Кругликов Р.И. (ред.) Нейрохимические основы обучения и памяти

Подождите немного. Документ загружается.

Влияние циклического аналога энкефалинов

на белковый метаболизм нейронов

В последние годы большое внимание исследователей

привлекают нейропептиды. В числе многих функций

нейропептидов наиболее существенная заключается в их

участии в регуляции высших интегративных функций

мозга—обучении и памяти [13]. Главная особенность

биологического действия нейропептидов состоит в раз-

нообразии и сложности вызываемых ими эффектов.

Сложный характер имеет и влияние различных ней-

ропептидов на синтез белков. Так, ряд авторов показали

стимулирующее влияние АКТГ, АКТГх_ю, АКТГ

на включение

С лейцина в мозговые белки как in vitro,

так и in vivo [31, 32, 34]. Обнаружено, что АКТГх_

стимулирует синтез белка как в мозге, так и в печени,

в то же время влияние АКЛТ

на синтез белка в мозге

сходно с влиянием АКТГх_

, по он совершенно неэф-

фективен в печени [26]. При исследовании влияния АКТГ

разных последовательностей показано, что АКТГх_

стимулирует включение в белки in vitro, подобно

АКТГ

[33], в то же время последовательность

АКТГц_2

, которая поведенчески гораздо менее активна,

не влияет на включение

С лейцина в мозговые белки

[33, 35]. Описана также двухфазная кривая дозореакции

АКТГх_

: пептид имеет стимуляторный эффект в дозах

0,01—100 нМ и тормозящий эффект в дозе 10 мкМ in

vivo. В этих же условиях АКТГх_х

похож по активности

на АКТГХ_

, но АКТГ

И АКТГХ_

не показали

активности [36]. К сожалению, попытки объяснить раз-

личное влияние отдельных аналогов нейропептидов пока

преждевременны, так как исследования катаболизма

нейропептидов затруднены в силу неразработанности

надежных тест-систем и отсутствия специфических ин-

гибиторов и активаторов отдельных пептидаз [24].

Обнаружено дифференцированное влияние пептидов

и на белковый синтез различных популяций нейронов.

Так, введение анальгезирующей дозы (500 мкг/кг) энке-

фалинподобного тетрапептидамида (ТПА) через 30 мин

активировало метаболизм белка в нейронах V слоя мо-

торной коры и хвостатого ядра и снижало его в пирами-

дах III слоя сенсомоторной коры [7,21]. Через 3 сут пос-

ле введения ТПА в цитоплазме нейронов V слоя сенсо-

моторной коры наблюдалось уменьшение содержания

белка, а в нейронах III слоя оно оставалось на уровне

141

контроля [6]. Р. М. Худоерков, наблюдая отсроченное

действие 500 мкг/кг ТПА на синтез мозговых белков,

обнаружил, что через 6 сут после введения ТПА увели-

чивается интенсивность включения

Н-лейцина в ней-

роны V слоя двигательной коры и в меньшей степени

в нейроны хвостатого ядра. В нейронах III слоя скорость

синтеза белка не отличается от контрольного уровня [22].

В работе Изкиердо с соавторами [30] показано, что

в дозе 10 мг/кг изучаемые пептиды ф-эндорфин, метэнке-

фалин, лейэнкефалин и дез-тир-метэнкефалин) оказыва-

ют четкий амнестический эффект. Однако любой из изу-

чаемых пептидов в дозе 20 мг/кг не изменял числа пра-

вильных реакций животных по сравнению с контролем

(введение физиологического раствора). Совсем иная

картина наблюдается при изучении эффектов введения

этих пептидов на включение

С лейцина в мозговые бел-

ки. Так, в дозе 10 мг/кг синтез белка подавлялся лейэн-

кефалином в гомогенатах амигдалы, хвостатого ядра

и гиппокампа, и дез-тир-метэнкефалином — в хвостатом

ядре. В то же время метэнкефалин усиливает синтез

белка в хвостатом ядре. В дозе 20 мг/кг наблюдалось

увеличение включения метки в белки амигдалы и хвоста-

того ядра под влиянием лейэнкефалина и в белки амиг-

далы и гиппокампа под влиянием метэнкефалина. Дез-

тир-метэнкефалин увеличил синтез белка в амигдале,

хвостатом ядре и гиппокампе. По мнению авторов, опио-

идные пептиды влияют на синтез белка, регионы влияния

каждого пептида различны и природа нейрофармаколо-

гического действия каждого пептида также различна;

кроме того, отсутствует корреляция между их влиянием

на синтез мозговых белков и их влиянием на обучение

и консолидацию памяти [30].

В нашей лаборатории изучали в поведенческом и био-

химическом аспекте влияние представителя группы цик-

лических аналогов энкефалинов (ЦАЭ) на процессы обу-

чения и памяти [14]. Этот пептид, синтезированный со-

трудником Института органического синтеза АН

ЛатвССР И. В. Бобровой, обладает повышенной биоло-

гической активностью.

Установлено, что введение 10 мкг ЦАЭ на животное

до выработки условных рефлексов пассивного избегания

(УРПИ) не сказалось на их выработке, но глубоко на-

рушило их сохранение. В отличие от выработки УРПИ

выработка УРДИ при введении ЦАЭ существенно (почти

в 2 раза) ускорялась, но сохранение этих рефлексов через

142

неделю у подопытных животных было таким же, как у

контрольных [14]. В этой же работе исследовали влияние

ЦАЭ на синтез белков в различных церебральных струк-

турах и обнаружили, что включение

Н-тирозина в водо-

растворимые и водонерастворимые белки через 40 мин

после инъекции ЦАЭ тормозится. Но в гиппокампе в от-

личие от двигательной коры обнаружена лишь тенден-

ция к подавлению синтеза вышеописанных белков.

В связи с изложенным, а также с целью углубленного

изучения свойств этого пептида была предпринята по-

пытка исследовать цитохимически, т. е. приуроченно

к отдельным классам нейронов двигательной коры и гип-

покампа, влияние введения малой дозы ЦАЭ на метабо-

лизм церебральных белков у крыс как обучавшихся

УРДИ, так и с последующим сопоставлением получен-

ных данных с результатами изучения влияния выработки

УРДИ на содержание белков в нейронах неокортекса

и гиппокампа. Для этого были проведены две серии экс-

периментов на 30 беспородных крысах-самцах массой

150—180 г:

I серия — введение ЦАЭ необученным животным:

1-я группа — подкожное введение животным ЦАЭ в дозе

10 мкг/крысу и последующая (через 10 мин) их декапи-

тация; 2-я группа — такое же введение ЦАЭ с последую-

щей (через 40 мин) декапитацией животных; 3-я группа —

контрольная — введение животным физиологического

раствора.

II серия — введение ЦАЭ перед выработкой УРДИ:

4-я группа —• обучение животных УРДИ на фоне дейст-

вия ЦАЭ. ЦАЭ в дозе 10 мкг на животное вводили под-

кожно за 10 мин до начала обучения; 5-я группа — группа

активного контроля —ЦАЭ вводили за 10 мин до начала

несочетанных предъявлений условного и безусловного

стимулов (света и электрического тока); 6-я груп-

па— группа пассивного контроля, также получавшая

ЦАЭ. В каждой группе использовали по пять животных.

Во II серии животных декапитировали сразу после окон-

чания сеанса, длившегося в среднем 30 мин. Таким об-

разом, во II серии, как и во 2-й группе, декапитация

производилась через 40 мин после введения ЦАЭ.

Результаты цитоинтерферометрического исследования

нейронов гиппокампа крыс, декапитированных через

40 мин после инъекции ЦАЭ, представлены на рис. 3, А.

Достоверные изменения сухой массы под влиянием вве-

дения ЦАЭ обнаружены лишь в ядрах нейронов поля

143

115

110

105

100

^ Поле СА-1

Поле СА-3

- я и

Я * Ц

Рис. 3. Содержание белка в ней

ронах гиппокампа крыс

А — декапитированных через 40 мин/Д^

после введения ЦАЭ в сравнении с жи-

вотными, получавшими физиологический jqq

раствор (К); Б — при выработке УРДИ

на фоне действия ЦАЭ в сравнении с

пассивным контролем, также получав-

шим ЦАЭ; В — при несочетанном предъявлении условного и безус-

ловного стимулов на фоне действия ЦАЭ в сравнении с пассивным контролем,

получавшим ЦАЭ. Обозначения те же, что на рис. 1

СА-3. Однако даже достоверное изменение в поле СА-3 не

превышало 4%. Этим, вероятно, можно объяснить от-

сутствие достоверных сдвигов при биохимическом ис-

следовании гомогенатов гиппокампа животных, получав-

ших ЦАЭ. О влиянии ЦАЭ на белковый метаболизм у

обученных животных судили по изменению содержания

белка в нейронах гиппокампа у животных, обучавшихся

УРДИ и у животных группы активного контроля. На

рис. 3, Б видно, что при выработке УРДИ на фоне дейст-

вия ЦАЭ нейроны поля СА-1 реагируют лишь тенденцией

к снижению содержания белка по сравнению с крысами

группы пассивного контроля, также получавшими пеп-

тид. В то же время нейроны поля СА-3 реагируют рез-

ким увеличением (на 11,7%) сухой массы ядер по срав-

нению с группой пассивного контроля.

По поводу большей реактивности нейронов поля СА-3

гиппокампа на введение энкефалинов следует упомянуть

несколько работ. Во-первых, обнаружена энкефалиновая

иммунореактивность в мшистых волокнах гиппокампа,

благодаря которым активируются нейроны поля СА-3,

после переключения через зернистые клетки зубчатой

фасции [28]; во-вторых, показано увеличение реактив-

ности зернистых клеток под действием ионофоретической

аппликации Д-ала

-лей

-энкефалина [38], и в-третьих,

144

в гиппокампе максимальные количества рецепторов

Д-ал а-д-лейэи кефали на обнаружили в пирамидном слое

поля СА-3 [25J. К этим работам можно добавить и ре-

зультаты наших исследований: ускорение выработки

УРДИ на фоне действия пептида ЦАЭ сопровождается

резким увеличением содержания белка в ядрах нейронов

поля СА-3 при отсутствии достоверных изменений в ней-

ронах поля СА-1.

Несочетанные предъявления света и электрического

тока при действии ЦАЭ приводили к достоверному сни-

жению (до 95,1%) сухой массы ядер нейронов поля СА-1

и увеличению (до 107,5%) сухой массы ядер нейронов

поля СА-3 по сравнению с группой пассивного контроля

(тоже получавшего ЦАЭ). Сухая масса цитоплазмы ней-

ронов обоих полей практически не отличалась от группы

пассивного контроля (см. рис. 3,В).

Если сопоставить рис. 2, А, Б с рис. 3, Б, В, то мож-

но заметить, что ЦАЭ увеличивает содержание белка

в нейронах поля СА-3 не только при выработке УРДИ,

но и при несочетанных предъявлениях света и электри-

ческого тока, несмотря на подавляющее влияние этих

раздражителей на содержание белков в нейронах поля

СА-3 в отсутствие влияния ЦАЭ (см. рис. 2, Б), а также

независимо от угнетающего влияния ЦАЭ на белковый

метаболизм этих нейронов у контрольных крыс, т. е.

в отсутствие выработки УРДИ или предъявления выше-

указанных раздражителей (рис. 3, А).

На основании изложенного можно прийти к заклю-

чению, что пептид ИОС-708 оказывает регулирующее

влияние на белковый метаболизм нейронов гиппокампа

в зависимости от их функционального состояния. Это

влияние выражается в том, что более реактивные ней-

роны поля СА-3 на действие пептида во время выработки

УРДИ или несочетанного предъявления света и электри-

ческого тока реагируют увеличением содержания белка

в них. В то же время действие пептида на белковый мета-

болизм этих нейронов в состоянии «покоя» оказывается

ингибирующим. Менее реактивные нейроны поля СА-1

гиппокампа на введение пептида реагируют лишь в си-

туации активного контроля и то маловыраженным сни-

жением содержания белка в их ядрах.

Существенное влияние ЦАЭ на метаболизм белка

в нейронах гиппокампа как в контроле, так и при обу-

чении, возможно, объясняется хорошо выраженной ин-

нервацией гиппокампальных структур энкефалиноподоб-

145

ными иммунореактивными терминалями [9]. В то же

время существует мнение, что в коре больших полушарий

головного мозга энкефалинсодержащие нейроны или тер-

минали отсутствуют [15] или содержатся в небольшом

количестве [11]. При этом отмечается влияние энкефали-

нов на моторную активность [7].

При сравнении изменений показателей метаболизма

белка, характеризующих степень активности разных

популяций нейронов при выработке пищевых инстру-

ментальных рефлексов, отмечалась разная реакция ней-

ронов гиппокампа и двигательной коры [12, 17, 20].

Выработка УРДИ сопровождалась в значительной мере

совпадающими результатами для нейронов двигательной

коры и гиппокампа. Влияние введения ЦАЭ на метабо-

лизм белка в нейронах двигательной коры было неодно-

значным для разных классов нейронов (рис. 5), так же

как и для нейронов разных полей гиппокампа. Для оцен-

ки влияния ЦАЭ на содержание белка в исследованных

церебральных структурах целесообразно сопоставить

соответствующие показатели у животных, получавших

ЦАЭ, и у животных, у которых вырабатывали УРДИ

в норме и на фоне действия ЦАЭ.

На рис. 1, 4 и 5 представлены результаты определения

концентрации, содержания белка в ядре и цитоплазме

и площади этих клеточных структур для пирамидных

нейронов III и V слоев и вставочных нейронов (интер-

нейронов) V слоя двигательной коры.

Как следует из рис. 4, А, выработка УРДИ на фоне

действия ЦАЭ сопровождалась значительным увеличе-

нием содержания белка в ядре (на 8,5%) и цитоплазме

(5,9%) крупных пирамидных нейронов V слоя, менее

существенным увеличением концентрации и содержания

белка в цитоплазме пирамид III слоя (на 4,8 и 3,4% соот-

ветственно) и практически полным отсутствием изменений

исследуемых показателей в интернейронах V слоя.

Средние пирамиды V слоя выделялись своей реакцией:

повышению содержания белка в цитоплазме сопутство-

вало равнозначное уменьшение его содержания в ядре.

Вероятно, в данном случае происходит усиление транс-

порта белка из ядра в цитоплазму.

Следовательно, влияние ЦАЭ при выработке УРДИ

проявилось в изменении спектра активности нейронов.

Исходя из общепринятого положения о том, что повы-

шенной функциональной активности нейронов соответст-

вует усиление метаболизма белка и РНК. [8], из приве-

146

*Г

3 § 5

Я н

К В

>0 °

£ *

В S

Я о

я о

cs CS

К и

О S

ю £

2. У

л Ф

га ct

я <u

О. д

с о

3-е-

Й-м

s 2

та >>

ю н

ЕС и

о °

о ш-я;

О. д -Г

•S о"^

в 3 S

* s g

5 VO 5

н та

° В "

В >>

О. о ч

£ ° 2

« °

« ш а)

2"0 *

®ЧЗ

ч- я g

. к 0>

О и ч

s о) о

ft. ч а.

fet

fcf

T- °

я s-

S U

о о.

<d к

а. а

а) <L>

„ о

к о

И К

га со

га я

2-е-

С Я

5 a

* я

«5

- >,

о Ч

2 о

О. С

ы:

о X

5 =

в со

Ч га

5 д-

~ к

га

и ш

я <=[

н 0J

и и

я в

Е- Ч

£ О

хч

ю ®

о S

а. ^

денных выше данных можно было бы сделать вывод, что

под влиянием ЦАЭ изменилась степень участия нейро-

нов разных слоев двигательной коры в метаболическом

обеспечении фиксации временной связи, преимуществен-

но в пользу крупных пирамид V слоя. Однако следует

также учесть, что полученные данные отражают состоя-

ние белкового метаболизма в нейронах в момент упроче-

ния условного рефлекса, по завершении обучения, так

как мозг брали на исследование сразу после окончания

сеанса выработки УРДИ, длившегося около 30 мин.

В то же время изучение воздействия ЦАЭ на интакт-

ный (необученный) мозг показало некоторую динамику

изменений метаболизма белка в нейронах. Как следует

из рис. 5, А и Б, через 10 мин после введения животным

ЦАЭ (именно в это время начиналась выработка УРДИ

в опытах с обучением крыс) содержание белка сущест-

венно повышалось (на 7,4%) только в пирамидах III слоя

коры, в цитоплазме этих нейронов. Во всех остальных

исследованных нейронах изменения практически отсут-

ствовали, но имелась тенденция к уменьшению содержа-

ния белка в интернейронах (на 5,3%) и средних пирами-

дах V слоя (на 4,2%). Через 40 мин после введения

ЦАЭ (т.е. к моменту завершения обучения) у необучен-

ных крыс под влиянием пептида содержание белка в той

или иной степени уменьшалось. Следует подчеркнуть,

что у пирамид III слоя содержание белка в цитоплазме

(возросшее через 10 мин) возвращалось к норме, но зато

существенно снижалось в ядре.

Что касается крупных пирамид, ни через 10, ни

через 40 мин не отмечалось существенных изменений их

сухого веса, поэтому особого внимания заслуживает

значительное увеличение их сухого веса при выработке

УРДИ на фоне влияния ЦАЭ, более выраженное, чем

при выработке УРДИ у интактных животных (ср.

рис. 4 и 1).

В опытах с ионофоретическим подведением энкефали-

нов к нейронам коры головного мозга отмечена исключи-

тельная чувствительность пирамидных нейронов к их

воздействию [2]. В то же время существует мнение о по-

давлении опиоидными пептидами общей двигательной

активности животных [23]. Можно привести еще много

данных о разностороннем влиянии пептидов на актив-

ность нейронов и на общее поведение животных [37],

подчас противоречивых, что зависит от различия в дозах,

способах применения, методах исследования. Вероятнее

149

всего, в наших опытах тонкий дифференцированный ана-

лиз разных клеточных популяций позволил выявить

разную реакцию отдельных классов пирамид в пределах

одного и того же слоя на ЦАЭ. С другой стороны, разно-

направленная реакция пирамид III слоя через 10 и 40 мин

после введения ЦАЭ может отражать смену возбуждаю-

щего и тормозного влияния ЦАЭ на активность корко-

вых нейронов и, как следствие смены этих физиологиче-

ских процессов, изменение мозаики метаболической ак-

тивности ансамблей пирамидных нейронов III и V слоев

двигательной коры.

Анализируя спектр изменений сухого веса нейронов

при выработке УРДИ на фоне действия ЦАЭ, следует

учитывать, таким образом, метаболический фон, на ко-

тором начинается (10 мин после введения ЦАЭ) и завер-

шается (40 мин после введения ЦАЭ) выработка услов-

ного рефлекса. Кроме того, необходимо вычленить мета-

болическую активность нейронов, вызванную процессом

фиксации временной связи, от реакции на несочетанные

раздражители. С этой целью изучали группу животных

«активного контроля» (несочетанное предъявление ус-

ловного и безусловного стимулов) — рис. 1,5. Необ-

ходимо также сопоставить «активный контроль» интакт-

ный и «активный контроль» с ЦАЭ. При анализе рис. 1, Б

и 4, Б видно, что ЦАЭ почти не изменил характер изме-

нений сухого веса пирамид III слоя, обусловленный

предъявлением несочетанных стимулов, вызвал некото-

рое перераспределение содержания белка между ядром

и цитоплазмой в интернейронах, и совсем другой эф-

фект ЦАЭ — в отношении пирамид V слоя. Если группа

активного контроля интактных животных характери-

зуется уменьшением (на 6,5%) сухого веса крупных и в

еще большей степени (на 7%) средних пирамид, то в

группе активного контроля + ЦАЭ сухой вес крупных

пирамид увеличился, средних — нормализовался (с тен-

денцией к увеличению).

Если рассматривать несочетанное предъявление тока

и света как стрессовую ситуацию, в большей степени

отразившуюся на пирамидных нейронах V слоя (сниже-

ние содержания белка), то можно предположить, что

в данной ситуации ЦАЭ уменьшил влияние стрессор-

ного фактора, способствуя сохранению нейронами нор-

мального уровня функционирования, о чем свидетель-

ствует умеренно повышенный по сравнению с пассивным

контролем уровень содержания белка.

150