Презентация - Щербо С.Н. Генодиагностика в современной лаборатории
Подождите немного. Документ загружается.
Мультипараметрические исследования
Разработка современных молекулярно-
генетических методов и изобретение медицинских
биочипов, в частности для изучения
полиморфизмов генов системы детоксикации,
открыло возможность проведения
мультипараметрических исследований. Сложилась
новая ситуация в молекулярной медицине,
когда не эксперименты подтверждают новые
гипотезы, а новые диагностические подходы
и наборы значимых биомаркеров рождаются
на основе собранных массивов данных.
Американские ученые из компании “Celera Diagnostics” и
других научных центров провели три независимых
исследования по обнаружению генетических маркеров,
ассоциирующихся с ранним развитием инфаркта миокарда. В
качестве маркеров-кандидатов учеными для исследований
было отобрано 11647 полиморфизмов 7136 генов.Эти
полиморфизмы представлены в генах VAMP8 (регулирует
дегрануляцию тромбоцитов) и HNRPUL1 (кодирует
рибонуклеарный белок).
АМПЛИФИКАЦИОННЫЕ
МЕТОДЫ
В КЛИНИЧЕСКОЙ
ЛАБОРАТОРНОЙ
ДИАГНОСТИКЕ
Наиболее эффективные направления
применения амплификационных методов в
диагностике инфекционных заболеваний:
Инфекционного агента мало.
Не культивируется.
Если морфологически и
иммунологически возбудитель
вариабелен.
Концентрация намного меньше, чем
других вирусов,микроорганизмов и
грибов.
Полимеразная цепная реакция
ПЦР сопряженная с обратной транскрипцией
Гнездовая ПЦР
ПЦР in situ
Количественная ПЦР
Мультипраймерная ПЦР
Ассиметричная ПЦР
ПЦР с «горячим стартом»
Амплификация больших фрагментов ДНК с высокой
точностью
Аллель-специфическая ПЦР
ПЦР, чувствительная к метилированию матрицы
Иммуно-ПЦР
УНИКАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПЦР
Высокая чувствительность
Аналитическая чувствительность представляет собой то
минимальное количество копий ДНК или РНК в одном
миллилитре раствора образца, которое может быть
определено данной тест-системой. Аналитическая
чувствительность тест-систем для выявления ДНК (РНК)
микроорганизмов методом ПЦР составляет 100 –1000
м.к. (геномэквивалент/мл).
Диагностическая чувствительность оценивается в
процентах и определяет количество пациентов с данным
заболеванием, дающих истинно положительные
результаты при использовании конкретного набора и
составляет от 95 до 100%.
Высокая специфичность
Диагностическая специфичность ПЦР тест-систем,
определяемая процентом здоровых людей, имеющих
истинно отрицательные результаты анализа, также
достаточно высокая. Для ПЦР-наборов "Рош" она
оценивается в 99-100%. Пример: вирус папилломы
человека (ВПЧ): удается выделить только онкогенные
типы 16, 18, 33 и др.
ОШИБКИ «ОЖИДАНИЯ»
Первый период развития
молекулярно-генетических
методов: «ПЦР-романтизм»-замена
всех других диагностических
подходов
Недостатки и ошибки в проведении
анализа, отсутствие контролей
Неверные выводы, исходя из
высокой чувствительности методов
Формы выпуска наборов для ПЦР
Традиционная жидкая форма
Зарегистрировано в МЗ РФ 25 наборов
на различные инфекционные
заболевания (НПФ «ГЕНТЕХ»)
Лиофилизованная сухая форма,
более 50 различных наборов (удобно в
транспортировке и работе, срок
хранения 1 год)
Мультипраймерные наборы в жидкой
форме (до 5 инфекций одновременно,
экономичные)
ПЦР сопряженная с обратной
транскрипцией (ОТ ПЦР)
Определение содержания РНК:
- оценка дифференциальной экспрессии генов на уровне
транскрипции
- диагностика РНК содержащих вирусов (гепатит С или
ВИЧ)
Этапы проведения ОТ ПЦР:
- на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы
синтезируют кДНК
- синтез с помощью обычной ПЦР
ПЦР in situ
ПЦР in situ разработан для амплификации
последовательностей ДНК или РНК
непосредственно на фиксированных
препаратах тканей клеток и хромосом.
Позволяет обнаружить одну копию ДНК на
фоне 1 мкг неспецифической ДНК
(гибридизационный анализ до 10 копий
анализируемых последовательностей на
клетку).
Этапы: приготовление и фиксация
препаратов клеток и тканей, получение
полупроницаемых клеточных мембран, ПЦР
с праймерами, меченными биотином и
обнаружение ПЦР-продуктов с
использованием комплекса стрептавидин с
ферментом и хромогенным субстратом.
Количественный ПЦР
Конкурентный метод.
ПЦР в реальном времени:
Система TaqMan
Система fluorescent resonance energy
transfer (FRET)
«Молекулярные маяки»
Флуоресцентные красители,
связывающиеся с ДНК
Праймеры типа «Скорпион»