Оберемок В.В. Справочник по ДНК-модифицирующим энзимам и связанным с ними методам молекулярной генетики (на русском и английском языках)

Подождите немного. Документ загружается.

Фермент может быть разбавлен в 10 мМ Трис (рН 7,6), 0,5 мг/мл БСА,

0,1 мМ ДТТ, 0,1 мМ ЭДТА. Используйте раствор с ферментом в тот же

день.

Ингибирование и инактивация

Ингибиторы: бромфеноловый синий, мочевина, ДМСО, формамид и

ДСН в некоторой степени тормозят Taq (ксиленцианол, (0,02%) не

ингибирует этот фермент). Taq ингибируется на 47% при 10%

концентрации ДМСО. Даже в этом случае полимераза может быть

использована для ПЦР и циклического секвенирования ГЦ-богатых

участков ДНК в присутствии 10% ДМСО, если количество Taq

увеличить в два раза.

Типичная реакционная смесь для ПЦР:

1) 5хПЦР-буфер – 5 мкл;

2) MgSO

, 50 мM – 1,5 мкл;

3) H

O (дистиллированная) – 3 мкл;

4) дНТФ-микс, 2 мM – 2,5 мкл;

5) Taq-буфер, 5 ед/мкл – 0,5 мкл;

6) минеральное масло – 10,5 мкл;

7) 2 праймера, 3,3 ОЕ/мл – по 1 мкл;

8) ТЕ-буфер с ДНК – 5 мкл.

*Лабораторная полка

Формамид – это прозрачная жидкость, которая

смешивается с водой и обладает аммиачным запахом. В

чистом виде, он растворяет многие

ионные соединения, которые не

растворяются в воде, поэтому формамид

используется также как растворитель.

Формамид используется в качестве

стабилизатора РНК в геле путём деионизации РНК. В

капиллярном электрофорезе он используется для

стабилизации одноцепочечных нитей денатурированной

ДНК.

ДМСО – диметилсульфоксид. Это бесцветная жидкость

является важным полярным апротонным растворителем,

который растворяет как полярные, так и

неполярные соединения и смешивается с

широким спектром органических

растворителей, а также с водой. Обладает

характерным свойством проникать в кожу очень легко,

так что можно почувствовать его вкус вскоре после его

контакта с кожей. Вкус ДМСО напоминает вкус устриц

или чеснока. ДМСО используется в ПЦР для подавления

образования вторичной структуры матричной ДНК или

ДНК праймеров. Она добавляется к ПЦР смеси до

проведения реакции, где она мешает одноцепочечным

цепям ДНК комплементарно взаимодействовать между

собой, сводя к минимуму этот нежелательнй фактор.

ДСН – додецилсульфат натрия. Он может

быть использован для лизиса клеток во

время экстракции ДНК и для

распутывания белков. SDS обычно

используется при подготовке белков к

электрофорезу. Это соединение работает,

разрушая нековалентные связи в белках,

денатурируя их и заставляя молекулы

потерять свою нативную конформацию.

Кроме того, анионы ДСН

присоединяются к основной цепи пептида

в соотношении один анион ДСН для

любых двух аминокислотных остатков. Это эффективно

придает отрицательный заряд белку, который

пропорционален массе белка (около 1,4 г ДСН/ 1 г

белка).

БСA – бычий сывороточный альбумин. БСА используется для

стабилизации некоторых ферментов во время рестрикции ДНК и для

предотвращения слипания фермента в реакционных пробирках. Этот

белок не влияет на другие ферменты, которые не нужны для

стабилизации. БСA также широко используется для определения

количества других белков при сравнивании неизвестного количества

белка с известным количеством БСА.

Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция является методом

быстрого "клонирования" определенной части ДНК в пробирке в

течение 30-40 циклов.

Полимеразная цепная реакция была изобретена

американским биохимиком Кэри Мюллисом в 1983 году.

Широкий уровень возможностей, дешевизна и простота ПЦР

позволили этому методу найти применение в различных

областях генетических исследований. В основе ПЦР лежит

естественный процесс клеточной репликации.

Каждый цикл состоит из трех этапов: денатурация, отжиг

праймеров, синтез ДНК. Для каждого шага существует специальный

температурный и временной интервал:

1) денатурация (94 °С, 0.5-1 мин);

2) отжиг праймеров (35-65 °С, 0.5-1 мин);

3) синтез (72

С, 0.5-1 мин).

Аккуратное выделение ДНК, амплификация ДНК, и детекция

продуктов амплификации (электрофорез) обеспечивают высокое

качество полимеразной цепной реакции. Количество ампликонов

фрагмента ДНК из одной клетки, образованных во время ПЦР, может

быть найдено по следующей формуле: F = 2

, n-число циклов.

Рис. 3.Схема ПЦР: I, II, III, – 1-й, 2-ой и 3-ий циклы; 0 –

фрагмент целевой ДНК; a – денатурация; b – отжиг праймеров; c –

синтез

ДНК-секвенирование

Метод определения порядка нуклеотидных оснований в

ДНК-мишени. Этот метод был изобретен британским ученым

Фридериком Сенгером в 1975. В качестве матрицы при ДНК-

секвенировании используется одноцепочечная ДНК. Для

инициации секвенирования ДНК ДНК-полимеразой

используются синтетические праймеры или природные

субфрагменты, полученные при помощи рестриктаз. 3'-конец

праймера должен заканчиваться перед участком ДНК, который

будет секвенироваться.

Рис. 4. Схема секвенирования ДНК

Для выяснения последовательности нуклеотидов в целевой

части ДНК, проводят 4 полимеразные реакции. В каждую из четырех

смесей реакции обязательно нужно добавить дезоксинуклеозид-

трифосфаты (дЦТФ, дГТФ, дТТФ, дАТФ) и ДНК-полимеразу. Кроме

этого, в каждую из пробирок добавляют один из

дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ддЦТФ, ддГТФ, ддТТФ и ддАТФ).

ддНТФ в 3'-положении, вместо гидроксильной группы (ОН) содержит

водород (Н). ddНТФ принимает участие в реакции полимеризации

ДНК и сразу прекращает её. В каждой реакционной смеси

соотношение между дЦТФ, дГТФ, дТТФ, дАТФ и одним из ддНТФ

составляет 100:1. Из-за низкой концентрации ддНТФ реакция не

заканчивается в начале секвенирования ДНК. В то же время

реакционная смесь будет содержать большое количество фрагментов

ДНК различной длины (из-за присоединения ддНТФ в различных

точках растущей нити ДНК).

С помощью электрофореза продукты полимеризации ДНК

разделяют и получают последовательность целевой ДНК.

ЭНДОНУКЛЕАЗЫ

ДНКаза I

Эта эндонуклеаза разрезает одно- и двухцепочечную

ДНК. Она гидролизует фосфодиэфирные связи, образовывая

моно- и олигодезоксирибонуклеотиды с 3'-ОН и 5`-фосфатными

концами.

Особенности:

1) активность фермента строго зависит от ионов Са

активируется ионами Mg

или Mn

;

2) в присутствии Mg

, ДНКаза I расщепляет каждую нить

дцДНК по отдельности случайным образом;

3) в присутствии ионов Mn

фермент расщепляет обе цепи ДНК

примерно в том же месте, образовывая фрагменты ДНК с

тупыми концами или со свесами длиной в один-два

нуклеотида;

4) ДНКаза чувствительна к физической денатурации, поэтому

перемешивайте фермент мягко, не встряхивайте.

Область применения:

1) подготовка раствора с РНК, не содержащего ДНК;

2) удаление матрицы ДНК в пробирке перед транскрипцией in

vitro;

3) подготовка раствора с РНК, не содержащего ДНК перед ОТ-

ПЦР;

4) ДНК-маркирование методом ник-трансляции при содействии

ДНК-полимеразы;

5) исследования ДНК-белковых взаимодействий с ДНКазой;

6) создание библиотек случайно перекрывающихся инсерций

ДНК. Используется реакционный буфер, содержащий Mn

10X Реакционный буфер с MgCl

100 мМ Трис-HCl (рН 7,5 при 25 ° С), 25 мМ MgCl

, 1 мМ CaCl

10X Реакционный буфер с MnCl

100 мМ Трис-HCl (рН 7,5 при 25 °С, 1 мМ CaCl

)

. Рекомендуемая

концентрация MnCl

в 1X реакционном буфере составляет 10 мM.

Ингибирование и инактивация

Ингибиторы: хелатирующие агенты, переходные металлы (например,

Zn) в милимолярных концентрациях, ДСН (даже в концентрациях

менее 0,1%), восстановители (ДТТ), ионная сила выше 50-100 мM;

инактивируется нагреванием при температуре 65 °С в течение 10

минут в присутствии ЭДТА (используется по крайней мере 1 моль

ЭДТА на 1 моль Mg

/Mn

Рис. 5. Активность ДНКазы I в присутствии Mg

или Mn

Эндонуклеаза IV, E. coli (Endо 4)

Эндонуклеаза IV узнаёт апуриновые/апиримидиновые

(AP) участки двухцепочечной ДНК и расщепляет

фосфодиэфирную связь, образуя гидроксильные группы на 3`-

конце. Эндонуклеаза может действовать как эстераза, отщепляя

3`-фосфогликолат и 3`-фосфат c повреждённых концов

двухцепочечной ДНК. Эндонуклеаза IV обладает также 3`→5`

экзонуклеазной активностью.

Особенности:

1) её активность на субстрате чувствительна к ионной силе,

ионам металлов, ЭДТА, а также к восстановителям;

2) субстраты с удаленными 3`- концами являются

преимущественно субстратами для 3`→5`экзонуклеазной

активности;

3) фермент не требует наличия Mg

, но более активен в его

присутствии.

Область применения:

1) изучение повреждений ДНК и её репарацию;

2) электрофорез одной клетки;

3) исследования противоопухолевых препаратов;

4) исследования структуры ДНК;

5) анализ одиночного нуклеотидного полиморфизма (ОНП).

10Х Реакционный буфер

100 мМ Трис-HCl (рН 8,5 при 25 °С), 25 мМ MgCl

Ингибирование и инактивация

Ингибиторы: фермент довольно устойчив к ЭДТА в ходе реакции, но

становится чувствительным даже к субмилимолярным количествам

хелатирующих агентов, когда нет матрицы ДНК; инактивируется

нагреванием при 80 °С в течение 15 мин.

Рис. 6. Активность эндонуклеазы IV

Рестриктазы

Рестриктазы распознают определенные нуклеотидные

последовательности и расщепляют молекулы ДНК внутри или за

пределами узнаваемого ими сайта. Расщепление приводит к

дегенерации ДНК с образованием "липких" (5`- или 3`-свесов)

или "тупых" концов.

Общие свойства

Явление специфичности действия рестриктаз была впервые

обнаружена Лурия и Хьюманом в начале 1950-х. Почти десять лет

спустя, Арбер и Дюссо предсказали молекулярные основы

специфичности действия рестриктаз. Они предположили, что

специфичность заключается в функционировании двухферментной

системы: рестриктазы, которая узнает специфические

последовательности ДНК и расщепляет чужеродную ДНК при ее

попадании в бактериальную клетку и модифицирующего фермента

(метилтрансферазы), который защищает ДНК хозяина от деградации

собственной рестриктазой. Оба фермента узнают один и тот же сайт и

вместе образуют систему рестрикции-модификации (Р-М).

Системы рестрикции-модификации широко распространены

среди бактерий, а также были изолированы из фага, архей и вирусов

эукариотических водорослей. Р-М системы были разделены на четыре

типа (I, II, III и IV) в зависимости от сложности их структуры,

требований кофактора, механизма действия и последовательности

расщепляемого сайта. Лучше всего охарактеризованы и чаще всего

используются рестриктазы II типа. Эти ферменты распознают

определенные последовательности ДНК длиной 4-8 п.о. и расщепляют

ДНК либо в сайте узнавания, либо на расстоянии до 20 пар оснований

от сайта узнавания.

Нередко бывает, что более чем один фермент узнаёт

определенную последовательность нуклеотидов. Исходя из

номенклатуры рестриктаз, фермент с уникальной специфичностью

расщепления ДНК, который был обнаружен первым, называется

прототипом. Впоследствии обнаруженные ферменты, обладающие той

же специфичностью, называются изошизомерами. Изошизомеры могут

отличаться от прототипа по уровню способности расщеплять целевой

сайт, условий реакции, а также чувствительности к метилированию и

спобности к звёздчатой активности. Рестриктазы, которые признают ту

же последовательность нуклеотидов, но расщепляют ДНК в разных

местах называются неошизомерами.

Выбор сайтов рестриктазами

В 1975 году Томас и Дэвис обнаружил, что EcoRI расщепляет

ДНК фага в пяти сайтах узнавания с разной степенью интенсивности,

которая может различаться на порядок. Подобные примеры были

зарегистрированы и для других ферментов рестрикции. Такие факторы,

как фланкирующие последовательности, метилированная ДНК и число

сайтов расщепления, по всей видимости, влияют на эффективность

расщепления. Расщепление устойчивых сайтов может быть

существенно улучшено с помощью добавления хорошо расщепляемой

ДНК и олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих сайт узнавания,

или спермидин.

Типы рестриктаз:

1) ферменты I-го типа расщепляют ДНК на участках,

удаленных от сайта узнавания; требуют как АТФ, так и S-аденозил-L-

метионин для функционирования; многофункциональный белок,

способный как к рестрикции, так и к метилированию;

2) ферменты II типа расщепляют ДНК в пределах или на

малых расстояниях от конкретного сайта узнавания, большинству

необходим магний; ферменты, обладающие одной функцией

(рестрикционной), не способны к метилированию;

3) ферменты III типа расщепляют ДНК в местах недалеко от

сайта узнавания; требуют наличия АТФ (но не её гидролиз), S-

аденозил-L-метионин стимулирует реакции, но не является

обязательным; существует как часть комплекса, включающего

метилазу;

4) ферменты IV типа расщепляют метилированную ДНК.

Звездчатая активность

Рестриктазы узнают определенные нуклеотидные

последовательности в молекулах ДНК. Однако их сайт-специфическое

узнавание может быть уменьшено in vitro. При определенных условиях

ферменты могут распознавать и расщеплять нуклеотидные

последовательности, которые отличаются от канонического сайта. При

низкой ионной силе, например BamHI (с сайтом узнавания GGATCC)

способна расщеплять следующие последовательности: NGATCC,

GPuATCC и GGNTCC. Это явление называется «звёздчатой

активностью». Для большинства случаев использования рестриктаз

звёздчатая активность не является желательной.

Звездчатая активность является результатом:

1) длительной инкубации (сверхрасщепление);

2) высокая концентрация фермента в реакционной смеси;

3) высокая концентрация глицерина в реакционной смеси;

4) наличие в реакционной смеси органических растворителей,

таких как этанол, диметилсульфоксид (ДМСО) или диметилформамид

(ДМФА);

5) низкая ионная сила реакции буфера;

6) субоптимальное значение рН реакционного буфера;

7) замена Mg

другими двухвалентными катионами, такими,

как Mn

или Co

В некоторых случаях, продукты ДНК, образованные в ходе

расщепления рестриктазой канонического сайта, стимулируют

звёздчатую активность фермента.

Недостаточное расщепление ДНК и звёздчатая активность

приводят к атипичным электрофореграммам, по которым при

кропотливом изучении эти два явления можно различить.

Различия между звездчатой активностью и неполным

расщеплением

Звёздчатая активность приводит к появлению дополнительных

полос ДНК под ожидаемыми полосами и отсутствию каких либо полос

над самым длинным ожидаемым фрагментом ДНК. Эти полосы

становятся более отчётливыми, в то время как ожидаемые полосы

становятся менее отчётливыми, если время инкубации или количество

фермента увеличить.

Неполное расщепление ДНК приводит к пояалению

дополнительных полос, расположенных выше ожидаемых фрагментов.

Дополнительные полосы исчезают, когда время инкубации или

количество фермента увеличивается. Никаких дополнительных полос

ниже наименьшего ожидаемого фрагмента не наблюдается.

Некоторые рестриктазы (например, Alol, Taul, EcoRII)

остаются связанными с матрицей ДНК после расщепления и вызывают

изменения в подвижности продуктов рестрикции во время

электрофореза. В этих случаях добавляют ДСН, раствор нагревают в

течение 10 мин при 65 °С и остужают на льду перед загрузкой в гель.

Расщепление метилированной ДНК

Метилирование ДНК – это процесс переноса

метилтрансферазой метильной группы от молекулы донора к молекуле

цитозина или аденина. Такого типа метилирование является наиболее

распространенным процессом модификации ДНК в живых организмах.

Преимущественно три типа метилированных оснований найдены в