Оберемок В.В. Справочник по ДНК-модифицирующим энзимам и связанным с ними методам молекулярной генетики (на русском и английском языках)

Подождите немного. Документ загружается.

ДНК: 1) 5`-метилцитозин (5mC); 2) N4-метилцитозин (m4C); 3) N6-

метиладенин (m6A).

У прокариот, расщепление ДНК родственными ферментами

предупреждено метилированием ДНК сайт-специфическими

метилтрансферазами, которые являются неотъемлемой частью каждой

системы рестрикции-модификации. Большинство штаммов кишечной

палочки используемые для размножения плазмидной ДНК содержат

две сайт-специфические ДНК-метилтрансферазы – Dam и Dcm.

Метилаза, кодируемая геном dam метилирует N6-положение аденина с

последовательностью GATC. Метилаза, кодируемая геном dcm,

метилирует С5-положения внутреннего остатка цитозина в

последовательности CCWGG.

ДНК высших эукариотических организмов обладает остатками

5-метилцитозина в CpG или CpNpG контекстах. Эти

тканеспецифические признаки наследуемы. Они участвуют в

регуляции экспрессии генов и клеточной дифференциации.

В случаях, когда целевой сайт рестрикции перекрывается с

метилированным сайтом, следующие результаты расщепления

возможны: 1) не влияет; 2) частичное торможение, 3) полная блокада.

Для достижения эффективного расщепления ДНК, необходимо

принимать во внимание и тип метилированной ДНК и

чувствительность рестриктазы к метилированной ДНК.

Однобуквенный код (для описания сайтов рестриктаз)

R = G или A; Y = C или T; W = A или Т; М = А или C; K = G или T; S =

C или G; H = A, C или T; V = A, C или G; B = C, G или T; D = A, G или

Т; N = G, A, T и C; (A, T, G, С - азотистые основания).

Примеры ферментов рестрикции

Alul

Dam, Dcm, CpG - нет

эффекта.

Инактивируется

нагреванием в

течение 20 мин при

температуре 65

С. Необходимо наличие как

минимум 4 п.о. с конца ДНК для полного её

расщепления. Оптимальная температура

инкубации – 37 °С.

*Интересные детали. Как правило рестриктазы активны в буферах для

ПЦР.

XceI (NspI)

Dam, Dcm, CpG - нет эффекта.

Инактивируется нагреванием в течение 20

мин при температуре 65

С. Оптимальная

температура инкубации – 37 °С.

Tail (MaeII)

Для обеспечения эффективности расщепления

реакцию проводят под керосином.

Оптимальная температура работы фермента –

С. Если метилирование происходит в CpG,

то сайт расщепления блокируется ("CpG" это

сокращение для "-Ц-фосфат-Г-", то есть, цитозин и гуанин,

разделенные фосфатом, который связывает два нуклеозида вместе в

ДНК). Не инактивируется нагреванием. 2 п.о. с конца ДНК

необходимы для полного её расщепления. Оптимальная температура

инкубации составляет 65

С.

*Интересные детали. Смит, Уилкокс и Келли, работая в

Университете Джона Хопкинса, в 1968 году выделили и

охарактеризовали первую рестриктазу, функционирование которой

зависела от конкретной нуклеотидной последовательности ДНК.

Работая с бактерией Haemophyllus influenzae, эта группа учёных

изолировала фермент, называемый HindII, который всегда расщепляет

молекулы ДНК в определенном сайте, состоящем из шести пар

оснований в пределах определенной последовательности шести пар

основаниий:

5 'GT (T или C) (A или G) AC 3 "

3 'CA (A или G) (T или C) TG 5'

Они обнаружили, что фермент HindII всегда расщепляет

последовательность ДНК непосредственно в центре этой

последовательности. Везде, где встречается эта последовательность из

шести пар оснований, HindII будет расщеплять обе цепи ДНК между 3

и 4 парами оснований последовательности.

Рестрикционный анализ

Этот метод основан на способности ферментов

рестрикции специфически расщеплять ДНК в определённых

сайтах.

Рис. 7. Схема рестрикционного анализа

Если происходит изменение в сайте узнавания (мутация,

рекомбинация, метилирование ДНК и т.д.) рестриктаза теряет

способность выполнять свою функцию. Основная идея заключается в

следующем: различные последовательности ДНК приводят к

расщеплению ДНК ферментами рестрикции в разных местах.

Полученные с помощью рестриктаз фрагменты ДНК служат маркерами

различных процессов, происходящих внутри клетки исследуемого

организма.

*Лабораторная полка

ПЭГ – полиэтиленгликоль. ПЭГ

используется в ряде зубных паст как

диспергатор. ПЭГ обычно используются в

качестве преципитанта для изолярования

ДНК плазмиды и кристаллизации белка. В

случае присоединения к различным

препаратам на основе белка

полиэтиленгликоль позволяет замедлить

очистку крови от такого белка. Он замещает

воду в деревянных объектах, что делает

древесину прочной и препятствует

деформации и сжатию древесины, когда она

высохнет. В области микробиологии, ПЭГ-

преципитация используетсяся для

концентрирования вирусов.

Вода – никакого чая

вечером без неё.

ЭКЗОНУКЛЕАЗЫ

Экзонуклеаза I (Exo I)

Экзонуклеаза I (ExoI) разрушает одноцепочечные ДНК в

3`→5` направлении, высвобождая дезоксирибонуклеозид-5`-

монофосфаты.

Особенности:

1) её активность на субстрате чувствительна к ионной силе,

ионам металлов, ЭДТА, а также к восстановителям;

2) не расщепляет двухцепочечные нити ДНК с 3`-ОН-концами,

заблокированными фосфорильными или ацетильными

группами;

3) активна в буферах для ПЦР;

4) не подходит для удаления 3 `-свесов из дцДНК.

Область применения:

1) удаление праймера из ПЦР-смеси;

2) удаление одноцепочечной ДНК, содержащей 3 `-

гидроксильные концы из смесей нуклеиновых кислот;

3) анализ на наличие одноцепочечной ДНК с 3`-гидроксильным

концом.

10Х Реакционный буфер

670 мM глицин-КОН (рН 9,5 при 25 °С), 67 мМ MgCl

, 10 мМ DTT.

Ингибирование и инактивация

Ингибиторы: 20% (вес/объём) ПЭГ 8000; инактивация нагреванием при

80 °С в течение 15 мин.

Рис. 8. Активность экзонуклеазы I

Экзонуклеаза III

Экзонуклеаза III (Exo III) катализирует четыре типа

реакций:

1) 3`→5` экзодезоксирибонуклеазная активность только

на двухцепочечной матрице ДНК: Exo III разрушает дцДНК с

тупых концов, 5 `-свесов или ников (брешей), высвобождая 5`-

мононуклеотиды от 3`-концов ДНК и производя протяженные

участки одноцепочечной ДНК. Она не активна на 3`-свесах

ДНК, которые по крайней мере имеют длину в четыре основания

и не несут 3`-терминальный C-остаток на одноцепочечной ДНК;

2) фосфатазная активность:

Exo III удаляет 3`-

терминальный фосфат и генерирует 3`-ОН-группу;

активность РНКазы Н:

Exo III экзонуклеолитически

разрушает цепь РНК в РНК/ДНК гибридах;

4) имеет апуриновую/апиримидиновую эндонуклеазную

активность: Exo III расщепляет фосфодиэфирные связи в

апуриновых или апиримидиновых сайтах, образовывая 5`-

концы, которые содержат дезоксирибоза-5`-фосфатные остатки,

не имеющие азотистые основания.

Особенности:

1) скорость расщепления ExoIII ДНК зависит от температуры,

концентрации солей и молярного соотношения ДНК и

фермента в реакционной смеси;

2) оптимальные условия реакции должны быть определены

экспериментально.

Область применения:

1) создание однонаправленных делеций в фрагментов ДНК в

сочетании с S1 нуклеазой;

2) создание одноцепочечной матрицы ДНК для

дидезоксисеквенирования;

3) сайт-направленный мутагенез;

4) клонирование продуктов ПЦР;

5) приготовление цепь-специфических зондов.

10Х Реакционный буфер

660 мМ Трис-HCl (рН 8,0 при 30 °С), 6,6 мМ MgCl

Ингибирование и инактивация

Ингибиторы: хелатирующие агенты, р-хлорортутный бензоат (50-90%

ингибирования при 0,1 мM); инактивируется нагреванием при 70 °С в

течение 10 мин.

Рис. 9. Активность экзонуклеазы II

ДНК-ЛИГАЗЫ

Т4 ДНК-лигаза

Катализирует образование фосфодиэфирных связей

между расположенными вблизи 5`-фосфатного и 3`-

гидроксильного концов в двухцепочечных молекулах ДНК или

РНК.

Фермент ремонтирует ники (бреши) однонитевых цепей

ДНК в двухцепочечных молекулах ДНК, РНК или ДНК/РНК

гибридах, соединяет фрагменты ДНК как с липкими, так и

тупыми концами. Т4 ДНК-лигазе необходим АТФ в качестве

кофактора.

Особенности:

1) быстродействующая – лигирование липких концов происходит

в течение 10 минут при комнатной температуре;

2) фермент активен в буферах для рестриктаз, ПЦР и ОТ-ПЦР

(при добавлении АТФ);

3) ПЭГ обеспечивает эффективное лигирование тупых концов.

Область применения:

1) клонирование продуктов рестрикции;

2) клонирование продуктов ПЦР;

3) присоединение двухцепочечных олигонуклеотидных линкеров

или адаптеров к ДНК;

4) сайт-направленный мутагенез;

5) полиморфизм длин амплифицированных фрагментов (ПДАФ);

6) лигаза-опосредованное обнаружение РНК;

7) сшивание брешей в двухцепочечных ДНК, РНК или ДНК/РНК

гибридах;

8) самостоятельное закольцовывание линейных ДНК.

10X T4 ДНК-лигазный буфер

400 мМ Трис-HCl (рН 7,8 при 25 °С), 100 мМ MgCl

, 100 мМ ДТТ, 5

мМ АТФ.

Ингибирование и инактивация

Ингибиторы: сильно ингибируется NaCl или KCl при концентрациях >

200 мM; инактивируется нагреванием при 65 °С в течение 10 мин или

при 70 °С в течение 5 мин.

* Интересные детали. Полиэтиленгликоль (ПЭГ) значительно

увеличивает скорость лигирования ДНК с тупыми концами,

молекулярная масса – 55,3 кДа.

Taq ДНК-лигаза

Катализирует образование фосфодиэфирных связей

между расположенными вблизи 5`-фосфатного и 3`-

гидроксильного концов в двухцепочечных молекулах ДНК или

РНК.

Лигирование будет происходить только тогда, когда

олигонуклеотиды идеально подобраны к ДНК-мишени и не

имеют никаких пробелов между ними, поэтому замена даже

одного азотистого основания может быть обнаружена. Taq-ДНК-

лигаза активна при повышенной температуре (45 °C – 65 °С).

Особенности:

1) Taq ДНК-лигаза не является заменой для Т4 ДНК-лигазы;

2) включает в ДНК фосфорилированные олигонуклеотиды во

время ПЦР и лигазной цепной реакции.

Область применения:

1) аллель-специфическое обнаружение гена с использованием

лигазной детектирующей реакции и лигазной цепной реакции;

2) мутагенез путем включения фосфорилированных

олигонуклеотидов во время амплификации процесса

удлинения праймера.

1X Taq ДНК-лигазный буфер

20 мМ Трис-HCl, 25 мМ ацетат калия, 10 мМ ацетат магния, 1 мМ

НАД, 10 мМ дитиотреитола; 0,1% Тритона Х-100 (рН 7,6 при 25 °С).

Ингибирование и инактивация

Устойчивость Taq ДНК- лигазы при 95 °С: 0 мин – 64000 ед/мл, 15

мин – 32000 ед/мл, 60 мин – 16000 ед/мл.

Рис. 10. Активность Taq ДНК-лигазы

Лигазная цепная реакция

Техника амплификации ДНК, основанная на

лигировании олигонуклеотидных зондов.

Рис. 11. Схема лигазной цепной реакции

Зонды предназначены для того, чтобы точно соединить

две прилегающие последовательности целевой ДНК. Цепная

реакция повторяется в три этапа в присутствии избытка зондов:

(1) тепловая денатурация двухцепочечной ДНК, (2) отжиг

зондов (праймеров) на ДНК-мишени, и (3) присоединение

зондов термостабильной ДНК-лигазой. После того как реакция

повторяется в течение 20-30 циклов, измеряется количество

лигированных зондов.

В аллель-специфической ЛЦР используют четыре

олигонуклеотида: два смежных олигонуклеотида, которые

уникально соединяются с одной цепью ДНК-мишени и

дополнительная пара смежных олигонуклеотидов, которые

гибридизируются с противоположной цепью. Лигированные

олигонуклеотиды с одного цикла служат матрицей во время

следующих циклов.

Технические данные

Рис. I. Азотистые основания ДНК

Таблица I. Диапазон эффективного разделения фрагментов ДНК в

агарозном геле

Агарозный гель, % Длина фрагментов ДНК, п.о.

0,5 2000-50000

0,6 1000-20000

1,0 400-8000