Лекции-Медицинская гельминтология

Подождите немного. Документ загружается.

Медицинская паразитология

21(20) Яйца без концевого или бокового шипов.

22(23) Форма яиц лимоноподобная. Оболочка темно-

коричневая, толстая; на обоих полюсах яйца светло-

окрашенные пробковидные образования.

Мелкозернистые (50—54Х23—26) ........ Власоглав

23(22) Форма яиц овальная, реже почти шаровидная.

24(27) Наружная оболочка бугристая.

25(26) Оболочка крупнобугристая, темно-желтая.

Шаровидная, мелкозернистая яйцеклетка находится в

середине яйца и никогда не заполняет все яйцо (50—

70 X40—50) . . Аскарида(оплодотворенное яйцо)

26(25) Оболочка мелкобугристая и более тонкая.

Яйцо чаще удлиненное (50— 100Х40— 50). Форма

его изменчива, часто неправильная. Все внутреннее

пространство под оболочкой заполнено большим

количеством желточных зерен.... Аскарида

(неоплодотворенное яйцо)

27(24) Оболочка гладкая, тонкая и бесцветная с

округленными полюсами.

28(29) Форма яйца правильно овальная. Оболочка

тонкая, прозрачная; яйца выделяются на стадии

четырех бластомеров, не заполняющих яйцо

полностью (56—76Х34—40). . . . Анкилостома и

Некатор

29(28) Форма яйца овально-эллипсоидная с более

узким верхним полюсом; выделяются они из

кишечника на ранних стадиях развития 16—32

бластомера (73—80X40—43) ......... Трихостронгил

30(19) Яйца содержат зрелый зародыш (онкосфера) с

шестью эмбриональными крючьями.

31(34) Оболочка онкосферы без радиальной

исчерченности.

32(33) Яйца овальные (40—50). Бесцветная

оболочка их тонкая и гладкая. Эмбриофора почти

шаровидная (29— 30) с длинными нитевидными

придатками на полюсах .......... Цепень карликовый

33(32) Оболочка онкосферы (эмбриофора) не имеет

нитевидных придатков на полюсах. Яйца крупные

(60—80Х Х72—86), почти сферической формы с

толстой желтоватой двуконтурной оболочкой.

Диаметр эмбриофоры: 38Х28 . . . . . . . Цепень

крысиный

34(31) Яйца(эмбриофоры) почти шаровидные, желто-

коричневые, оболочка их толстая с радиальной

исчерченностью (31—40Х20—30 ) ...............

Цепень вооруженный и невооруженный

ПРИМЕЧАНИЕ:

1) Изредка встречаются яйца. аскарид без наружной

белковой (бугристой) оболочки.

2) В летнее время свежевыделенные яйца

анкилостомид (анкилостома, некатор) и

трихостроягилид через сутки уже могут содержать

личинки.

3) В экскрементах встречаются не яйца этих

паразитов, а эмбриофоры со зрелыми зародышами

(онкосферы); наружная яйцевая оболочка,

окружающая эмбриофору, легко разрушается и

практически отсутствует.

Измерение яиц паразитических червей

В затруднительных случаях при определении яиц

глистов прибегают к их измерению Практически это

бывает необходимо при нахождении яиц

паразитических червей, сравнительно редко

встречающихся в наших широтах, например

анкиластомид, трематод и др. Для

микроскопического измерения необходимо иметь: а)

микрометрический окуляр и б) объективную микро-

метрическую линейку. Микрометрический окуляр

отличается от обычного наличием в нем

измерительной линейки длиной 1 см с делениями в

0,1 мм; следует указать, что при наложений

окулярного микрометра видимая величина каждого

деления окулярной линейки будет различна в

зависимости от увеличения микроскопа, т. е. длины

его тубуса и оптической системы. Для определения

линейного значения делений окулярной линейки для

данного микроскопа применяется объективная

микрометрическая линейка; последняя помещена на

специальном предметном стекле и имеет обычно

длину в 10 мм, причем каждый миллиметр разделен

на 100 равных частей, следовательно, каждое

деление равно 0,01 мм. Вставив микрометрический

окуляр в микроскоп и поместив объективную

линейку на предметный столик, производят

установку микроскопа, т. е. помещают объектив на

определенном расстоянии от предметной линейки,

дающем наиболее ясную видимость. Видимые в поле

зрения линейки (окулярная и объективная)

накладывают в вертикальном положении одна на

другую и устанавливают число делений

микрометрического окуляра, точно совпадающее с

определенным числом делений объективной

линейки, после чего вычисляют в микронах величину

одного деления окулярной линейки.

Пример. 26 делений окулярного микрометра

соответствуют 10 делениям объективной линейки.

Так как каждое деление последней равно 0,01 мм, то

26 делений окулярного микрометра равны 0,1 мм и

отсюда, следовательно, величина одного деления

окулярной линейки будет равна 0,00385 мм (0,1:26),

двух делений — 0,00770 мм и т. д. Для точности

измерения рекомендуется пользоваться сильными

оптическими системами и вычислять деления до пяти

десятичных знаков. В дальнейшем для производства

регулярных измерений объективная линейка уже не

требуется и для постоянной работы с данным

микроскопом пользуются заранее составленной

таблицей. При измерении какого-либо объекта

сменяют обыкновенный окуляр на

микрометрический и, определив в делениях

последнего длину и диаметр объекта, находят в

таблице искомую величину в микронах.

Исследование мяса на личинок трихинелл методом

переваривания

Кроме распознавания мышечного трихинеллеза

способом раздавливания мяса между двумя

предметными стеклами или стеклянными

пластинками (в компрессории) в практической

работе, особенно для экспериментальных целей,

применяют переваривание исследуемого мяса

желудочным соком. Ю. А. Березанцев предложил

для этого прибор, состоящий из шести конусовидных

воронок, каждая из которых с верхним диаметром

4,5 см и высотой 12—13см при диаметре нижнего

отверстия 0,8 см. В воронку вставляют железную

Медицинская паразитология

сетку с отверстием 0,5—1 мм, а на нижний конец

воронки надевают мягкую резиновую трубку,

снабженную зажимом Мора. Воронки фиксируют в

приборе вместе с центрифужными пробирками.

Мелконарезанное и предварительно взвешенное мясо

(1—3 г) помещают на сетку воронки в натуральный

или искусственный желудочный сок (1% пепсина и

0,5%: соляной кислоты); каждая воронка вмещает 60

мл желудочного сока. Прибор ставят в термостат при

температуре 37°. Через 16—24 часа жидкость из

воронки выпускают в пробирки и центрифугируют.

Осадок исследуют под микроскопом. Личинки

трихинелл в воде при комнатной температуре

сохраняются живыми до 15 дней, а в фи-

зиологическом растворе единичные личинки живут

свыше месяца.

Исследование почвы на яйца паразитических червей

Пробы почвы для исследования берутся на дворе, в

подвалах, сенях, сараях, саду; исследуют пол

жилища, сор после подметания школ, и т. д.

Рекомендуется с участка в 50 м2 брать по диагонали

не менее десяти проб почвы. Затем смешивают

взятые пробы вместе и исследуют из общей массы

200 г земли. Для обработки почвы можно применять

следующие методы.

Способ Спиндлера. 10 г земли помещают в

центрифужную пробирку емкостью в 50 мл3,

прибавляют около 10 мл3 30% антиформина,

тщательно размешивают и оставляют на час в покое;

затем избыток антиформина сливают и землю

смешивают с насыщенным раствором

двухромокислого натра (удельный вес 1,35),

наполняя пробирку почти доверху; после

основательного размешивания центрифугируют в

течение 1—2 минут (при 1000 оборотах в 1 минуту).

Вместо насыщенного раствора двухромокислого

калия другие авторы рекомендуют применять

насыщенный раствор поваренной соли, или 2,13%

раствор едкого натра, или насыщенный раствор

азотнокислого натра (удельный вес1,39). Всплывшие

на поверхность после центрифугирования яйца

снимают петлей, считают и классифицируют по

стадиям развития: а) яйца не развившиеся, б)

развившиеся, находящиеся в различных стадиях

дробления, в) зрелые с подвижной личинкой и г)

мертвые.

Способ Васильковой-Гефтер дает значительно

лучшие результаты. В центрифужную

металлическую пробирку (50 см3) помещают 10,0 г

исследуемой почвы, опускают 10 стеклянных

бусинок, наполняют пробирку 5% раствором едкого

натрия и в течение часа 4—5 раз энергично

встряхивают пробирку для лучшего размешивания

почвы. После центрифугирования в течение 1—2

минут избыток едкого натра сливают. Затем

пробирку наполняют насыщенным раствором

азотнокислого натрия (удельный вес 1,39) и после

повторного размешивания почвы центрифугируют в

течение 2 минут. Поверхностную пленку переносят

петлей в стаканчик с небольшим количеством воды,

землю в пробирке размешивают с тем же раствором

азотнокислого натра и снова снимают

поверхностную пленку, повторяя эту процедуру до

пяти раз в течение 4—5 часов. Воду со снятой

поверхностной пленкой фильтруют через один

планктонный предварительный фильтр в воронке

Гольдмана; при отсутствии последней воде дают

отстояться или ее центрифугируют, а затем осадок

микроскопируют. Влажный фильтр исследуют под

микроскопом; если же его предварительно

подсушивают, то затем просветляют кедровым,

вазелиновым или касторовым маслом. Яйца

подсчитывают и определяют стадии их развития.

Авторы этого способа указывают, что через один

фильтр можно профильтровывать пленку после

обработки 100—200 г почвы, что соответствует 10—

20 центрифужным пробиркам. Просмотр одного

фильтра занимает не более 3—4 минут. При такой

методике исследования почвы обнаруживается от 34

до 60% яиц паразитических червей (в среднем

44,6%).

Т. К. Масольниковой предложена следующая

шкала сравнительной оценки степени загрязнения

почвы яйцами паразитических червей: почва

считается незагрязненной при количестве яиц

гельминтов от 0 до 50 в 1 кг почвы; слабо

загрязненной—от 51 до 150; сильно загрязненной—

от 151 до 300; очень сильно загрязненной—от 301 и

более.

Гельминтологическое исследование овощей

Описанный принцип исследования почвы на

зараженность ее яйцами глистов положен 3. П.

Васильковой и В. А. Гефтер (1941) в основу

гельминтологического исследования овощей. Овощи

замачиваются на сутки в стеклянных банках, причем

рекомендуется их тщательно взбалтывать в течение 5

минут не менее четырех раз в час. Затем воду через

металлическую сетку сливают, в другую банку и в

новой порции воды производят соскоб с овощей

кисточкой из металлических струн. Обе порции воды

сливаются вместе и отстаиваются сутки. Обработку

осадка производят так же, как при анализе почвы.

Применяется также и другой способ исследования

овощей; последние замачивают лишь на 2 часа в 2%

растворе щелочи, осадок же после отстаивания сразу

обрабатывают насыщенным раствором азотнокис-

лого натра.

Гельминтологическое исследование воды

В зависимости от характера источника

водопользования (мелкие или крупные водоемы со

стоячей или проточной водой, ручьи, оросительные

канавы, пруды, озера, реки) применяются более или

менее сложные способы гельминтологического

исследования воды.

Исследование воды из оросительных канав—

арыков. В арыке устанавливают большую воронку,

имеющую форму конусовидного ведра, без дна;

вместо последнего ведро снизу затягивают двумя

слоями марли, между которыми находится -слой

ваты. Такую воронку с фильтром устанавливают так,

чтобы текущая вода фильтровалась через марлю и

вату. Через сутки осадок с фильтра распределяют по

стаканчикам и исследуют по способу Фюллеборна.

Небольшие по объему пробы воды можно

фильтровать через простую или обеззоленную

Медицинская паразитология

фильтровальную бумагу; затем фильтры разрезают

на кусочки по размеру покровного стекла и после

просветления в кедровом или гвоздичном масле

микроскопируют. При возможности испытуемую

пробу воды центрифугируют: незначительный осадок

распределяют на несколько предметных стекол и

микроскопируют, большой осадок исследует по

способу Фюллеборна. По 3. Г. Васильковой,

фильтрацию воды производят в воронке Гольдмана с

водоструйным насосом или с ручным насосом

Шинца через мембранный крупнопористый

(«предварительный») фильтр, который затем

исследуют под микроскопом во влажном состоянии,

или после подсушивания на воздухе с последующим

просветлением. По этому способу требуется час для

фильтрации 10 л речной воды при смене 10—20

фильтров. Этот же метод применяется для

гельминтологического исследования сточных вод;

при этом в час, в зависимости от объема осадка,

фильтруется от 2 до 3 л сточной воды. При

гельминтологическом исследовании текучих и

стоячих естественных водоемов (реки, озера, пруды,

болота) воду можно фильтровать через ткань с

ячейками диаметром не более 0,02—0,03 мм (3. Г.

Василькова). Для взятия проб воды употребляют

гидробиологическую планктонную сетку, в дно

которой вставлена широкая стеклянная или

металлическая трубка. На отогнутые наружные края

трубки прикрепляют резиновым или металлическим

кольцом двойной фильтр. Пробы воды берут с

глубины 5—20 см. В зависимости от густоты осадка

влажный фильтр после расправления на стекле сразу

же исследуют под микроскопом, а обильный осадок

—по способу Фюллеборна с 48% раствором

азотнокислого натра.

Исследование предметов бытовой обстановка

Для выяснения степени загрязнения яйцами

глистов различных предметов бытовой обстановки

(мебель, школьные парты, полы, ручки дверей,

игрушки и т. п.) поступают следующим образом.

Акварельной кисточкой, смоченной в 10% растворе

глицерина, проводят несколько раз по исследуемому

предмету, после чего кисточку помещают в

пробирку, в которую наливают дистиллированную

воду; тщательно вымытую в этой же воде кисточку

просматривают под микроскопом; содержимое же

пробирки центрифугируют. Для

гельминтологического исследования пыли с

предметов обихода с успехом можно применить

электропылесос. В пылесосе обычный шланг со

щетками заменяют шоттовской воронкой № 1 с

пористой пластинкой, на которую помещают

предварительный мембранный фильтр; последний

после извлечения микроскопируют во влажном

состоянии. Смыв со стенок воронки фильтруют в

приборе Гольдмана. При наличии большого

количества пыли на фильтре, его обрабатывают по

способу Васильковой-Гефтер. предложенному для

исследования почвы.

Систематика гельминтов, паразитирующих у

человека и млекопитающих

Систематику гельминтов еще нельзя считать

устоявшейся, постоянно происходят более или менее

значительные ее изменения. Кроме того, до сих пор

нет руководства, в котором была бы изложена

полностью система всех классов гельминтов.

Поэтому для облегчения работы начинающих

исследователей мы приводим систему (до семейства)

гельминтов, паразитирующих у человека и млеко-

питающих. В целом она соответствует системе,

изложенной Шульцем и Гвоздевым (1970). В

систематике приводятся первооткрыватели той или

иной систематической единицы номенклатуры

гельминтов

Надтип Scolecida (Huxley, 1856) Bekleniischev, 1944

Тип Plathelmintlies Schneider, 1873

Класс Trematoda Rudolphi, 1808

Подкласс Prosostomidea Skrjabin et Guschanskaja,

1962

Отряд Fasciolida Skrjabin et Guschanskaja, 1962

Подотряд Fasciolata Skrjabin et Schuiz, 1935

Семейства:

Fasciolidae Railliet, 1895

Brachylaemidae Stiles et Hassal, 1898

Dicrocoeliidae Looss, '1899

Hasstilessidae Hall, 1916

Lecithodendriidae Odhner, 1911

Nanophyetidae Dollius, 1938

Paragonimidae Dollius, 1938

Plagiorchidae Luehe, 1901

Psilostomidae Odhner, 1960

Troglotrematidae Odhner, 1914

Подотряд Echinostomatata Szidat, 1936

Семейство Echinostomatidae Dietz, 1909

Подотряд Heterophyata Morosov, 1955

Семейства: Heterophyidae Odhner, 1914

Opisthorchidae Braun, 1901

Подотряд Paramphistomatata (Szidat, 1936) Skrjabin et

Schuiz, 1937

Семейства:

Paramphistomidae Fischoeder, 1901

Cladorchidae Southwell et Kirschner, 1937

Gastrodiscidae Stiles et Goldberg, 1910

Gastrothylacidae Stiles et Goldberg, 1910

Подотряд Pronocephalata Skrjabin, 1955

Семейство Notocotylidae Luehe, 1909

Подотряд Schistosomatata Skrjabin et Schuiz, 1937

Семейство Schistosomatidae Looss, 1899

Отряд Strigeida (La Rue, 1926) Sudarikov, 1959

Подотряд Strigeata La Rue, 1926

Семейство Alariidae Tubangui, 1922

Класс Cestoidea Rudolphi, 1819

Подкласс Eucestoda Southwell, 1930

Отряд Pseudophyllidea Carus, 1863

Семейство Diphyllobobothriidae Luehe, 1910

Отряд Cyclophyllidea Beneden in Braun, 1900

Подотряд Anoplocephalata Skrjabin, 1933

Семейства:

Anoplocephalidae Cholodkowsky, 1902

Avitellinidae Spassky, 1950

Catenotaeniidae Spassky, 1950

Linstowiidae (Mola, 1929) Spassky, 1949

Подотряд Hymenolepidata Skrjabin, 1940

Медицинская паразитология

Семейства:

Hymenolepididae (Ariola, 1899)

Dilepididae Fuhrmann, 1907

Dipylliidae Mathevosian, 1953

Подотряд Mesocestoidata Skrjabin, 1940

Семейство Mesocestoididae Perrier, 1897

Подотряд Taeniata Skrjabin et Scuhiz, 1937

Семейство Taeniidae Ludwig, 1886

Тип Acanthocephales (Rudolphi, 1808) Skrjabin et

Schuiz, 1931

Класс Acanthocephala (Rudolphi, 1808)

Подкласс Echinorhynchinea Petrotschenko, 1956

Отряд Polymorphida Petroschenko, 1956

Семейство Polymorphidae Meyer, 1931

Подкласс Giganthorhynchinea Petrotschenko, 1956

Отряд Giganthorhynchida Southwell et Macfie, 1925

Семейство Giganthorhynchidae Hamann, 1892

Отряд Oligacanthorhynchida Petrotschenko, 1956

Семейства:

Oligacanthorhynchidae Southwell et Macfie, 1924

Moniliformidae Van Cleave, 1924

Тип Nemathelminthes Schneider, 1866

Класс Nematoda Rudolphi, 1808

Подкласс Adenophorea (Linstow, 1905)

Dougherty,1958

Отряд Dioctophymidea Yamaguti, 1961

Подотряд Dioctophymata Skrjabin, 1927

Семейства:

Dioctophymidae Railliet, 1915

Soboliphymidae Petrow, 1930

Отряд Trichiuroidea Yamaguti, 1961

Подотряд Trichocephalata Skrjabin et Schuiz, 1928

Надсемейство Trichocephaloidea Skrjabin et Schuiz,

1928

Семейства:

Capillariidae Neveu-Lemaire, 1936

Trichinellidae Ward, 1907

Trichocephalidae Baird, 1853

Trichosomoididae Yorke et Maplestone, 1926

Подкласс Secernentea (Linstow, 1905) Dougherty,1958

Отряд Spirurida Chitwood, 1938

Подотряд Spirurata Railliet, 1914

Надсемейство Spiruroidea Railliet et Henry, 1915

Семейства:

Spiruridae Oeriey, 1885

Habronematidae Ivaschkin, 1961

Histyocephalidae Skrjabin, 1961

Надсемейство Physalopteridea Sobolev, 1949 in

Skrjabin, Sobolew, Schikhobalova, 1949

Семейство Physalopteridae Leiper 1908

Надсемейство Thelaziidea Sobolev, 1949 in Skrjabin,

Sobolew, Schikhobalova, 1949

Cемейства:

Theiaziidae Skrjabin, 1915

Gongylonematidae Sobolev, 1949 in Skrjabin, Sobolew,

Schikhobalova, 1949

Pneumospiruridae Wu et Hu, 1938

Rictuiariidae Railliet, 1916

Подотряд Ascaridata Skrjabin, 1915

Надсемейство Ascaridoidea Railliet et Henry, 1915

Семейство Ascarididae Baird, 1853

Надсемейство Anisakoidea Mosgovoy,1950

Семейство Anisakidae Skrjabin et Karokhin, 1945

Подотряд Camallanata Chitwood, 1936

Надсемейство Dracuncuioidea Gameron, 1934

Семейство Dracunculidae Leiper, 1912

Надсемейство Gnathostomatidea Skrjabin et Ivaschkin,

1968

Семейство Gnathostomatidae Railliet, 1895, emend.

Nicoll, 1927

Подотряд Filariata Skrjabin, 1915

Надсемейство Filaroidea (Weinland, 1858)

Семейства: Filariidae Gobbold, 1879

Dipetalonematidae Wehr, 1935

Setariidae (Yorke et Maplestone, 1926) Skrjabin et

Schikhobalova, 1945

Stephanofilariidae Wehr, 1935

Надсемейство Aproctoidea (Yorke et Moplestone,

1926) Sonin, 1962—1963

Семейство Splendidofilariidae (Ghabaud et Choquet,

1953) Sonin, 1962—1963

Отряд Rhabditida (Oerley, 1880) Chitwood, 1933

Подотряд Rhabditata Chitwood, 1933

Надсемейство Rhabditoidea Travassos, 1920

Семейство Strongyloididae Chitwood et Mclntosh,

1934

Подотряд Oxyurata Skrjabin, 1923

Надсемейство Oxyuroidea Railliet, 1916

Семейства:

Oxyuridae Cobbold, 1864

Heteroxynematidae Skrjabin et Schikhobalova, 1951

Syphaciidae Skrjabin et Schikhobalova, 1951

Надсемейство Cosmocercoidea Skrjabin et

Schikhobalova, 1951

Семейство Cosmocercidae Travassos 1925

Надсемейство Heterakidoidea Chabaudr 1957

Семейство Heterakidae Railliet et Henry, 1914

Надсемейство Subuluroidea Travassos,.1930

Семейство Subuluridae Yorke et Maplestone, 1926

Подотряд Strongylata Railliet et Henry, 1813

Надсемейство Strongyloidea Weinland, 1853

Семейства:

Strongylidae Raird, 1853

Ancylostomatidae Baylis et Dubney, 1926

Syngamidae Leiper, 1912

Trichonematidae Witenberg, 1925

Надсемейство Metastorongyloidea Lane, 1917

Семейство Metastrongylidae Leiper, 1908

Надсемейство Pseudolidoidea Skrjabin et Ivaschkin,

1968

Семейства: Crenosomatidae Schulz, 1951

Filaroididae Schuiz, 1951

Protostrongylidae Leiper, 1926

Надсемейство Trichostrongyloidea Cram, 1927

Семейства: Trichostrongylidae Leiper 1912

Dictyocaulidae Skrjabin, 1941

Heligmosomatidae Cram, 1927

Ollulanidae Skrjabin et Schikhobalova,. 1952

Иммунитет при паразитарных заболеваниях

Увеличение числа людей, пораженных

паразитарными болезнями, нарастающие изменения

окружающей среды в развивающемся мире и

неудачи при использовании классических программ

Медицинская паразитология

по борьбе с инвазиями стимулировали поиск новых

подходов к ликвидации этих болезней.

Определенную роль в этом должна сыграть

иммунология. В настоящее время специалисты

изучают несколько аспектов взаимодействия

паразита и хозяина. Предпринимаются попытки

определить механизмы, позволяющие паразитам

избегать иммунного конфликта с хозяином, изучить

механизмы иммунного ответа, обусловливающие

патологические изменения. Иммунологические

методы лежат в основе разработки диагностических

тестов и, в конечном счете, дают надежду на

получение эффективных вакцин против некоторых из

этих болезней. В настоящее время не существует

вакцины для защиты людей от инвазии, несмотря на

наличие ряда эффективных вакцин против

паразитарных болезней животных. Наиболее

целесообразным представляется рассмотрение

проблемы получения противопаразитарных вакцин

на примере малярии.

Вакцина против малярии. Несмотря на то что

предпринимаются попытки создать вакцины против

многих паразитарных болезней, особенно

интенсивная работа осуществляется в отношении

вакцины против малярии, вызываемой Plasmodium

falciparum, наиболее злокачественным возбудителем.

Для правильного понимания проблемы и подходов к

ней необходимо кратко рассмотреть жизненный цикл

возбудителя малярии. При укусе комара в кровь

человека попадают подвижные спорозоиты,

находящиеся в слюнных железах насекомого. Менее

чем за 30 мин они покидают кровь и проникают в

печень. Далее спорозоиты проходят

экзоэритроцитарный цикл развития, претерпевая

бесполое деление по типу шизогонии и продуцируя

множество мерозоитов. Последние при разрыве

гепатоцитов выходят в кровь и проникают в

эритроциты, где дифференцируются в трофозоиты,

делятся по типу шизогонии с образованием большого

числа мерозоитов, которые вновь проникают в

эритроциты, и цикл продолжается. Некоторые

мерозоиты развиваются в половые стадии, гамонты.

Если комар укусит зараженного человека, гамонты

попадут в организм насекомого. Мужские

микрогаметы оплодотворяют женские макрогаметы,

формируется оокинета, а затем ооциста.

Последующее деление в пределах ооцисты приводит

к образованию инфективной стадии, спорозоита.

Некоторые из этих стадий могут быть мишенью для

иммунного воздействия с помощью вакцины.

Спорозоитные вакцины. Иммунитет к Р. falciparum

можно сообщить человеку через возбудителя,

находящегося на стадии спорозоитов. Это было

показано в опытах с облученными зараженными

комарами (содержащими облученных спорозоитов,

потерявших способность к делению), которым

давали возможность напитаться кровью людей. В

результате исследований появилась возможность

охарактеризовать один спорозоитный антиген.

Моноклональные антитела к этому антигену могут

пассивно переносить резистентность к малярии у

грызунов и обезьян. С помощью методики

рекомбинантной ДНК клонирован ген,

ответственный за кодирование протективного

спорозоитного антигена Р. falciparum. Протективный

эпитоп состоит из .4 аминокислот, повторяющихся

23 раза. Эта повторяющаяся последовательность

может быть синтезирована для разработки вакцины.

Преимуществами спорозоитной вакцины является то,

что она эффективна без адъюванта и обладает

протективным действием против различных форм Р.

falciparum. Недостатком ее можно считать то, что

иммунитет характеризуется феноменом «все или

ничего»; если несколько спорозоитов избегут иммун-

ного ответа, человек может заразиться малярией.

Мерозоитная вакцина. Организм хозяина вступает

в контакт с мерозоитами в течение короткого

промежутка времени, когда они покидают один

эритроцит и проникают в другой. Зараженные

эритроциты образуют на своей поверхности новые

антигены, возможно, паразитарного происхождения.

Мишенью для вакцины могут быть как мерозоиты,

так и зараженные эритроциты. При пассивном

переносе частичную защиту могут обеспечить

моноклональные антитела к мерозоитам и

эритроцитам, инфицированным возбудителем

малярии грызунов. Эти моноклональные антитела

были использованы для выделения антигенов,

способных индуцировать протективный иммунитет.

Преимущество подобной вакцины заключалось бы в

ее эффективности против стадий паразита,

взаимодействующих с организмом хозяина более

длительный период времени, чем спорозоиты. В

качестве недостатков можно рассматривать то, что

для достижения достаточного протективного эффекта

требуются адъюванты, а также возможную

штаммоспецифичность вакцины.

Гаметная вакцина. В том случае, если в организме

хозяина возникает иммунитет к гаметам (состояние,

которое не встречается в естественных условиях, так

как гамета изолирована от иммунного воздействия

посредством эритроцитарной мембраны,

антигаметные антитела при попадании (одновремен-

но с гаметами) с кровью в организм переносчика

могут нейтрализовать гаметы при освобождении

последних из эритроцитов. По-видимому, по крайней

мере два антигена участвуют в этом процессе, так

как нейтрализация может иметь место, только когда

два различных моноклональных антигаметных

антитела действуют совместно, но не тогда, когда

они действуют в отдельности. Вакцина, действие

которой направлено против гамет, не обладает

достаточным протективным эффектом от болезни, но

может быть применена в целях снижения ее

передачи. В этой связи имело бы смысл включить ее

в состав мультивалентной вакцины против малярии.

Механизмы, позволяющие паразитам избежать

воздействия иммунного ответа хозяина.

У паразитов выработались различные механизмы

ослабления воздействия иммунного ответа хозяина.

Наиболее ярким примером этого служит механизм

антигенных вариаций у африканских трипаносом —

жгутиковых простейших, передаваемых мухой цеце,

возбудителем сонной болезни. Трипаносомы имеет

толстую поверхностную оболочку, состоящую из

многочисленных молекул одного антигенного

гликопротеина. Когда клонируемые организмы,

Медицинская паразитология

имеющие один и тот же поверхностный антиген,

вводятся определенным животным, начинается

последовательное развитие волн паразитемии,

сходных с теми. которые наблюдают у людей,

подвергавшихся укусам зараженных мух цеце. Во

время каждого пика преобладают трипаносомы,

образующие один вариант порерхностного

гликопротеинового антигена (ВПГА), отличного от

всех других ВПГА, образованных во время

предыдущих пиков паразитемии у того же живот-

ного. Клонируемый организм может продуцировать

волны возбудителя с более чем 100 различными

ВПГА. Каждый пик паразитемии индуцирует

выработку растворимых антител против основного

ВПГА. Полагают, что антитела элиминируют

возбудителей с наличием специфического ВПГА, но

трипаносомы, которые смогли переключиться на

другие ВПГА, ускользают. Анализ последователь-

ности аминокислот у ряда ВИГА показал, что они

имели различия только по нескольким замещениям,

что может быть объяснено локальной мутацией, и,

наоборот, аминокислотная последовательность

каждого ВПГА совершенно различна.

Исследования но генному кодированию ВПГА

показали, что каждый ВПГА кодируется с помощью

отдельных генов. Каждая трипаносома, несмотря на

тип имеющегося в данный момент ВПГА, содержит

копию каждого гена ВПГА. Трипаносомы обладают

несколькими механизмами для экспрессии ВПГА.

Например возбудители с экспрессией определенного

гена ВПГА могут иметь дополнительные,

дублирующие копии того же гена; это называется

дублированием, связанным с экспрессией.

Исследования с помощью рестрикционных

ферментов показывают, что дублирование, связанное

с экспрессией, перемещается на новое место,

являющееся специфичным для экспрессии гена. Если

каждый ген представить в виде магнитофонной

кассеты в фонотеке, то для экспрессии ВПГА касета

дублируется, дубликат забирают из фонотеки,

вставляют в генетический магнитофон и проводят

экспрессию.

У некоторых паразитов выработалось множество

механизмов, позволяющих избежать воздействия

иммунного ответа. Шистосомы, например, могут

терять поверхностные антигены после того, как они

попадают в организм хозяина; могут присоединять

антигены хозяина и маскироваться под ткани

хозяина; могут образовывать определенные

внутренние изменения мембраны, обеспечивающие

им резистентность к воздействию иммунитета даже

при наличии поверхностных антигенов, и, наконец,

могут выделять антигены, блокирующие

эффекторные клетки и антитела. Ряд паразитов,

например токсоплазмозы, после заглатывания

макрофагом препятствуют слиянию фагосом с

лизосомами. Другие, такие как лейшмании, не могут

препятствовать слиянию после поглощения, но

обладают устойчивостью к воздействию токсических

субстанций в лизосомах макрофагов. Остальные,

такие как Trypanosoma cruzi, избегают контакта с

лизосомами в цитоплазме.

Некоторые возбудители, такие как филярии,

лейшмании и возбудители малярии, индуцируют

сильные супрессирующие механизмы, включающие

Т-клетки-супрессоры, которые снижают или сводят к

нулю эффективность иммунного ответа хозяина.

Некоторые паразиты могут разрушать медиаторы,

участвующие в воспалительных реакциях,

обеспечивающих эффективный иммунный ответ.

Например, Taenia разрушают компоненты системы

комплемента, амебы продуцируют нейтрализующие

факторы против хемотаксических факторов для

макрофагов. Другие паразиты, такие как аскариды,

по-видимому, обладают поверхностным слоем,

играющим роль антигена, и могут индуцировать

иммунный ответ, но сами, несмотря ни на что,

устойчивы к этому воздействию. Против этих пара-

зитов эффективный иммунный ответ не

формируется.

Хотя некоторые паразитирующие организмы могут

уклоняться от иммунного ответа, они обладают

способностью индуцировать эффективный защитный

иммунный ответ к последующему заражению этими

же видами. Это называется сопутствующим

иммунитетом или нестерильным (инфекционным)

иммунитетом.

Эффекторные механизмы хозяина против

паразитов. К числу эффективных механизмов,

формирующихся против паразитов, относятся

следующие: антитела;

цитотоксические Т-клетки; активированные Т-

клетками макрофаги; естественные клетки-киллеры и

различные клетки, ответственные за

антителозависимую клеточно-опосредованную

цитотоксичность. Сюда относится также усиление

иммунной системы за счет действия лимфокинов и

системы комплемента.

Иммунитет против некоторых паразитов, таких как

возбудители малярии, шистосомы и Trypanosoma

cruzi, является гуморальным. Однако данные, полу-

ченные моделированием на животных, позволяют

заключить, что клеточные реакции также участвуют

в развитии иммунитета против этих и других

паразитов, включая возбудителей лейшманиозов,

токсоплазмоза, шистосомозов, филяриатозов и

трихинеллеза. В то же время не совсем ясно,

развивается ли протективный иммунитет против

амеб, африканских трипаносом или анкилостомид.

Есть данные о том, что не существует естественно

приобретенного иммунитета против аскарид, ришты

или Enterobius vermicularis (остриц).

Известны два механизма иммунитета, которые, по-

видимому, являются уникальными для гельминтозов.

Во-первых, это эозинофилия, во-вторых — актив-

ность антител класса IgE.

Эозинофилы и антителозависимая клеточно-

опосредованная цитотоксичность (АДСС). Уже более

100 лет известно, что эозинофилия всегда

сопутствует гельминтозам, но только в последние

годы были получены данные, что эти клетки могут

функционировать в качестве киллеров. Например,

при взаимодействии с покрытыми антителами

шистосомулами Schistosoma mansoni in vitro

тщательно очищенные эозинофилы губительно

действовали на личинок. Образовавшиеся антитела

относились к классу IgG, и эозинофилы

прикреплялись к Fс-участку IgG посредством

Медицинская паразитология

клеточного Fc-рецептора. Иммунные комплексы или

стафилококковый белок А, препятствующие

связыванию эозинофилов с Fc-участками антител,

ингибируют эту реакцию. Инкубация при

температуре 37 °С делает взаимодействие между

эозннофилами и покрытыми антителами

шистосомулами необратимым. Это было связано с

дегрануляцией и высвобождением главного белка,

преобладающего белка в эозинофильной грануле, и

эозинофильного катионного белка на поверхности

шистосомул. Эти белки в свою очередь являются

токсичными по отношению к личинкам. Эозинофилы

также могут вызывать гибель других гельминтов,

таких, как трихинеллы, по-видимому, с помощью

сходного механизма.

Эозинофилы больных с эозинофилией обладали

способностью вызывать in vitro гибель шистосомул,

покрытых антителами; они действовали так, как

будто были активированы. Кроме того, имеются

растворимые вещества, способные усиливать

киллерную способность эозинофилов in vitro, К ним

относятся стимулирующий эозинофильный

активатор (СЭА); ФКЭ-А, растворимая субстанция,

сходная или идентичная фактору; стимулирующему

рост колоний эозинофилов; растворимый медиатор,

продуцируемый моноцитами и лимфоцитами крови в

культуре.

Протективная роль антител класса IgE. Данные о

том, что уровень антител класса IgE у некоторых

представителей населения стран тропического

региона, особенно у лиц, зараженных гельминтами,

повышен, позволяют предположить, что IgE могут

способствовать защите хозяина против

паразитирующих организмов. Высвобожденные из

активированных тучных клеток медиаторы способны

действовать непосредственно на паразита или,

увеличивая сосудистую проницаемость и выделение

эозинофильного хемотаксического фактора, могут

вести к накоплению необходимых антител (IgG) и

клеток, воздействующих на паразита. IgE-иммунный

комплекс может индуцировать макрофаг-

опосредованную цитотоксичность к шистосомулам.

У крыс со специфическим дефицитом IgE, обуслов-

ленным повторными инъекциями антител с

антиэпсилоновой цепью, наблюдали значительное

снижение резистентности к заражению

трихинеллами.

Иммунопатология. Роль иммунных механизмов в

развитии многих паразитарных болезней достаточно

велика. Примерами этого могут служить

гранулематозная реакция на яйца S. mansoni,

являющаяся основой иммунопатологии при данной

инвазии; наличие иммунных комплексов в случае

заболевания почек при малярии и висцеральном

лейшманиозе; болезни сердца, обусловленные Т.

cruzi; непроходимость сосудов и поражение глаз при

филяриатозах и онхоцеркозе; патологические

изменения в мышцах при трихинеллезе;

аллергические реакции на жидкость из

разорвавшегося эхинококкового пузыря; поражение

легких при миграции личинок нематод. Точно так же

как механизмы супрессии вовлекаются в угнетение

протективного иммунитета, они принимают участие

в модулировании иммунопатологии. Это

наблюдается, например, при модуляции гранулем S.

mansoni Т-клетками-супрессорами.

Моноклональные и антиидиотипические антитела.

Моноклинальные антитела к различным стадиям

малярийных плазмодиев могут быть использованы

для выявления антигенов, способных индуцировать

протективный иммунитет. Кроме того, пассивная

защита обеспечивается с помощью моноклональных

антител к промастиготам Leishmania mexicana и

шистосомулам S. mansoni. С учетом их

специфичности моноклональные антитела могут

быть также использованы для диагностики,

поскольку существует возможность отобрать их

таким образом, чтобы они не давали перекрестных

реакций с сыворотками животных, зараженных

другими паразитирующими организмами. Например,

получены видоспецифические моноклональные

антитела, с помощью которых можно

дифференцировать пять различных видов

южноамериканских лейшманий при отсутствии

перекрестных реакций с Т. cruzi. Антитела в

сыворотках крови больных обычно перекрестно

реагируют с антигенами всех названных

возбудителей. В настоящее время разрабатываются

диагностические тесты с использованием

моноклональных антител. Антитело к антигену

содержит специфический уникальный в своем роде

антиген, который связан с иммуноглобулином. Этот

антиген, названный идиотипическим, обладает

уникальной аминокислотной последовательностью и

конфигурацией антигенсвязывающих участков этих

антител. Например, можно создать антитело к

определенному моноклональному антителу; такое

антитело сможет распознавать идиотип и называется

антиидиотипическим антителом. Моноклональные

антитела будут связываться с антиидиотипическим,

или оригинальным, антигеном. Использование

моноклональных антител для индуцирования

антиидиотипического антитела позволило бы

индуцировать протективный иммунитет посредством

этого антиидиотипа, а не с помощью антител.

Преимуществом такого подхода явилось бы

исключение необходимости очистки антигенов и

последующей наработки их в больших количествах.

Эта новейшая стратегия для производства вакцин

находится на стадии изучения.

Быстрые темпы исследования регуляторных систем

иммунного ответа наряду с успехами в технологии

способствует скорейшему появлению возможности

создания более напряженного искусственного

протективного иммунитета по сравнению с

приобретенным естественным путем. Все это

позволяет предположить, что удастся получить

высокоэффективные вакцины против целого ряда

возбудителей паразитарных болезней.

Иммуноферментная диагностика паразитарных

инвазий

Основной отличительной чертой

иммуноферментного анализа (ИФА) является то, что

в качестве индикаторной молекулы, которая

позволяет следить за иммунным комплексом,

используется молекула фермента. В связи с тем что

Медицинская паразитология

фермент обладает уникальным свойством модифици-

ровать не одну, как в обычных химических реакциях,

а большое число молекул субстрата, т. е. обладает

своего рода усиливающим свойством,

чувствительность иммуноферментных методик

может быть очень высока. В некоторых случаях, как

показывают многочисленные сравнительные

исследования, она выше чувствительности

иммунофлуоресцентных и радиоиммунологических

методов.

История создания иммуноферментных методик

начинается с момента, когда биохимики начали

ковалентно иммобилизовывать («пришивать»)

молекулы ферментов к молекулам белков и, в

частности, к молекулам иммуноглобулинов. Однако

потребовалось пять лет для создания методики

иммуноферментного анализа именно в том виде, в

каком мы используем его в настоящее время.

Принципы этого метода следующие:

— комплекс антиген — антитело можно выявить,

если ввести в состав одного из участников иммунной

реакции (ковалентно «пришить») одну или несколько

молекул фермента. Причем эта процедура на

промежуточных (в процессе «пришивки») и

финальной стадии (конъюгат антигена или антитела с

ферментом) не должна изменять иммунные свойства

фермент-меченного участника иммунной реакции;

— удобно выявлять иммунный комплекс, используя

способность фермента расщеплять субстрат, который

при ферментативной модификации изменяет свой

цвет. В этом случае для выявления комплекса

антиген — антитело обычно используют

спектрофотометрию;

— иммунный комплекс можно выявлять с помощью

иммуноферментного анализа как в растворе, так и

при адсорбции (или ковалентной иммобилизации) на

твердом носителе.

Различают два принципиально различных типа ИФА

— гомогенный и гетерогенный (твер-дофазный)

иммуноферментный анализ.

Гомогенный иммуноферментный анализ (ГИФА) —

наиболее простой в методическом отношении вид

ИФА. При его постановке один из участников

иммунной реакции (обычно это низкомолекулярный

антиген) метится ферментом и за ходом

формирования комплекса антиген-антитело следят,

регистрируя изменение активности фермента.

Такое нарушение ферментативной активности может

возникать либо за счет пространственного

разобщения фермента и субстрата, либо за счет

конформационных изменений в молекуле фермента ,

сопровождающих формирование иммунного ком-

плекса

ГИФА имеет ряд существенных преимуществ перед

другими с иммунохимическими методами. Во-

первых, высокая экспрессия (весь анализ с помощью

ГИФА занимает минуты и даже доли минут). . Во-

вторых, метод имеет одну стадию и не требует

трудоемких этапов промывки. И, наконец, в-третьих,

метод требует минимальных объемов (8—50 мкл) и

количеств биологического или клинического

образца. Однако у метода ГИФА имеется один

крайне существенный недостаток — на его основе

можно создавать диагностические тест-системы

только для низкомолекулярных антигенов. Только в

этом случае антитело, взаимодействуя с антигеном,

может эффективно экранировать или

модифицировать связанную с этим антигеном

молекулу фермента. Именно в связи с этим,

несмотря на кажущуюся простоту и очевидные

преимущества перед другими методами, на основе

ГИФА были созданы диагностикумы для выявления

только гормонов, пептидов, лекарственных и

наркотических веществ и некоторых

низкомолекулярных белков.

Гетерогенный (твердофазный) иммуноферментный

анализ (ТФИФА или ELISA) в последние годы

особенно широко используется в биологии и

медицине. Как и для других твердофазных методов

анализа, характерной особенностью ТФИФА

является то, что в процессе проведения анализа один

из участников реакции антиген — антитело

иммобилизуется на твердом носителе. Эту фиксацию

антигена или антител можно осуществлять либо

путем их ковалентной «пришивки» к полимерной или

стеклянной матрице, либо путем их физической

адсорбции на твердом носителе за счет достаточно

прочных сил электростатического и ван-дер-

ваальсового взаимодействия. Идея иммобилизации

иммунного комплекса важна для анализа

многокомпонентных смесей макромолекул, когда в

системе должны оставаться только те компоненты

смеси, которые обладают нужными

иммунохимическими свойствами. Именно

твердофазные методики позволяют избавиться от

балластных, не вошедших в иммунный комплекс

антигенов простой промывкой.

Необходимо отметить, что в своей физико-

химической основе твердофазный ИФА очень сходен

с твердофазным РИА. Отличие касается лишь

индикаторных молекул — в ТФИФА это фермент, в

твердофазном РИА это радиоактивные изотопы.

Остальные же принципы анализа полностью

совпадают — в обоих методах используется твердая

матрица, на которой адсорбируется иммунный

комплекс, и идентичный способ удаления из системы

не вошедших в комплекс компонентов

диагностикума. Поэтому многочисленные варианты

различных схем анализа, приведенные ранее для

твердофазного РИА, могут быть использованы для

описания методик анализа, применяемых при

постановке ТФИФА.

Для обнаружения в биологических и клинических

образцах паразитарных антигенов особенно часто

применяется так называемый сэндвич-метод или

модифицированный сэндвич-метод. При

использовнии этих методик на твердую подложку

(обычно полистирол) сорбируются последовательно

первичные антитела, выявляемый антиген и

вторичные антитела. В случае двойного сэндвич-

метода ферментная метка вводится в состав

вторичных антител, в случае модифицированного

двойного сэндвич-метода вторичные антитела

(немеченые) «проявляются» антивидовыми

меченными ферментом иммуноглобулинами. Особая

популярность последней разновидности ТФИФА

объясняется тем, что для выполнения методики нет

необходимости синтезировать специфические для

Медицинская паразитология

каждого конкретного антигена конъюгаты (меченные

ферментом антитела).

В последние годы были разработаны методики

ТФИФА, использующие в качестве «проявляющих»

конъюгатов молекулярные комплексы ферментов с

белком А золотистого стафилококка. Как известно,

это белок взаимодействует с высокой константой

связывания с тяжелой цепью (Fc-фрагментами)

иммуноглобулинов. Это позволяет построить

диагностические системы, где в качестве

«проявляющего» агента используются не

антивидовые антитела, а белок А. В этом случае,

однако, возникают некоторые трудности, связанные с

неспецифичностью белка А, который

взаимодействует с Fc-фрагментами любых антител.

Если использовать обычную сэндвич-методику,

заменив лишь антивидовой конъюгат на конъюгат на

основе белка А, последний будет взаимодействовать

не только со вторичными антителами, но и с

первичными иммуноглобулинами, давая

положительную реакцию, даже если проба не

содержит искомого антигена. В этом случае имеется

несколько вариантов решения проблемы. Во-первых,

в качестве первичных антител в методике можно

использовать иммуноглобулины, с которыми белок А

взаимодействует слабо (например, с мышиными

иммуноглобулинами). Во-вторых, возможна прямая

адсорбция антигена на полистирол, когда первичные

антитела просто не используются. И, наконец, в

качестве первичных антител можно применять не

полные молекулы иммуноглобулинов, а молекулы,

лишенные Fc-фрагментов, — так называемые Fab-

фрагменты. В этом последнем случае

дополнительным удобством методики будет являться

то, что для конструирования диагностической

системы можно будет использовать не две

сыворотки» полученные от разных животных, а одну.

Именно в связи с этими обстоятельствами в

настоящее время разработано и разрабатывается

большое число диагностических методик,

использующих конъюгаты на основе белка А.

Постановка и учет результатов иммуноферментной

реакции (ИФР)

Постановку и учет иммуноферментной реакции, в

качестве примера, можно представить в

микроварианте ИФР, разработанного Белозеровым

С.Н., Успенским А.В., Ждановой О.Б. (1997), с

целью обнаружения противотрихинеллезных антител

в сыворотке крови животных (песцов).

Нерастворимой основой служили планшеты из

полистирола, при исследовании в ИФР небольшого

количества проб использовали стрипы. Для

разведения антигена использовали

комплексирующий 0,01 М карбонатно-

бикарбонатный буфер рН 9,6. Все виды

биологических жидкостей (антиген, исследуемую

сыворотку, конъюгат) и субстрат вносили в объеме

0,2 мл. Инкубировали антиген в течение часа, с

последующим его инкубированием в холодильнике

при +4 С в течение 16-20 часов. Планшеты

отмывали от не связавшихся антигенов вначале

водопроводной водой, потом 0,05% раствором

Твина на водопроводной воде. Такую операцию

проводили после каждого этапа постановки реакции.

Исследуемую сыворотку разводили 0,01 М

фосфатно-солевым буфером (ФСБ) рН 7,2 с

добавлением 0,05 % раствора Твина-40(20) и 0,05 %

альбумина и вносили в лунки планшета в

раститровке (для определения минимального

диагностического титра), либо в скрининг - титре,

определенном для тест системы, а затем

инкубировали в течение 30 минут при температуре

+37 С.

Отрицательным контролем служила сыворотка

крови здорового животного, а положительным

сыворотка здорового песца, экспериментально

инвазированного 10000 личинок трихинелл на

животное, взятая на 35 день с момента инвазии.

После отмывки от не связавшихся антител

следующим этапом постановки ИФР было внесение

конъюгата. Конъюгат вносили также в 0,01 М ФСБ

рН 7,2 в рабочем разведении, испытанном

предварительно для каждой серии конъюгата и

инкубировали в течение 30 минут при температуре

37о С, после чего проводили отмывку от не

связавшегося конъюгата. Каждое инкубирование

проводили во влажной атмосфере. Рабочее

разведение для данной серии конъюгата было

установлено 1:3000.

Свежеприготовленную субстратную смесь

(ортофенилендиамин в цитратном буфере) вносили в

каждую лунку по 0,2 мл и выдерживали при

комнатной температуре 30 минут в темноте.

Реакцию останавливали, используя в качестве стоп-

реагента концентрированную (0,9 моль/ л) серную

кислоту, которую вносили в каждую лунку планшета

по 50 мкл. Визуально оценку реакции проводили по

интенсивности окрашивания лунок. Положительная

реакция проявляется в виде потемнения субстратной

смеси до красновато-бурого оттенка, в лунке

сенсибилизированной антигеном, где

инкубировалась сыворотка животного

инвазированного Т. spiralis. При отсутствии

изменения цвета реакцию оценивали как

отрицательную. При незначительном изменении

цвета субстратной смеси

(при бледно-желтой окраске) реакцию оценивали, как

сомнительную и сыворотку повторно исследовали в

ИФР.

Так как, при использовании ортофенилендиамина

(ОФД) в качестве субстрата, окраска в случае

положительной реакции имеет красноватый оттенок,

то при учете реакции на спектрофотометре

использовали длину волны 492 нм. Регистрацию

результатов ИФА проводили немедленно после

остановки пероксидазной активности на

спектрофотометре.

Определение минимального специфического титра

ИФР при трихинеллезе.

Минимальным специфическим титром считали

такой, при котором наблюдали выявление

пероксидазной активности по изменению цвета

субстрата от насыщенного желтого до темно - бурого

с сыворотками экспериментально инвазированнми

личинками трихинелл песцов, но изменение цвета

субстрата отсутствовало или было весьма

незначительным (до бледно-лимонного) с

гетерологическими (зараженных другими

Медицинская паразитология

гельминтозами) сыворотками и сыворотками

здоровых животных.

Методы генного зондирования

Интенсивное развитие молекулярной биологии и

создание совершенной методической базы

генетических исследований явились основой

генетической инженерии. В области диагностики

возникло и бурно развивается направление по

определению специфических нуклеотидных после-

довательностей ДНК и РНК, зонд с меткой так

называемое генное зондирование. В основе

подобных методик лежит способность нуклеиновых

кислот к гибридизации—образованию двухцепочных

структур за счет взаимодействия комплементарных

нуклеотидов (А-Т, Г-Ц). Для (или РНК) специально

создается, так называемый, зонд-полинуклеотид с

определенной последовательностью оснрований. В

его состав вводят специальную метку позволяющую

идентифицировать образование комплекса. Хотя

генное зондирование нельзя отнести к методам

иммунохимического анализа, основной его принцип

(взаимодействие комплементарных структур)

методически реализуется теми же способами, что и

индикаторные методы иммунодиагностики. Кроме

того, методы генного зондирования позволяют

восполнить информацию об инфекционном агенте в

отсутствии его фенотипической экспрессии. Первые

сообщения об использовании зондов были связаны с

чисто исследовательскими задачами молекулярной

биологии — контролем наличия тех или иных

последовательностей ДНК в общем пуле клеточной

ДНК. Различают несколько разновидностей генного

зондирования: гибридизация по Саузерну (анализ

ДНК), Nothern-blot (анализ РНК), точечная

гибридизация, гибридизация in situ (на срезе, в

мазке).

Для проведения анализа ДНК пробу подвергают

денатурации с целью получения одноцепочных

структур, с которыми и реагируют молекулы ДНК-

или РНК-зонда. Для приготовления зондов

используют либо различные участки ДНК (или РНК),

выделенные из естественного источника (например,

того или иного патогенного организма), как правило

представленные в виде генетических

последовательностей в составе векторных плазмид,

либо химически синтезированные олигонуклеотиды.

В некоторых случаях в качестве зонда применяют

препараты геномной ДНК, гидролизованной на

фрагменты, иногда — препараты РНК, особенно

часто — рибосомальная РНК (Stull Т. et al., 1988).

В качестве метки используют те же индикаторы,

что и при различных видах иммунохимического

анализа: радиоактивные изотопы, флуоресцеины,

биотин (с дальнейшим проявлением комплексом

авидин-фермент) и т. п.

Порядок проведения анализа определяется

свойствами имеющегося зонда. В исследовательских

лабораториях используют ДНК-зонды,

приготовленные самостоятельно и меченые, как

правило, радиоактивным фосфором. В настоящее

время все чаще применяются коммерческие наборы,

содержащие все необходимые ингредиенты.

В большинстве случаев процедуру проведения

анализа можно разделить на следующие стадии:

подготовка образцов (в том числе экстракция и

денатурация ДНК), фиксация пробы на носителе

(чаще всего — полимерный мембранный фильтр),

предгибридизация, собственно гибридизация,

отмывание несвязавшихся продуктов, детекция. При

отсутствии стандартного препарата ДНК- или РНК-

зонда предварительно проводится его получение и

введение метки.

Проводится и непосредственный анализ образцов

сыворотки крови, мочи, уретральных соскобов,

форменных элементов крови или цельной крови на

присутствие инфекционного агента. Для

освобождения нуклеиновых кислот из состава

клеточных структур проводят лизис клеток, а в

некоторых случаях очищают препарат ДНК с

помощью фенола. Денатурация ДНК, т. е. переход ее

в одноцепочную форму, происходит при обработке

щелочью. Затем образец нуклеиновых кислот

фиксируют на носителе — нитроцеллюлезной или

нейлоновой мембране, обычно путем инкубации от

10 мин до 4 час при 80 С в вакууме. Далее, в

процессе предгибридизации достигается инактивация

свободных мест связывания для уменьшения

неспецифического взаимодействия зонда с

мембраной. Процесс гибридизации занимает от 2 до

20 ч, в зависимости от концентрации ДНК в образце,

концентрации используемого зонда и его размера.

После окончания гибридизации и отмывания

несвязавшихся продуктов проводится детекция

образовавшегося комплекса. Если в состав зонда

входит радиоактивная метка, то для проявления

реакции мембрану экспонируют с фотопленкой

(ауторадиография). Для других меток используют

соответствующие процедуры. Например, известен

метод определения модифицированных участков

ДНК с помощью антител (Stollar В., Rashtchian A.,

1987), введением в состав зонда низкомолекулярных

компонентов (биотин, дигоксин и т. п.) с

последующим проявлением конъюгатом авидин-

фермент, антитело-фермент (van Brunt J., Klausner

A., 1987).

Первые сообщения о коммерческих образцах

наборов для генного зондирования появились в 1986

г. — ими стали наборы для определения М.

pneumoniae, L. pneumoniae. Затем появились наборы

для индентификации других патогенов.

Наиболее перспективным является получение

нерадиоактивных (так называемых — холодных)

зондов. На этой же основе развивается методика

гибридизации, позволяющая устанавливать наличие

патогена в препаратах срезов, пунктатов ткани, что

особенно важно при патоморфологическом анализе

(гибридизация in situ).

Существенным этапом в развитии методов генного

зондирования явилось использование полимеразной

реакции амплификации (PCR). Этот подход

позволяет увеличить концентрацию определенной

(заранее известной) последовательности ДНК в

пробе за счет синтеза многочисленных копий in vitro.

Для проведения реакции к исследуемому образцу

ДНК добавляют препарат фермента ДНК-

полимеразы, избыток дезоксинуклеотидов для