4.1. Исследования в опытах на прокариотах. Тест Эймса
В основе теста, разработанного Брюсом Эймсом, лежит способность мутагенов вызывать
обратную мутацию измененного штаммаSalmonella typhimurium, неспособного к биосинтезу
гистидина. Микроорганизмы данного штамма не растут в среде, не содержащей гистидин, однако
под влиянием мутагенов вновь приобретают эту способность, свойственную исходному штамму
сальмонелл (обратная мутация). В настоящее время созданы специальные штаммы, позволяющие
выявлять мутации типа "замещение основания" (штамм ТА-1531) и типа "сдвиг цепи нуклеотдидов"
(штамм ТА-1537, ТА-1538).
Тест осуществляется на суспензии бактериальных клеток в расплавленном при 45
0
агаре. В
инкубационную среду (не содержащую гистидин) добавляют токсикант. К части проб добавляют
также фракцию микросом, выделенных из гепатоцитов крыс, предварительно обработанных
полихлорированными бифенилами, с целью индукции цитохромовР-450 (фракцияS-9). Смеси
разливают по чашкам Петри. Число бактерий, приобретших вследствие обратной мутации
способность синтезировать гистидин, оценивают путем подсчета колоний, развившихся в
инкубате. Исследуемое вещество оценивается в нескольких концентрациях (установление дозовой
зависимости эффекта). В итоге получается информация о наличии мутагенности у исходного
вещества (среды без фракцииS-9) и его метаболитов (среды, содержащие фракциюS-9).
Недостатком метода является сложность получения количественных характеристик мутагенной
активности обследуемых веществ для млекопитающих и человека.
В настоящее время тестирование проводят и на других биологических объектах (прямая и
обратная мутацияEscherichia coli,прямая мутация сальмонелл).
4.2. Исследования в опытах на клетках млекопитающих
Первоначально считалось, что культуры клеток млекопитающих будут идеальным объектом для
изучения мутагенной активности токсикантов. Однако в процессе работы, вскрылись
обстоятельства поколебавшие эти представления. Прежде всего клетки многих тканей трудно
культивировать, у многих из них практически отсутствует способность к клонированию,
метаболическая активность клеток недостаточна. В настоящее время в исследованиях
предпочтение отдают культурам клеток перевиваемых линий (например, овариальные клетки
китайского хомячка, клетки мышиной лимфомы и т.д.). Однако чувствительность этих клеток к
ксенобиотикам уже отличается от чувствительности клеток первичных тканевых культур.
Исследования по оценке мутагенности обычно проводят, изучая изменения резистентности клеток
к: 8-азагуанину или 6-тиогуанину (определяется активностью гипоксантин-гуанин-
фосфорибозилтрансферазы - ГГФРТ); бромдезоксиуридину или трифтортимидину (определяется
активностью тимидинкиназы - ТК); оуабаину (определяется активностьюNa/К-АТФазы).
ГГФРТ регулирует инкорпорацию пуринов из среды в клетку. Мутация локуса ДНК, ответственного
за синтез энзима, приводит к угнетению ферментативной активности, прекращению транспорта
пуринов в клетку, в том числе и их токсичных аналогов. Мутировавшие клетки выживают в среде,
содержащей аза- и тиогуанины.
ТК активирует транспорт пиримидинов. Мутация лкуса ДНК, ответственного за синтез ТК, делает
клетку не чувствительной к токсическому действию токсичных аналогов пиримидина.
Оуабаин убивает клетки, взаимодействуя сNa/К-АТФазой. Мутация локуса, ответственного за
синтез этого энзима изменяет его сродство к токсиканту, увеличивает резистентность клетки к яду.
Наиболее часто используется модель мутации ТК локуса в опытах с культурой клеток мышиной
лимфомы (иногда с добавлением в инкубационную средуS-9 фракции гепатоцитов). После
воздействия исследуемого токсиканта оценивается количество клеток, способных образовывать
колонии в среде, содержащей бромдезоксиуридин.
В настоящее время описано множество других тест-объектов, на которых можно проводить
подобные исследования.