытных

животных по сравнению с нормой.

Таким образом, исследование биохимических

по-казателей позволило установить, что внутримы-

шечное введение ФКК стимулирует накопление

основных элементов матрикса и соединительно-

тканных элементов хряща на протяжении всего

срока эксперимента. Это объясняет более быст-

рое восстановление структурно-функциональных

свойств травмированного хряща под влиянием

препарата ФКК по сравнению с контролем.

Для более точного установления эффективности

проведенного лечения изучали динамику двига-

тельной активности экспериментальных животных.

Из рис. 3 видно, что введение ФКК и “Актовегина”

стимулирует нормализацию двигательной актив-

ности значительно быстрее (на 7-е сутки – в 1,7 и

1,6 раза, 14-е сутки – в 1,4 и 1,3 раза соответ-

ственно, 21 и 28-е сутки – 1,2 раза) по сравнению с

группой животных, не получавших лечения.

Достоверные отличия влияния ФКК и “Актове-

гина” по сравнению с группой животных, не полу-

чавших лечения, отмечены уже на 7-е сутки наб-

Рис. 2. Содержание аминокислот в регенерате хряща на

21-е сутки: – тирозин; – оксипролин; Здор. кон. –

здоровая конечность животных опытных групп; * –

р < 0,05 по сравнению с контролем.

Fig. 2. Content of aminoacids in cartilage regenerate to the

day: – tyrosine; – oxyproline; Non-inj. – non-injuired

limb of animal experimental groups; * – p < 0.05 if compared

with the control.

0,5

1,5

2,5

3,5

Контроль Норма Здор. кон. ФКК "Ак то ве гин "

Control

Содержание, мг/%

Content, mg/%

Norm Non-inj. CBF “Aktovegin“

To study the effect mechanisms of CBF and

“Actovegin” on cartilage regeneration the content of

main matrix components not only in the cartilage

regenerate itself and in cartilage tissue of rat’s healthy

extremity was studied. The table data show that CBF

and the preparation to compare render no statistically

significant effect on the content of the matrix compo-

nents, likely testifying to their directed active effect

on the impaired cartilage tissue.

Later there was studied the effect of CBF and

“Actovegin” on concentration of oxyproline and tyrosi-

ne in cartilage regenerate, according to the level of

those the content of collagen and non-collagen cartilage

proteins [6, 10, 11], being the criteria of the activity of

fibroblasts and chondrocytes in the traumatized

cartilage may be examined [4, 12].

Fig. 2 demonstrates that the content of tyrosine in

cartilage regenerate of the animals from the groups

injected with CBF and “Actovegin” was twice higher

if compared with those non-treated. In case of applying

the CBF and “Actovegin” tyrosine level to the 21

day of trauma initiation was lower in 1.9 times, than in

the group of healthy animals. Oxyproline content in

cartilage regenerate after application of CBF is two

times higher if compared with the group of non-treated

animals, meanwhile after injection of the preparation

to compare no significant changes versus non-treated

animals were found. It has been established that oxy-

proline content in cartilage regenerate after application

of CBF is 1.2 times less than in the group of healthy

animals. It is evident that CBF strongly stimulates the

synthesis of oxyproline in a damaged cartilage tissue.

As well as during studying the proteoglycan compo-

367

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹3

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹3

людения. Достоверных отличий влияния ФКК и

“Актовегина” на двигательную активность крыс

не выявлено. У животных, не получавших лечения,

двигательная активность не восстанавливалась

даже к 28-м суткам.

Выводы

Установлено, что ФКК и “Актовегин” в эквива-

лентных дозах стимулируют накопление основных

компонентов матрикса в регенерате хряща (гексо-

замина, гексуроновых кислот, гиалуроновой

кислоты, гепарина и хондроитинсульфатов), а также

важнейших аминокислот (оксипролина и тирозина),

отражающих содержание коллагеновых и неколла-

геновых элементов хряща. Это позволяет сделать

заключение о положительном влиянии обоих препа-

ратов на репаративную регенерацию хряща. Полу-

ченные экспериментальные данные подтверждены

рентгенологическим исследованием хряща и ре-

зультатами функциональной диагностики конечнос-

ти подопытного животного. При сопоставлении

ФКК и “Актовегина” выявлено, что эффективность

ФКК практически аналогична действию “Актове-

гина” в эквивалентных дозах.

Литература

Гацура В.В. Методы первичного фармакологического

исследования биологической активности.– М.: Медицина,

1974.– 143 с.

Гулевский О.К., Грищенко В.І., Моісєєва Н.М. Властивості

і перспективи викорастання кордової крові в клінічній

практиці // Укр. журн. гематології та трансфузіології.– 2005,

№4.– С. 5–14.

7142128

Рис. 3. Динамика двигательной активности крыс:  –

норма;  – контроль; 0 – “Актовегин”;  – ФКК; * –

p < 0,05 по сравнению с контролем.

Fig. 3. Dynamics of rats’ motion activity:  – norm;  –

control; 0 – “Actovegin”;  – CBF; * – p < 0.05 if compared

with the control.

Продолжительность наблюдения, суток

Observation term, days

Продолжительность двигательной

активности, мин

Motion activity duration, min

nents no statistically significant differences were found

in the content of these amino acids in the cartilage of

healthy extremity of experimental animals if compared

with the norm.

Thus the investigation of biochemical indices

demonstrates that intramuscular injection of CBF

significantly stimulates the accumulation of the main

elements of the matrix and connective tissue elements

in cartilage within the whole experimental term. This

explain more rapid recovery rates of the traumatized

cartilage if compared with control.

For elucidation of the efficiency of the performed

treatment the dynamics of motor activity of experi-

mental animals was studied. Fig. 3 shows that injection

of CBF and “Actovegin” stimulates the normalization

of motor activity much more rapid (to the 7

day in

1.7 times and 1.6 times, to the 14

in 1.4 and 1.3 times,

correspondingly, to the 21

and 28

days in 1.2 times)

if compared with the group of non-treated animals.

Significant differences of the effect of CBF and “Acto-

vegin” if compared with the group of non-treated ani-

mals were found even to the 7

observation day.

Statistically significant differences of CBF and “Acto-

vegin” effect on motor activity in rats were not revea-

led. In non-treated animals the motor activity did not

recover even to the 28

day.

Conclusions

It has been established that CBF and “Actovegin”

under equivalent doses stimulate the accumulation of

main components of the matrix in cartilage regenerate

(hexosamine, hexuronic acids, hyaluronic acid, heparin

and chondroitin sulfates), as well as the most important

amino acids (oxyproline and tyrosine), reflecting the

content of collagen and non-collagen cartilage ele-

ments. This enables to conclude about positive effect

of both preparations on cartilage reparative regene-

ration. The experimental findings are confirmed with

X-ray examination of the cartilage and the results of

functional diagnostics of the limbs of experimental

animal. When comparing CBF and “Actovegin” there

was found that the efficiency of CBF is quite similar

to the one of “Actovegin” under equivalent doses.

References

Gatsura V.V. Methods of initial pharmacological study of

biological activity.– Moscow: Meditsina, 1974.– 143 p.

Gulevsky O.K., Grischenko V.I., Moiseeva N.M. Peculiarities

and perspectives of cord blood use in clinical practice//

Ukrainskiy Zhurnal Gematologii ta Transfuziologii.– 2005.–

N4.– P. 5–14.

Malyshkina S.V. Structure-metabolic changes of articular

cartilage after local cryoeffect: Authors’ abstract of thesis

of candidate of biol. sciences.– Kharkov, 1985.– 22 p.

Pavlova V.N., Kop’eva T.N., Slutskiy L.I., Pavlov G.G. Carti-

lage.– Moscow: Meditsina, 1988.– 320 p.

368

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹3

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹3

Малышкина С.В. Структурно-метаболические изменения

суставного хряща после локального криовоздействия:

Автореф. дис. ... канд. биол. наук.– Харьков, 1985.– 22 с.

Павлова В. Н., Копьева Т. Н., Слуцкий Л. И., Павлов Г. Г.

Хрящ.– М.: Медицина, 1988.– 320 с.

Риггз Б.Л., Мелтон III Л.Дж. Остеопороз.– М.-СПб.:

Издательство БИНОМ, “Невский диалект”, 2000.– 560 с.

Слуцкий Л.И. Биохимия нормальной и патологически

измененной соединительной ткани. – Л.: Медицина, 1969.–

376 с.

Тарасенко В.И. Криовоздействие при артропластике

тазобедренного сустава: Автореф. дис. ... канд. мед.

наук.– Харьков, 1989.– 18 с.

Boas N.P. Method for the determination of hexosamines in

tissues // J. Biol. Chem.– 1953. – Vol. 204, N2.– P. 553–562.

Dische Z. A new specific color reaction of hexuronic acid //

J. Biol. Chem.– 1947.– Vol. 167, N1.– P. 189–198.

Jordan J.M., Helmick C.G., Renner J.B. et al. Prevalence of

knee symptoms and radiographic and symptomatic knee

osteoarthritis in African Americans and Caucasians: The

Johnston County Osteoarthritis Project // J. Rheumatol.–

2007.– Vol. 34, N1.– P. 172–180.

Kongtawelert P., Francis D.L., Brooks P.M., Ghosh P.

Application of an enzyme-linked immunosorbent-inhibition

assay to quantitate the release of KS peptides into fluids of

the rat sub-cutaneous air pouch model and the effects of

chondroprotective drugs on the release process // Rheumatol.

Int.– 1989.– Vol. 9, N2.– P. 77–83.

Stegemann H., Stalder P. Determination of hydroxiproline //

Clin. Chim. Acta.– 1967.– Vol. 18, N2.– P. 267–273.

Поступила 16.08.2009

Рецензент Н.А. Волкова

10.

11.

12.

Riggz B.L., Melton L.J. Osteoporosis.– Saint Petersburg:

BINOM, Nevsky dialect, 2000.– 560 p.

Slutsky L.I. Biochemistry of normal and pathologically changed

connective tissue.– Leningrad: Meditsina, 1969.– 376 p.

Tarasenko V.I. Cryoeffect at hip joint arthroplasty: Authors’

abstract of thesis of candidate of med. sciences.– Kharkov,

1989.– 18 p.

Boas N.P. Method for the determination of hexosamines in

tissues // J. Biol. Chem.– 1953. – Vol. 204, N2.– P. 553–562.

Dische Z. A new specific color reaction of hexuronic acid //

J. Biol. Chem.– 1947.– Vol. 167, N1.– P. 189–198.

Jordan J.M., Helmick C.G., Renner J.B. et al. Prevalence of

knee symptoms and radiographic and symptomatic knee

osteoarthritis in African Americans and Caucasians: The

Johnston County Osteoarthritis Project // J. Rheumatol.–

2007.– Vol. 34, N1.– P. 172–180.

Kongtawelert P., Francis D.L., Brooks P.M., Ghosh P.

Application of an enzyme-linked immunosorbent-inhibition

assay to quantitate the release of KS peptides into fluids of

the rat sub-cutaneous air pouch model and the effects of

chondroprotective drugs on the release process // Rheumatol.

Int.– 1989.– Vol. 9, N2.– P. 77–83.

Stegemann H., Stalder P. Determination of hydroxiproline //

Clin. Chim. Acta.– 1967.– Vol. 18, N2.– P. 267–273.

Accepted in16.08.2009

10.

11.

12.

369

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹3

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹3

УДК 616.5-001.19:577.115:615.36

А.В. ШИНДЕР, С.Є. ГАЛЬчЕНКО*, Л.В. ОСТАНКОВА, О.П. СИНчИКОВА

Динаміка загоєння холодових ран шкіри, рівень пероксидації

ліпідів та лейкоцитарний профіль крові щурів на фоні введення

екстрактів тваринного походження

UDC 616.5-001.19:577.115:615.36

A.V. SHINDER, S.YE. GALCHENKO*, L.V. OSTANKOVA, O.P. SYNCHYKOVA

Dynamics of Healing of Skin Cold Wounds, Lipid Peroxidation

Level and Leucocyte Profile of Rat’s Blood Against

the Background of Animal Extract Introduction

Досліджено вплив екстракту кріоконсервованих фрагментів селезінки свиней (ЕСС) і екстракту підмору бджіл (ЕПБ) на

динаміку загоєння холодових ран шкіри, рівень ПОЛ та показники крові щурів лінії Вістар і Сфінкс. Встановлено, що холодові

рани у щурів Сфінкс загоюються повільніше, ніж у щурів лінії Вістар. Уведення ЕСС або ЕПБ прискорює загоєння ран,

нормалізує показники крові та знижує рівень пероксидації ліпідів. Екстракт селезінки має більшу біологічну активність, ніж

екстракт бджіл.

Ключові слова: холодова рана, загоєння, екстракт селезінки, екстракт підмору бджіл.

Изучено влияние экстракта криоконсервированных фрагментов селезенки свиней (ЭСС) и экстракта подмора пчел (ЭПП)

на динамику заживления холодовых ран кожи, уровень ПОЛ и показатели крови крыс линии Вистар и Сфинкс. Установлено,

что холодовые раны у крыс Сфинкс заживают медленнее, чем у крыс линии Вистар. Введение ЭСС или ЭПП ускоряет

заживление ран, нормализует показатели крови и снижает уровень пероксидации липидов. Экстракт селезенки обладает

большей биологической активностью, чем экстракт пчел.

Ключевые слова: холодовая рана, заживление, экстракт селезенки, экстракт подмора пчел.

There was examined the effect of the extract of cryopreserved fragments of porcine spleen (PSE) and the one of dead bee bodies

(DBBE) on the dynamics of healing of skin cold wounds, LPO level and the blood indices of Wistar and Sphynx rats. It has been

established that healing of cold wounds in Sphynx rats proceeds slower if compared with those for Wistar ones. The introduction of

PSE and DBBE accelerates the healing of wounds, normalizes blood counts and reduces the level of lipid peroxidation. Porcine spleen

extract has higher biological activity versus the bee’s extract.

Key-words: skin cold wounds, healing, spleen extract, dead bee body extract.

Кількість захворювань злоякісними пухлинами

шкіри неухильно зростає. Вони, як правило, під-

даються комбінованому лікуванню (передопе-

раційний курс хіміо- або променевої терапії з подаль-

шим оперативним втручанням). Для видалення

пухлин часто використовують кріодеструкцію, ос-

кільки цей метод є найменш травматичним, не має

протипоказань для лікування злоякісних новоут-

ворень зовнішніх локалізацій, а в деяких випадках

є методом вибору [8].

Хіміо- і променева терапія пригнічує імуно-

логічну реактивність організму, уповільнює проце-

си репаративної регенерації після оперативних втру-

чань [8, 10]. При цьому активується перекисне окис-

лення ліпідів (ПОЛ), яке також уповільнює процес

загоєння ран [7]. Таким чином, нормалізація проце-

су регенерації шкіри, скорочення термінів лікування

після холодової травми, в тому числі на тлі імуно-

дефіцитного стану організму, є актуальною задачею.

Skin malignant neoplasm morbidity has steadily

increased. As a rule in this case the treatment is com-

bined (pre-operation sessions of chemo- or radiothe-

rapy with following surgery). To remove the tumors

the cryodestruction is often used, because this method

is less traumatic, has no contraindications for treating

malignant neoplasms of outer localizations and in some

cases is the selection method [8].

Chemo- and radiotherapies suppress immunologic

reactivity of an organism, slow the processes of repa-

rative regeneration after surgeries [8, 10]. Herewith

lipid peroxidation (LPO), slowing down the process of

wound healing, activates [7]. Thus, the normalization

of the process of skin regeneration, reduction of the

treatment terms after cold trauma, including those on

the background of immune deficient state of an

organism is an actual task.

It has been shown that the extract of cryopreserved

fragments of porcine spleen (PSE) normalizes an

* Автор, якому необхідно направляти кореспонденцію:

вул. Переяславська, 23, м. Харків, Україна 61015; тел.:+38

(057) 372-74-35, факс: +38 (057) 373-30-84, електронна пошта:

gordienko@gala.net

* To whom correspondence should be addressed: 23,

Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 372

7435, fax: +380 57 373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua

Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-

tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини

НАН України, м. Харків

370

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹3

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹3

Показано, що екстракт кріоконсервованих фраг-

ментів селезінки свиней (ЕСС) нормалізує імунний

статус організму, зокрема систему Т-лімфоцитів

[2], які приймають активну участь в регуляції

регенерації [4]. Відомо, що екстракт підмору бджіл

(ЕПБ) має виражену антиоксидантну активність

[5]. Ці факти дозволили припустити, що вказані

вище екстракти сприятимуть прискоренню і нор-

малізації загоєння холодових ран у тварин, у тому

числі з ослабленою імунною системою.

Мета роботи – дослідити вплив екстракту кріокон-

сервованих фрагментів селезінки свиней і екстрак-

ту, одержаного з підмору бджіл, на динаміку загоєн-

ня холодових ран шкіри, рівень ПОЛ та показники

крові щурів лінії Вістар і безшерстих щурів Сфінкс.

Матеріали і методи

Експерименти проведено відповідно до “Загаль-

них принципів експериментів на тваринах”, схвале-

них II Національним конгресом з біоетики (2004 р.,

Київ, Україна) і узгоджених з положеннями “Євро-

пейської Конвенції про захист хребетних тварин, які

використовуються для експериментальних і інших

наукових цілей” (Страсбург, 1985).

Екстракт селезінки свиней одержували за мето-

дом [9], а ЕПБ – екстракцією бджолиного підмору

в апараті Соклета. Екстракти вводили щурам у

черевну порожнину по 1 мл один раз на добу. Кон-

центрація пептидів в ЕСС становила 100 мкг/мл, а

в ЕПБ – 0,25 мг сухої речовини/мл.

Холодову травму шкіри моделювали на 18 щу-

рах лінії Вістар і 18 щурах Сфінкс масою 190–210 г.

Для визначення досліджуваних показників в нормі

було використано по 6 тварин. У дослідних щурів

лінії Вістар видаляли шерсть на стегні. Холодову

травму наносили охолодженим в рідкому азоті

мідним аплікатором діаметром 10 мм, експозиція

становила 60 с. Щури з холодовою травмою були

розділені на групи: контрольні (введення фізіологіч-

ного розчину) та дослідні (введення ЕСС або ЕПБ).

Площу ран визначали за методом [6], а інтен-

сивність ПОЛ – спектрофотометричним методом

за рівнем продуктів реакції з тіобарбітуровою кис-

лотою (ТБК-активні продукти, ТБКАП) у сироватці

крові [1]. При повній епітелізації ранового дефекту

вважали, що рана загоїлася. Для визначення стій-

кості до перекисного окислення в ячейку хемілю-

мінометра, яка містить 1 мл фізіологічного розчину

і 100 мкл сироватки крові, додавали 200 мкл 5%-го

розчину перекису водню і реєстрували світлосуму

в умовних одиницях [3]. Аналіз лейкоцитарної

формули проводили на мазках, забарвлених

азур II – еозином за Романовським-Гімза, підрахо-

вуючи по 500 клітин у світловому мікроскопі

(ЛОМО, об. ×90, ок. ×10) [6]. Кров для досліджень

брали з хвостової вени тварин.

immune status of an organism, in particular, of T-lym-

phocyte system [2], participating actively in regene-

ration regulation [4]. It is known that the extract of

dead bee bodies (DBBE) has manifested antioxidant

activity [5]. These facts enabled the suggestion that

the above mentioned extracts contributed to accele-

ration and normalization of healing of cold wounds in

animals, including those with weakened immune system.

The research aim is to investigate the effect of the

extract of cryopreserved fragments of porcine spleen

and the extract derived from the dead bee bodies, on

the dynamics of healing of skin cold wounds, LPO

level and the blood counts in Wistar and Sphynx rats.

Materials and methods

The experiments were performed according to the

“General principles of experiments in animals”,

approved by the 2

National Congress in Bioethics

(2004, Kyiv, Ukraine) and coordinated with the

guidelines of “European Convention for the protection

of vertebrate animals used for experimental and other

scientific purposes” (Strasbourg, 1985).

Porcine spleen extract was derived with the method

[9], and DBBE one with the extraction of dead bee

bodies in Soxhlet apparatus. The extracts were

introduced to the rats into peritoneal cavity by 1 ml

once a day. The concentration of peptides in PSE made

100 mg/ml and 0.025 mg of dry substance/ml in DBBE.

Skin cold trauma was simulated in 18 Wistar and

18 Sphynx rats of 190–210g. To examine the parame-

ters under study in the norm there were used 6 animals.

In the experimental rats the hair on a hip was removed.

Cold trauma was accomplished with liquid nitrogen-

cooled copper applicator of 10 mm diameter, the

exposure time was 60 seconds. The rats with cold

trauma were divided into the following groups: control

(introduction of physiological solution) and experimental

(introduction of either PSE or DBBE).

The square of wounds was found with the method

[6] and LPO intensity was spectrophotometrically de-

termined on the rate of thiobarbituric acid reactive

substances (TBARS) in blood serum [1]. At a complete

epitheliazation of wound defect there was assumed

that the wound healed. To reveal the steadiness to lipid

peroxidation into the chemiluminometer well with 1 ml

of physiological solution and 100 ml of blood serum

there were added 200 ml 5% hydrogen peroxide solu-

tion and the light sum was recorded in relative units

[3]. Leucocyte formula was analyzed on the smears

stained with azur II-eosin according to Romanovsky-

Giemsa, with counting 500 cells in light microscope

(LOMO, ob.×90, oc. ×10) [6]. Blood for the research

was derived from tail vein of animals.

The results were statistically processed with non-

parametric MANOVA method. The quantitative data

are presented in mean values and mean square errors.