Китайский В.Е. Патентование изобретений и полезных моделей

Подождите немного. Документ загружается.

4.7.3.

Изобретение, относящееся

штамму

микроорганизма

Описание изобретения, относящегося к биологическим объектам,

имеет характерные особенности как в названии изобретения, так и в

составлении структурных разделов.

В соответствии с п. 10.7.3 Регламента название изобретения в за-

висимости от вида биологического объекта имеет следующие особен-

ности:

— в название изобретения, относящегося к штамму микроорга-

низма, включаются родовое и видовое (в соответствии с требовани-

ями международной номенклатуры) названия биологического объек-

та на латинском языке и назначение штамма;

— в название изобретения, относящегося к линьи клеток расте-

ний или животных, включаются название линии клеток и назначение;

— в название изобретения, относящегося к генетической конст-

рукции, включается ее наименование с указанием назначения или оп-

ределяющей назначение биологической функции.

В соответствии с п. 10.7.4.2 Регламента в разделе описания «Уро-

вень техники» в качестве аналога изобретения, относящегося к штам-

му микроорганизма, линии клеток растений или животных, генети-

ческой конструкции, указываются известный штамм микроорганиз-

ма, линия клеток растений или животных, генетическая конструкция

с таким же назначением.

В разделе описания «Раскрытие изобретения» в соответствии с

п. 10.7.4.3 Регламента при раскрытии сущности изобретений, отно-

сящихся к штамму микроорганизма, линии клеток растений или жи-

вотных, если данные объекты депонированы и на это имеется указа-

ние в заявке, кроме их признаков необходимо дополнительно при-

вести название или аббревиатуру коллекции-депозитария,

уполномоченной на депонирование таких объектов, и регистрацион-

ный номер, присвоенный им коллекцией. Например: «Штамм

Рзеиёотопаз зШ&еп МЕУ-81 депонирован во Всероссийской коллек-

ции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером ВКПМ

В-8277».

Раскрытие сущности изобретений, относящихся к биологическим

объектам, осуществляется с помощью специфических признаков, ис-

пользуемых для характеристики штаммов микроорганизмов, линий

клеток растений или животных, консорциумов микроорганизмов,

клеток.

Так, для характеристики штаммов

микроорганизмов

используют-

ся,

в частности, следующие признаки:

— родовое и видовое название штамма (на латинском языке);

— происхождение (источник выделения, родословная);

— гено- и хемотаксономическая характеристики;

120

— морфологическая, физиологическая (в том числе культураль-

ая) характеристики;

— биотехнологическая характеристика (условия культивирова-

ния: название и свойства полезного вещества, продуцируемого штам-

мом; уровень активности (продуктивности);

— вирулентность, антигенная структура, серологические свойства

(для штаммов микроорганизмов медицинского и ветеринарного на-

значения);

— принцип гибридизации (для штаммов гибридных микроорга-

низмов).

Для

характеристики линий

клеток растений

или

животных допол-

нительно используются, в частности, следующие признаки:

— число пассажей;

— кариологическая характеристика;

— ростовые (кинетические) характеристики;

— характеристика культивирования в организме животного (для

гибридов);

— способность к морфогенезу (для клеток растений).

Для характеристики консорциумов микроорганизмов, клеток рас-

тений

или животных дополнительно к перечисленным выше призна-

кам используются, в частности, следующие признаки: фактор и ус-

ловия адаптации и селекции, таксономический состав, число и доми-

нирующие компоненты, заменяемость, тип и физиологические

особенности консорциума в целом.

Для характеристики генетических

конструкций

соответствующим

образом используются признаки устройств, предусмотренные

подп. (2) п. 10.7.4.3 Регламента (при этом конструктивными элемен-

тами могут являться энхансер, промотор, терминатор, инициирую-

щий кодон, линкер, фрагмент чужеродного гена, маркер, фланкиру-

ющие области).

Для характеристики трансформированной клетки используются,

в частности, следующие признаки:

— трансформирующий элемент;

— приобретаемые клеткой признаки (свойства);

— указание происхождения клетки (для прокариотической клет-

ки — род, семейство и (или) вид);

— таксономические признаки;

— мутация природного генома;

— условия культивирования клетки и иные характеристики, до-

статочные для того, чтобы отличить данную клетку от другой.

Для трансгенного растения используются, в частности, следующие

признаки:

— наличие модифицированного элемента в геноме;

— приобретаемые растением признаки (свойства);

121

— происхождение растения;

— таксономическая принадлежность и иные характеристики, до-

статочные для того, чтобы отличить данное растение от другого.

Для

трансгепного

животного используются, в частности, следую-

щие признаки:

— ген и (или) ДНК, трансформированные в геном животного и

кодирующие или экспрессирующие целевой продукт;

— приобретаемые животным признаки (свойства);

— продуцируемый животным модифицированный продукт;

— таксономическая принадлежность и иные характеристики, до-

статочные для того, чтобы отличить данное животное от другого.

Для подтверждения возможности осуществления изобретения, от-

носящегося к штамму микроорганизма, культуре клеток растений или

животных, необходимо подробно указать номенклатурные данные и

происхождение штамма, данные о количественном и качественном

составах питательных сред (посевной и ферментационной), условиях

культивирования (температура, рН, удельный массоперенос 0

, осве-

щенность и т. д.), времени ферментации, характеристике биосинтеза,

полезных продуктах, о выходе продукта, уровне активности (продук-

тивности) штамма и способах ее определения (тестирования). Надо

также раскрыть способ выделения и очистки целевых продуктов.

Для изобретения, относящегося к штамму микроорганизма, линии

клеток растений или животных либо к консорциумам штаммов, при-

водится описание способа получения штамма, линии клеток, консор-

циума. Если описания способа получения недостаточно для осуще-

ствления изобретения, представляются сведения о депонировании

штамма, линии клеток, консорциума или штаммов, входящих в кон-

сорциум (название или аббревиатура коллекции-депозитария, ее ад-

рес,

регистрационный номер, присвоенный коллекцией депонирован-

ному объекту), дата которого

не

должна быть более поздней, чем дата

подачи заявки или дата приоритета, если он испрашивался.

Описание способа получения штамма без представления сведений

о его депонировании, может быть признано достаточным для осуще-

ствления изобретения лишь в отношении штаммов, полученных с по-

мощью генно-инженерных методик, т. е. рекомбинантных штаммов,

которые могут быть сконструированы и осуществлены на основании

сведений, приведенных в описании. В иных случаях депонирование

штамма является обязательным.

Депонирование для целей патентной процедуры считается осуще-

ствленным, если штамм, линия клеток или консорциум помещены в

международный орган по депонированию, предусмотренный Буда-

пештским договором о международном признании депонирования

для целей патентной процедуры, или в уполномоченную на их депо-

нирование российскую коллекцию, гарантирующую поддержание

122

жизнеспособности объекта

течение по меньшей

мере

срока действия

патента и удовлетворяющую другим установленным требованиям к

коллекциям, осуществляющим депонирование для целей патентной

процедуры. Описывается пример использования штамма, линии или

консорциума

по

заявленному назначению

(с

указанием условий куль-

тивирования, выделения и очистки целевого продукта, выхода про-

дукта, уровня активности (продуктивности) продукта или продуцента

и способах ее определения (тестирования) и т. д.).

Для изобретения, относящегося к генетической конструкции, при-

водится сведения о ее конструктивном выполнении, способе получе-

ния

данные,

подтверждающие возможность реализации указанного

назначения или биологической функции, определяющей назначение.

Если признак генетической конструкции в формуле изобретения

охарактеризован с использованием общего понятия, подтверждает-

ся возможность получения ряда генетических конструкций с реали-

зацией указанного назначения или биологической функции, опреде-

ляющей назначение.

Для консорциумов микроорганизмов и клеток растений и живот-

ных указываются следующие данные: метод проверки наличия ком-

понентов; метод выделения (селекции) и признаки, по которым ве-

лась

селекция;

стабильность консорциума как такового

при

длитель-

ном культивировании; устойчивость к заражению посторонними

микроорганизмами.

Приведем

пример описания изобретения — штамма

по патенту

Рос-

сийской Федерации № 2228952 патентообладателя — Научно-иссле-

довательского центра токсикологии и генетической регламентации

биопрепаратов.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

С^

1/20, С02Р 3/34,

В09С 1/10, С12Ы 1/20

ШТАММ БАКТЕРИЙ Р5Е1ЮОМОЫА5 ЗТУТ2ЕК1 МЕУ-51,

ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВ,

ГРУНТОВЫХ И ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОД

ОТ НЕФТИ И ПРОДУКТОВ ЕЕ ПЕРЕРАБОТКИ

Изобретение относится

к области микробиологии и представляет собой

новый бактериальный штамм, который может быть использован для очист-

ки почвы, грунтовых и поверхностных вод при попадании в окружающую

среду нефти и продуктов ее переработки.

Загрязнение окружающей среды нефтью, продуктами ее переработки

представляет серьезную угрозу здоровью населения и природе. Тяжелые

Фракции нефти, токсичные и наиболее трудно разлагаемые, содержат поли-

чиклические ароматические углеводороды (ПАУ). ПАУ относятся к катего-

рии приоритетных загрязнителей окружающей среды.

123

Известны штаммы микроорганизмов: Рзеийотопаз а1саП§епе$ Е7 [1],

ТпсЬоёегта

Н^погит

Л-1 ГКМ ВИЗР № 103 [2], Рзеиёотопаз а1саИ§епез В-1

[3],

МусоЬас1епит Пауезсепз ЕХ-91 [4], КЬоо'ососсиз зреаез 56Б [5],

Рзеиботопаз риййа 9

[6],

КЬоо'ососсиз зреаез МРИ

[7],

которые могут разла-

гать углеводороды нефти, в том числе и ПАУ, в почве и воде. Недостатком

перечисленных штаммов является то, что они осуществляют деструкцию по-

лициклических ароматических углеводородов, содержащих только два и три

бензольных кольца.

Наиболее близким

предлагаемому изобретению является

штамм бактерий

Рзеиёотопаз акаН^епез Е7

[1],

обладающий высокими характеристиками по

биодеградации нефти и нефтепродуктов. Однако недостатком этого штам-

ма является то, что из полициклических ароматических углеводородов он

утилизирует только нафталин при температуре 20—30 °С.

Цель изобретения состоит

в получении нового штамма микроорганизмов,

быстро и эффективно утилизирующего т зки в почвах, грунтовых и поверх-

ностных водах нефть и продукты ее переработки при комбинированном заг-

рязнении солями тяжелых металлов, а также продуцирующего внеклеточные

биологические поверхностно-активные вещества (биосурфактанты), которые

ускоряют биодеградацию малорастворимых гидрофобных ПАУ.

Предлагаемый штамм Рзеиёотопаз зШ1геп МЕУ-51 выделен из ризосферы

пшеницы и селекционирован путем пересевов отдельных колоний бактерий на

чашках с минимальным агаром А

[8],

который содержит

(г/дм

Ыа

НР0

Н?0

—6,0;

КН

Р0

—3,0;

ЫаС1—0,5;

ЫН

С1 —

1,0;

Мё

-7Н

0—0,3;

СаС1

-2Н

—

0,01;

Агар-агар — 15,0. Вода дистиллированная—до

дм

; рН — 7,2 в при-

сутствии фенантрена в количестве 300 мг на

дм

питательной среды.

Штамм Рзеиёотопаз з1и1геп МЕУ-81 идентифицирован в соответствии с

определителем Берга [9] и депонирован во Всероссийской коллекции про-

мышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером ВКПМ В-8277.

Предлагаемый штамм характеризуется следующими морфологическими и

физиолого-биохимическими признаками. Грамотрицательные подвижные

палочки размером

2—3

•

0,8

мкм

спор

не

образуют. На агаризованной питатель-

ной среде

из

кислотного гидролизата рыбной муки на вторые

сутки

образуются

плоские матовые колонии диаметром 2—3 мм.

бульоне из кислотного гид-

ролизата рыбной муки растет в виде пленки и равномерного помутнения.

Штамм является аэробом, обладает оксидазной и каталазной активностью,

растет в температурном диапазоне от 8 до

°С,

оптимум —28

°С.

В качестве

источника углерода потребляет глюкозу и Ь-валин. Трегалозу, 2-кетоглюко-

нат, мезо-инозит, гераниол, Р-аланин, ОЬ-арнинин не потребляет. Использу-

ет нитраты в качестве источника азота. Аргининдигидролазной активностью

не обладает. Осуществляет денитрификацию. Гидролизует крахмал, желатин

и поли-Р-оксибутират не гидролизует. Обладает лецитиназной активностью.

Прототроф в дополнительных факторах роста не нуждается.

Штамм не патогенен (не вирулентен, не токсичен, токсигенностью не об-

ладает). На штамм оформлено заключение о безопасности.

Генетические особенности: культура устойчива к стрептомицину —

100 мкг/см

, канамицину — 20 мкг/см

; штамм устойчив к ионам тяжелых ме-

таллов: РЬ, 2п, Мо, Ре — 100 мг/дм

, Н§ — 8 мг/ дм

124

Культура использует

качестве единственного источника углерода нефть,

нефтепродукты, полициклические ароматические углеводороды, содержащие

два. три и четыре бензольных кольца (нафталин, фенантрен, пирен, флуорен),

а также фенол (табл. 3).

Штамм продуцирует биологические поверхностно-активные вещества

(биосурфактанты). Штамм хорошо растет на богатых питательных средах на

основе мясопептонного бульона и ферментативного гидролизата рыбной

м\ки.

Условия хранения:

лиофилизированном состоянии при 4 °С — три года;

на агаризованном ферментативном гидролизате рыбной муки при 4°С

—

две

недели, в пробирках на скошенном агаре под стерильным вазелиновым мас-

лом при 4 °С — до года. Штамм может поддерживаться регулярными пере-

севами (один раз в две недели) на агаризованном ферментативном гидроли-

зате рыбной муки с 300 мг/дм

фенантрена.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Штамм бактерий Рзеидотопаз з1и1геп МЕУ-81 выращивают

аэробно в жидкой среде на ферментативном гидролизате рыбной муки с

300 мг/дм

фенантрена на качалке при 200 об/мин и температуре 28±2 °С

те-

чение 18 ч. Титр выросшей культуры составляет

1,2-10*

колониеобразующих

единиц (КОЕ) на

см

питательной среды.

Пример

Штамм Рзеидотопаз з1и1геп МЕУ-81 выращивают на синтети-

ческой среде следующего состава, г/дм

: (НН

)

НР0

— 0,5; КН

ГО

— 0,7;

№С1 — 0,5; М§80

-7Н

0 — 0,8; дистиллированная вода — до

дм

; рН —

7,2. Нефть, мазут, дизельное топливо добавляют в синтетическую среду в ко-

личестве

% от массы питательной среды в качестве единственного источ-

ника углерода. Опыт проводят четыре раза. В колбы объемом 100 см

вно-

сят по 30 см

минеральной среды и по 300 мг нефти, мазута и дизельного топ-

лива. Колбы засевают клетками штамма Рзеиёошопаз з1и1геп МЕУ-81 до

концентрации 110

КОЕ/см

. В качестве контрольных используют незасеян-

ные колбы со средой, а также с нефтью и нефтепродуктами. Культивирова-

ние проводят на качалке при 200 об/мин и

°С течение

суток. Эффектив-

ность биодеградации определяют на газожидкостном хроматографе. Резуль-

таты эксперимента представлены в табл. 1. Полученные результаты

показывают, что в течение пяти суток при 30 °С штамм МЕУ утилизирует

нефть, мазут и дизельное на 77,2, 56,5 и 89,1 % соответственно.

Таблица 1

Биодеградация

нефти

продуктов

ее

переработки

при

температуре 30 °С

штаммом Рзеиаошопаз з1и1геп

МЕУ-81

течение пяти суток

Вещество

Нефть

Мазут

М-40

Дизельное топливо

Биодеградация,

{М ±

т)

77,2 ±5,8

56,5

±4,2

89,1 ±6,2

Примечание. М — среднее четырех опытов; т — доверительный интер-

вал с вероятностью 95 %.

125

Пример 3. Предлагаемый штамм культивируют так же, как в примере 2.

Однако культивирование проводят при 20 °С. Результаты представлены в

табл. 2.

Таблица 2

Биодеградация нефти

продуктов

ее

переработки

при

температуре 20 °С

штаммом Рзеийотопаз

з1и1геп МЕУ-81

течение

пяти

суток

Вещество

Нефть

Мазут

М-40

Дизельное топливо

Биодеградация,

(М

± т)

56,4 ±3,1

42,1 ±3,2

68,3 ±5,1

Примечание. М — среднее четырех опытов; т — доверительный интер-

вал с вероятностью 95 %.

Пример 4. В колбы на 100 см

вносят по 30 см

минеральной среды (со-

став среды указан в примере 2) и по 200 мг нафталина, фенантрена, пирена,

флуорена, фенола. Колбы засевают культурой Рзеиёотопаз з1и12еп МЕУ-81

до концентрации 1-10

КОЕ/см

. В качестве контрольных используют неза-

сеянные колбы со средой, а также с изучаемыми веществами. Культивирова-

ние проводят на качалке при 200 об/мин, температуре 20 °С в течение пяти

суток. Эффективность биодеградации определяют на газожидкостном хро-

матографе. Результаты экспериментов показывают, что за пять дней биоде-

градация нафталина и фенантрена прошла на 100 %, а пирена, флуорена

фе-

нола на 48,4, 58,9 и 53,3 % соответственно (табл. 3).

Таблица 3

Биодеградация полициклических ароматических углеводородов

фенола

штаммом Р$еиаотопа8 зМ/еп

МЕУ-81

при 20 °С в

течение пяти суток

Вещество

Нафталин

Фенантрен

Пирен

Флуорен

Фенол

Число бензольных колец в молекуле

Биодеградация,

%{И±т)

100

48,4 ±3,4

58,9

4,3

53,3

4,2

Пример 5. В колбы на 100 см вносят по 30 см

синтетической среды (со-

став среды указан в примере 2), 300 мг нефти,

мг/дм

солей РЬ, 2п, Мо, Ре,

50 мкг/дм

Сг и клетки штамма Рзеи^отопаз з1и1геп МЕУ-81 до концентра-

ции 1-Ю

КОЕ/см

. Контрольной служит засеянная колба с нефтью. Культи-

вирование проводят четыре раза на качалке при 28 °С и 200 об/мин в тече-

ние пяти

дней.

Результаты эксперимента показывают, что эффективность дег-

радации нефти предлагаемым штаммом в вариантах с солями металлов и без

них не отличается (табл. 4).

126

Таблица 4

Биодеградация

нефти

присутствии тяжелых металлов

штаммом

Рвешкипопаз зМгеп МЕУ-81

Вещество

Нефть

Биодеградация,

(М ±

т)

с металлами

76,0

± 5,6

без металлов

77,2 ±5,8

Примечание. М — среднее четырех опытов; т — доверительный интер-

вал с вероятностью 95 %.

Пример 6. Культуральную жидкость штамма Рзеиёотопаз зШ1геп МЕУ-

31,

выращенного как в примере 1, отделяют от микробных клеток центрифу-

гированием при 5000 об/мин в течение 10 мин. В качестве биосурфактантсо-

держащей жидкости в опыте используется культуральная жидкость, разведен-

ная дистиллированной водой в 10 раз. Поверхностное натяжение этой

жидкости определяют с использованием кольцевого тензиометра. Контролем

служит дистиллированная вода. Результаты определения поверхностного на-

тяжения (табл. 5) показывают, что добавление культуральной среды

дистил-

лированную воду приводит к снижению поверхностного натяжения дистил-

лированной воды с 61,2 до 35,8 дин/см. Добавление питательной среды в та-

ком

же

соотношении (1:10) не оказывает влияния на поверхностное натяжение

дистиллированной воды. Таким образом, культуральная жидкость предлага-

емого штамма содержит биологические поверхностно-активные вещества.

Таблица 5

Влияние

биосурфактантобразующей культуральной

жидкости

штамма Рзеиёотопаз

зМгеп

МЕУ-81

на

поверхностное

натяжение дистиллированной воды

Исследуемая жидкость

Дистиллированная вода

Биосурфактантсодержащая жидкость

Дистиллированная вода

питательная среда

Поверхностное

натяжение,

дин/см (М

т)

61,2 ±3,1

35,8

2,9

58,3 ±3,9

Примечание. М — среднее четырех опытов; т — доверительный интер-

вал с вероятностью

Пример 7. В колбы на 100 см

вносят по 27 см

минеральной среды (со-

став среды указан в примере 2) и смесь, содержащую по 200 мг нафталина,

фенантрена, пирена, флуорена. В колбы добавляют по 3 см

биосурфактант-

содержащей культуральной среды, как в примере 6. Колбы засевают культу-

рой Рзеиёотопаз зШггеп МЕУ-81 до концентрации

1 •

КОЕ/см

качестве

контрольных используют колбы со смесью нафталина, фенантрена, пирена

и флуорена. Культивирование проводят на качалке при 200 об/мин, темпе-

ратуре 20 °С в течение пяти суток. Эффективность биодеградации полицик-

лических ароматических углеводородов определяют на газожидкостном хро-

матографе. Результаты экспериментов (табл. 6) показывают, что добавление

бносурфактанта повышает эффективность биодеградации ПАУ. Так, за пять

127

суток в вариантах опыта с добавлением биосурфактанта биодеградация на-

фталина и фенантрена прошла на 100 %, а пирена и флуорена на 56,0 и 72,4 %

соответственно.

Таблица 6

Биодеградация полициклических ароматических углеводородов

штаммом Рзеиаошопаз зМгеп МЕУ-81

при

добавлении биосурфактанта

Вещество

Нафталин

Фенантрен

Пирен

Флуорен

Число

бензольных

колец в молекуле

Биодеградация,

%{М±т)

Биосурфактант

добавлен

100

56,0

±5,5

72,4

± 5,9

Без

биосурфактанта

66,3 ±4,8

61,3 ±4,6

40,5

3,8

58,2 ±4,4

Примечание. М — среднее четырех опытов; т — доверительный интер-

вал с вероятностью

Пример 8. В эксикаторы объемом 3 дм

с 2 кг дерново-подзолистой по-

чвы вносят

% по массе нефти, мазута, дизельного топлива и тщательно пе-

ремешивают.

Суспензию бактерий штамма Р$еис1отопа$ зШгеп МЕУ-81 разводят фос-

фатным буферным раствором рН 7,2 и вносят в почву, загрязненную ксено-

биотиками из расчета НО

КОЕ на

г почвы. Почву тщательно перемеши-

вают, увлажняют до 60 % от общей влагоемкости и экспонируют при 20 °С

в течение двух месяцев. Для анализа образцы почвы отбирают в момент на-

чала эксперимента и через два месяца. Эффективность биодеградации нефти

и продуктов ее переработки предлагаемым штаммом в почве оценивают ме-

тодом газожидкостной хроматографии. Результаты исследований показыва-

ют, что предлагаемый штамм в течение двух месяцев при температуре 20 °С

осуществляет деградацию 60,6 % нефти, 51,4 % мазута и 68,3 % дизельного

топлива (табл. 7).

Таблица 7

Биодеградация нефти и продуктов ее переработки

почве при температуре 20 °С

штаммом Рзеиаотогш $Шгеп МЕУ-81

течение двух месяцев

Вещество

Нефть

Мазут

М-40

Дизельное

топливо

Биодеградация,

(М1

т)

60,6

± 5,9

51,4

±4,7

68,

± 6,8

Примечание. М — среднее четырех опытов; т — доверительный интер-

вал с вероятностью 95 %.

Пример 9. Предлагаемый штамм вносят в почву так же, как в приме-

ре 8. Однако эксперимент проводят при 30 °С. Результаты представлены в

табл. 8.

128

Таблица 8

Биодеградация нефти

продуктов

ее

переработки

почве при температуре

°С

штаммом РзеиЛошопаз §1и1геп

МЕУ-81

течение двух

месяцев

Вещество

Нефть

Мазут

М-40

Дизельное топливо

Биодеградация,

(Л/1 ш)

68,9 ±5,7

58,4 ±4,6

94,3 ±7,1

Примечание. М — среднее четырех опытов; т — доверительный интер-

вал с вероятностью 95 %.

Пример

10.

В эксикаторы объемом 3 дм

с 2 кг дерново-подзолистой по-

чвы вносят

% по массе смеси нафталина (4 г), фенантрена (4 г), пирена (4 г),

флуорена (4 г), фенола (4 г) и тщательно перемешивают. Суспензию бакте-

рий штамма Рзеиёотопаз зИКгеп

МЕУ-81,

полученную как в примере 1, раз-

водят фосфатным буферным раствором с рН 7,2 до титра 110

КОЕ/см

вносят в почву, загрязненную ксенобиотиками из расчета 1-Ю

КОЕ на 1 г

почвы. Почву тщательно перемешивают, увлажняют до 60 % от общей вла-

гоемкости и экспонируют при 20 °С в течение двух месяцев. Для анализа об-

разцы почвы отбирают в начале эксперимента и через два месяца. Эффектив-

ность биодеградации ПАУ и фенола предлагаемым штаммом в почве оцени-

вают методом газожидкостной хроматографии. Результаты исследований

показывают, что предлагаемый штамм в течение двух месяцев при темпера-

туре

20 °С

осуществляет деградацию

100 %

нафталина и фенантрена,

59%

флу-

орена, 52% пирена и 56 % фенола (табл. 9).

Таблица 9

Биодеградация полициклических ароматических углеводородов и фенола

почве

штаммом Рзешкншмш зМгеп

МЕУ-81

при 20 °С

Вещество

Нафталин

Фенантрен

Пирен

Флуорен

Фенол

Число бензольных колец в молекуле

Биодеградация,

(И

т)

100

52,4

4,3

59,1 ±4,9

56,3 ±4,6

Примечание. М — среднее четырех опытов; т — доверительный интер-

вал с вероятностью

Пример

11.

В эксикаторы объемом 3 дм

с 2 кг дерново-подзолистой по-

чвы вносят 20 г нефти и

мг/кг почвы солей РЬ, 2п, Мо, Ре, 50 мкг/кг Сг и

клетки штамма Рзеиёотопаз зШггеп МЕУ-51 до концентрации 1-Ю

КОЕ/г

почвы. Почву тщательно перемешивают, увлажняют до 60 % от общей вла-

гоемкое™ и экспонируют при

°С в течение двух месяцев. Для анализа об-

разцы почвы отбирают в начале эксперимента и через два месяца. Эффек-

129