Оберемок В.В. Справочник по ДНК-модифицирующим энзимам и связанным с ними методам молекулярной генетики (на русском и английском языках)

Подождите немного. Документ загружается.

Министерство образования и науки Украины

Таврический национальный университет

имени В.И. Вернадского

кафедра экологии и рационального природопользования

В.В. Оберемок

Краткий справочник по ДНК-модифицирующим энзимам и

связанным с ними методам молекулярной генетики

(на русском и английском языках)

Brief Reference Book on DNA Modifying Enzymes and

Connected with them Methods of Molecular Genetics

(in Russian and in English)

для студентов 5 курса дневной формы обучения

специальности 8.070402

«биология»

образовательно-квалификационного уровня «магистр»

профессионального направления подготовки

0704 «биология»

для студентов 3 курса дневной формы обучения

направления подготовки 6.040101

«химия»

образовательно-квалификационного уровня «бакалавр»

профессионального направления подготовки

0401 «химия»

Симферополь 2010

Рекомендовано к печати заседанием кафедры экологии и

рационального природопользования от 02.11.2010

протокол № 4

Рекомендовано к печати учебно-методическим советом ТНУ

от 07.10.2010

протокол № 1

СОДЕРЖАНИЕ

Вступление……………………………………………………4

ДНК-полимеразы……………...…………………………………5

- Полимеразная цепная реакция………………………………..12

- Секвенирование……………………………………………...13

Эндонуклеазы………………………………………………..........15

- Рестриктазы…………………………………………………...17

- Рестрикционный анализ………………………………………..22

Экзонуклеазы……………………………………………………23

ДНК-лигазы………………………………………………………..26

- Лигазная цепная реакция……………………………………28

Технические данные…………………………………………......29

Список использованной литературы.……………………….58

CONTENTS

Introduction…………………………………………………………4

DNA Polymerases…………………………………………….....33

- Polymerase Chain Reaction………….………………………....39

- DNA Sequencing…………………………………………….40

Endonuсleases……………………………………………………..42

- Restriction Enzymes…………………………………………44

- Restriction Analysis…………………………………………....48

Exonuсleases……………………………………………………49

DNA Ligases………………………………………………………51

- Ligase Chain Reaction………………………………………53

Technical Data………………………………………………….....55

References……………………………………………………….58

Введение

Молекулярная генетика развивается настолько быстро,

что требует от молодого ученого высокого уровня понимания

явлений, происходящих в этой области, чтобы не заблудиться

между мириадами фактов.

Способность уловить основные идеи

теории и методов молекулярной генетики является ценным

качеством будущего специалиста, что позволяет ему чувствовать

свободу при проведении экспериментов. Мы собрали и

переработали информацию о ДНК-модифицирующих энзимах и

связанных с ними методах, находящуюся на веб-сайтах, в

научных статьях, книгах, справочниках и каталогах продукции

для опытов в области молекулярной биологии, чтобы

предложить на рассмотрение базовые знания по этой теме.

Пример справочника на английском языке будет полезным для

иностранных студентов и студентов, которые планируют

продолжить свое образование за рубежом. Мы искренне

надеемся, что студенты и молодые ученые с интересом будут

читать предоставленный материал.

Introduction

Molecular genetics has been developing so fast that it

requires high level of a young scientist’s understanding of events in

that field to not get lost between myriads of facts. Ability to catch the

core ideas of molecular genetics theory and methods is a valuable

feature of a future specialist that allows him to feel freedom while

conducting experiments. We collected and carried out the

information about DNA modifying enzymes and connected with

them methods been on web sites, in research papers, books,

molecular biology catalogs and product application guides to provide

the basic knowledge on this topic. The sample of reference book in

English will be helpful for foreign students and students that are

planning to continue their education abroad. We sincerely hope that

students and young scientists will read the provided material with

interest.

ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ

ДНК-полимераза I

ДНК-зависимая ДНК-полимераза, катализирует 5`→3`

синтез ДНК.

Фермент также обладает 3`→5` экзонуклеазной

(корректура) активостью, 5`→3` экзонуклеазной активностью и

свойствами рибонуклеазы Н.

Особенности:

1) включает в себя модифицированные нуклеотиды (например,

биотин-, дигоксигенин-, флуоресцентно меченые нуклеотиды);

2) проявляет активность в буферах для ПЦР и рестриктаз.

Область применения:

1) ДНК-маркирование ник-трансляции в сочетании с ДНКазой;

2) синтез второй нити кДНК в сочетании с РНКазой H.

10Х Реакционный буфер

500 мМ Трис-HCl (рН 7,5 при 25

С), 100 мМ MgCl

, 10 мМ ДТТ.

Ингибирование и инактивация

Ингибиторы: соединения, хелатирующие металлы; инактивация

нагреванием при 75

С в течение 10 мин или путем добавления ЭДТА.

Рис. 1. Схема активности ДНК-полимеразы I: I – синтез; II –

3`→5` экзонуклеазная активность; III – 5`→3` экзонуклеазная

активность; a – ДНК-полимераза I; b – дезоксирибонуклеозид-5`-

монофосфаты

Рис. 2. Структура ДНК-полимеразы I

*Интересные детали. Флуоресцеин – это синтетическое

органическое соединение в виде темно-оранжевого/красного порошка,

растворимого в воде и спирте. Он широко используется в качестве

флуоресцентных меток для многих приложений. Флуоресцентно

меченые нуклеотиды могут быть использованы в методике FISH

(флуоресценция на месте гибридизации), или могут быть использованы

в качестве мишени для антител при иммуногистохимических

исследованиях.

*Лабораторная полка

ЭДТА–

этилендиаминтетрауксусная

кислота. Она широко используется для

растворения карбоната кальция. Её польза

вытекает из возможности выступать в роли

шестидентатного лиганда и хелатирующего

агента, то есть её способности связывать

ионы металлов, таких как Mg

, Ca

2 +

и Fe

3+.

Будучи связанными ЭДТА, ионы металлов

остаются в растворе, но их реакционная

способность уменьшается.

Трис – трис-(оксиметил)-аминометан. Трис

широко используется в биохимии и

молекулярной биологии. Полезный

диапазон буфера с трис (7-9) совпадает с рН

большинства живых организмов. Этот

признак и его низкая стоимость сделали

трис одним из наиболее распространенных

буферов, используемых в биологических и

биохимических лабораториях.

ДТТ – дитиотрейтол.

ДТТ

используется в

качестве

восстановителя

для тиолированной ДНК. Терминальные

атомы серы тиолированного ДНК склонны

к образованию димеров в растворе,

особенно в присутствии кислорода.

Димеризация значительно снижает

эффективность последующих реакций

соединения, таких как ДНК-иммобилизация

на золоте в биосенсорах.

Фрагмент Кленова

Фрагмент Кленова – большой фрагмент ДНК-

полимеразы I. Он обладает 5`→3` активностью полимеразы и

3`→5` экзонуклеазной (корректура) активностью, но не обладает

5`→3` экзонуклеазной активностью ДНК-полимеразы I.

Особенности:

1) включает в цепь модифицированные нуклеотиды (например,

биотин-, дигоксигенин-, флуоресцентно меченые нуклеотиды);

2) активен в буферах для рестриктаз, ПЦР, T4 ДНК-лигаз.

Область применения:

1) формирование тупых концов дцДНК путём заполнения

5`-свесов;

2) ДНК-маркирование при помощи случайных праймеров;

3) маркирование ДНК путём заполнения 5`-свесов дцДНК;

4) секвенирование ДНК методом Сенгера;

5) сайт-специфический мутагенеза ДНК с использованием

синтетических нуклеотидов;

6) синтез второй цепи кДНК.

10Х Реакционный буфер

500 мМ Трис-HCl (рН 8,0 при 25

С), 50 мМ MgCl

, 10 мМ ДТТ.

Ингибирование и инактивация

Ингибиторы: хелатирующие агенты; инактивация нагреванием при 75

С в течение 10 мин или путем добавления ЭДТА. Для фрагмента

Кленова, как и для ДНК-полимеразы I, необходимы:

1) ДНК-матрица;

2) праймеры;

3) свободный 3`-ОН конец;

4) дезоксинуклеозидтрифосфаты.

* Интересные детали. Фрагмент Кленова, как и ДНК-

полимераза I, катализирует включение дНТФ со скоростью

приблизительно 20 нт/сек.

Т7 ДНК-полимераза

ДНК-зависимая ДНК-полимераза, катализирует синтез

ДНК в 5`→3` направлении. Высокопроцессивная ДНК-

полимераза, которая позволяет синтезировать длинные

фрагменты ДНК. Фермент также обладает высокой 3`→5`

экзонуклеазной активностью по отношению к одно- и

двухцепочечной ДНК.

Особенности:

1) сильная 3`→5` экзонуклеазная активность;

2) активна в буферах для рестрикционных энзимов.

Область применения:

1) очистка ковалентно связанных кольцевых ДНК от остаточной

геномной ДНК;

2) удлинение праймеров на длинных матрицах ДНК;

3) ДНК-маркирование 3`-конца;

4) удлинение цепи при изучении сайт-направленного мутагенеза;

5) заполнение 5`-свесов дцДНК;

6) синтез второй цепи кДНК;

7) in situ обнаружение фрагментированной ДНК, связанной с

апоптозом.

10X Реакционный буфер

400 мМ Трис-HCl (рН 7,5 при 25

С), 100 мМ MgCl

, 10 мМ ДTT.

Ингибирование и инактивация

Ингибиторы: хелатирующие агенты, модифицирующие реагенты

(уксусный ангидрид, N-этилмалеимид инактивируют 3`→5`

экзонуклеазную активность, но не полимеразную активность);

инактивация нагреванием при 75

С в течение 10 мин.

Pfu ДНК-полимераза

Термостабильный фермент с массой примерно 90 кДа,

изолированный из бактерии Pyrococcus furiosus. Фермент

катализирует полимеризацию нуклеотидов при формировании

второй цепи ДНК при 75

C в направлении 5'→ 3' в присутствии

ионов магния. Pfu ДНК-полимераза обладает 3'→5'

экзонуклеазной (корректура) активностью.

Особенности:

1) ошибки вставки азотистых оснований, которые могут

возникнуть в процессе полимеризации, быстро исправляются

полимеразой;

2) проявляет активность в буферах для рестриктаз;

3) фрагменты ДНК, генерируемые Pfu ДНК-полимеразой, имеют

тупые концы.

Область применения:

1) секвенирование;

2) удлинение праймеров.

10 X Реакционный буфер

200 мМ Трис-HCl (рН 8,8), 20 мМ MgSO

, 100 мМ KCl, 100 мМ

(NH

)

SO4,1% Тритона Х-100, 1 мг / мл нуклеазы без БСА.

Ингибирование и инактивация

Ингибиторы: ЭДТА, хелатирующие агенты.

*Лабораторная полка

Тритон Х-100 – полиэтиленгликоля моно

(тетраметилбутанол)фениловый эфир.

Представитель неионных ПАВ.

Используется при выделении ДНК в

составе лизирующего раствора. Это

соединение разрушает вторичные связи в

белках.

* Интересные детали. Pfu ДНК-полимераза меньше всего

делает ошибок при синтезе цепи, чем любая другая термостабильная

полимераза; скорость синтеза – 2000 н/мин.

Taq ДНК-полимераза

Катализирует включение дНТФ в ДНК. Она требует

наличие ДНК-матрицы, праймера, и катионов Mg

2+.

.Taq ДНК

полимераза обладает зависимой от полимеризации 5'→3'

экзонуклеазной активностью. Она не обладает 3`→5'

экзонуклеазной активностью и таким образом не имеет

корректирующей функции. Несмотря на это, фермент

синтезирует ДНК в пробирке с приемлемой точностью.

Особенности:

1) сильная 5`→3` экзонуклеазная активность;

2) 30% продуктов амплификации имеют аденозин-5`-

монофосфатные свесы;

3) активна в буферах для рестриктаз.

Область применения:

1) ПЦР. Taq-полимераза стабильна вплоть до 95 °C (фермент

выделен из теплолюбивой бактерии Thermus aquaticus),

поэтому нет необходимости добавлять фермент при

проведении 35 циклов ПЦР. Максимальная активность

фермента находится между 70-75 ° С, что сводит к минимуму

явление образования вторичной структуры ДНК и приводит к

высокому выходу реакции полимеризации. Режимы отжига

праймеров можно выбирать от 30 до 70 °C.;

2) Циклическое секвенирование. Этот фермент дает более

равномерные полосы, чем фрагмент Кленова. Высокий

температурный интервал и циклический режим позволяют

секвенировать трудные последовательности (шпильки) с

большим успехом. Он может секвенировать гомополимерные

последовательности лучше, чем фрагмент Кленова.

Реакционный буфер