Презентация - Щербо С.Н. Генодиагностика в современной лаборатории
Подождите немного. Документ загружается.
МЕТОДЫ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ДНК
СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК-ОПРЕДЕЛЕНИЕ
НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ СЛЕДУЮЩИМИ МЕТОДАМИ:
САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКОГО ХИМИЧЕСКОГО
РАСЩЕПЛЕНИЯ ЦЕПИ
С ПОМОЩЬЮ ТЕРМИНИРУЮЩИХ
ДИДЕЗОКСИНУКЛЕОТИДОВ (Ф. СИНГЕР)
С ПОМОЩЬЮ ВЕКТОРА НА ОСНОВЕ ФАГА М 13
ПРАЙМЕР-ОПОСРЕДОВАННАЯ ПРОГУЛКА (ДЛЯ
ОЧЕНЬ ДЛИННЫХ ФРАГМЕНТОВ ДНК)
Схема нерадиоизотопного
гибридизационного анализа нуклеиновых
кислот
Методы амплификации сигнала
Различные модификации метода гибридизации
нуклеиновых кислот, при которых используются
специфичные зонды, конъюгированные с субстратом
или ферментом: в результате происходит
многократное усиление образующегося сигнала,
регистрируемого тем или иным способом в ходе
определения:
- метод "разветвленной" ДНК (bDNA), основанный на
гибридизации исходной матрицы с разветвленной
пробой, cодержащей несколько реакционно-способных
групп, участвующих в процессе детекции
- использование принципа иммунологического
захвата гибрида ДНК/РНК с последующей
иммунохимической детекцией.
Метод гибридизации с использованием
разветвленных зондов (bDNA)
представляет собой пример амплификационных технологий,
позволяющих усиливать в ходе определения сигнал. В
результате многоступенчатого процесса гибридизации,
происходит присоединение многочисленных зондов,
коньюгированных с молекулами фермента, окисляющего
специальный субстрат и запускающий таким образом
хемилюминесценцию.
VERSANT bDNA TECHNOLOGY
Bayer HelthCare
HIV 3.0
HBV 3.0
HCV 3.0
Linearity
50 – 500 000
copies/ml
2000 –100.10
6
copies/ml
factor 5.6
3200 – 40.10
6
Copies/ml
615 – 7 10
6
IU/ml
Specificity
> 95 %
> 95 %
> 95 %
Sample
Plasma on
EDTA
Serum or
Plasma
Plasma or
Serum
Sample
Volume
1 ml
in single
50 µl
in single
50 µl
in Single
ДНК/РНК гибридный захват ( hibrid capture)
Принцип этого метода основан на иммунохимической детекции
продуктов гибридизации нуклеиновых кислот РНК/ДНК или ДНК/РНК
моноклональными антителами, узнающими образующиеся
дуплексы. Если происходит детекция бактерий или ДНК-содержащих
вирусов, то используется рибоолигонуклеотидный зонд. В случае
когда выявлению подвергаются инфекционные агенты, содержащие
рибонуклеиновые кислоты, такие, например, как вирус гепатита С
используют дезоксирибонуклеиновый зонд. В современных наборах
реагентов применяется хемилюминесценция, в качестве процесса,
обеспечивающего чувствительную детекцию результатов
гибридизации. Преимущество этого подхода заключается в том, что
практически сведены к минимуму подготовка клинического
материала и очистки нуклеиновых кислот, что позволяет
использовать иммунохимическую детекцию специфического
РНК/ДНК гибрида для скрининга.
ВПЧ Digene-тест
Технология осуществляется в пять этапов и
заключается в уникальном способе связывания
вирусной ДНК с РНК-зондом, захвате
полученного гибрида моноклональными
антителами и хемилюминесцентной детекции
образуемых комплексов (метод гибридного
захвата)
Прогностическая ценность теста: 99%
Чувствительность теста: свыше 95%
Специфичность теста эквивалентна
цитологическому исследованию
Исследование автоматизировано, время 2,5 ч.
Образцы клеток эпителия, биопсийного
материала
Проведение ВПЧ Digene-теста
Гибридизация ВПЧ