Герасименко В.Г., Герасименко М.О., Цвіліховський М.І. та ін. Біотехнологія

Подождите немного. Документ загружается.

у функціонально активні структури з набору індивідуальних

компонентів (білків і рРНК), отриманих при дисоціації субча

стин, шляхом самозбірки цих макромолекул; для мимовільного

утворення 50Sсубчастин необхідна присутність у системі в зі

браному вигляді 30Sсубчастини.

Висловлюється думка (Ленинджер А., 1985), що рРНК ви

конують роль каркасів для упорядкованого розташування рибо

сомних поліпептидів, ферментативні й інші специфічні функції

яких поки що не встановлені для всіх білків. За даними рентге

ноструктурного аналізу й електронної мікроскопії, субчастини

в рибосомі розташовані несиметрично, мають неправильну гео

метричну форму і з’єднані один з одним таким чином, що між

ними залишається борозна, через яку проходить молекула

іРНК у процесі синтезу поліпептидного ланцюга, а також друга

борозна, що утримує зростаючий поліпептидний ланцюг. У пер

шій борозні розміщується 35 нуклеотидів РНК, а в другій —

приблизно 30 амінокислот. Рибосоми мітохондрій і хлоропла

стів відрізняються від цитоплазматичних рибосом еукаріот; во

ни мають більшу подібність з 70Sчастками прокаріотичних ор

ганізмів.

Синтез білків у мітохондріях, хлоропластах і бактеріях про

ходить за загальною схемою (Ленинджер А., 1985; Страйер Л.,

1985; Албертс Б. та ін., 1986).

Ініціація поліпептидного ланцюга. Було встано

влено, що в Е.соlі й інших прокаріот Nкінцевою амінокислотою

при збірці поліпептидного ланцюга завжди є залишок Nформіл

метіоніну. Цей та інший факти стали підставою для припущен

ня про значення формільованого метіоніну як ініціатора в про

цесі синтезу поліпептидного ланцюга. Формільований метіонін

одержується в результаті двох послідовних реакцій. При цьому

варто вказати на існування двох тРНК: тРНК

Met

і тРНК

fMet

, що

здійснюють акцепцію метіоніну, а також звернути увагу на те,

що фермент формілтрансфераза (трансформілаза) не спромож

ний формілювати метіонін, що знаходиться у вільному стані.

Однак і в комплексі з тРНК не завжди можливе формілювання

залишку метіоніну. Ця реакція можлива тільки в тому випадку,

коли тРНК виявляється специфічною тРНК

fMet

ЧастинаI.Заальнабіотехнолоія

Комплекс метіоніну з іншою тРНК — метіонілтРНК

(тРНК

Met

) не формілюється і використовується для включення

метіоніну у внутрішні ділянки синтезованого поліпептидного

ланцюга. Хоча первинна структура тРНК

fMet

і тРНК

Met

різна,

загальним для них є наявність того самого антикодону UАС,

завдяки чому обидві тРНК здатні взаємодіяти з кодоном АUG.

Однак антикодоновий триплет комплексу фМет — тРНК

fMet

взаємодіє з кодоном AUG тільки в тому випадку, якщо той

розташований на початку кодуючої послідовності іРНК. Розта

шування кодону AUG усередині нуклеотидної послідовності

іРНК передбачає взаємодію з ним неформільованого Мет

тРНК

Met

. Наявність Nформільної групи в залишку метіоніну в

складі ініціаторного комплексу фМеттРНК

fMet

обумовлює

взаємодію останнього з особливим місцем ініціації на рибосомі,

з яким не вступає в реакцію ні МеттРНК

Met

, ні жодна інша амі

ноацилтРНК; блокування аміногрупи метіоніну формільним

залишком перешкоджає включенню такої амінокислоти у вну

трішні ділянки поліпептидного ланцюга.

У поліпептидних ланцюгах, синтезованих у рибосомах

еукаріотичних клітин, Nкінцевою амінокислотою завжди є

Розділ3.Основимолелярноїбіолоії

метіонін, що приєднується за допомогою спеціальної ініціюючої

метіонілтРНК; у мітохондріях і хлоропластах еукаріот так са

мо, як і в бактеріях, синтез білка починається з Nформілметіо

ніну, що підтверджує висловлену точку зору про походження

цих субклітинних структур, які знаходяться в клітинах еука

ріот, від бактерій.

На етапі ініціації поліпептидного ланцюга істотним момен

том є тристадійний процес утворення ініціюючого комплексу

(рис. 3.8). Спочатку в результаті взаємодії 30Sсубчастини і

фактора ініціації ІF3 утворюється структура, у якій білок ІF3

перешкоджає її асоціації з 50Sсубчастиною. Приєднання до

30Sсубчастини іРНК досягається за допомогою особливого іні

ціюючого сигналу, що являє собою багату пуриновими основа

ми (А, G) послідовність, центр якої знаходиться на відстані при

близно 10 нуклеотидів від 5

′кінця ініціюючого кодона (5′)

АUG(3

′) іРНК, тож трансляція не може розпочатися безпосе

редньо на 5

′кінці іРНК. Перший трансльований кодон, як пра

вило, розташовується на відстані майже 25 нуклеотидів від

′кінця. Ініціюючий сигнал, представлений короткою ділян

кою (6–10 нуклеотидів) іРНК, у результаті взаємодії з компле

ментарною послідовністю нуклеотидів, розміщених із 3

′кінця

16SРНК 30Sсубчастини, сприяє фіксуванню іРНК у потріб

ному для ініціації положенні. Завдяки цій взаємодії забезпечу

ється правильне розташування ініціюючого кодону AUG на

30S субчастині. Потім до комплексу, що складається із 30S

субчастини, фактора ІF3 і іРНК, приєднуються раніше зв’язані

з формілметіонілтРНК

fMet

білковий фактор ініціації ІF2 і ГТФ

(2а стадія). У результаті подальшого приєднання до 50Sрибо

сомної субчастини раніше виниклої макромолекулярної ком

плексної структури, що складається з 30Sсубчастини, білково

го фактора ініціації ІF3, іРНК, ГТФ, білкового фактора

ініціації ІF2, NформілметіонілтРНК

fMet

, виникає функціо

нально активна 70Sрибосома. При її утворенні на стадії приєд

нання 50Sсубчастини молекула ГТФ, яка зв’язана з ІF2, гідро

лізується до ГДФ і Фн, які разом з ІF3 і ІF2 утворюють

комплекс. Таким чином, точне місце початку синтезу білка (ко

дон АUG, генетичний сигнал ініціації) визначається в результа

ті спарювання лідерної послідовності азотистих основ з боку

ЧастинаI.Заальнабіотехнолоія

Розділ3.Основимолелярноїбіолоії

Рис. 3.8. Схема тристадійного процесу утворення ініціюючого

комплексу

(за Ленінджером А., 1985)

5’кінця кодона АUG iРНК із нуклеотидною послідовністю, що

розташовується з 3

′кінця 16SрРНК 30Sсубчастини, а також

комплементарною взаємодією кодона АUG іРНК з антикодо

ном (3

′)UАС(5’) NформілметіонілтРНК

fMet

Для надання правильного положення у функціонально ак

тивному ініціюючому 70Sкомплексі Nформілметіоніл

тРНК

fMet

останній приєднується до пептидильної ділянки

(Рділянки) 70Sкомплексу; друга ділянка для приєднання амі

ноацилтРНК називається аміноацильною (Аділянка). Утво

рюються вони за рахунок сполучення специфічних ділянок

30S і 50Sсубодиниць. У такому стані (Рділянка зайнята іні

ціюючою фМеттРНК

fMet

, Аділянка — вільна) ініціюючий ком

плекс готовий до продовження процесу трансляції.

Елонгація. Елонгація синтезу поліпептидного ланцюга є

циклічним процесом, що включає три стадії. Цикл починається

взаємодією ГТФ з одним із трьох факторів елонгації — Тu, що є

розчинними білками цитоплазми. АміноацилтРНК, антикодон

якої комплементарний наступному за ініціюючим кодоном у

напрямку 5

′–3′ іРНК, взаємодіючи з ГТФТu утворює потрій

ний комплекс аміноацилтРНК — Тu — ГТФ, що за допомогою

активованого фактора елонгації (Тu — ГТФ) вводиться у вільну

Аділянку функціонально активної 70Sрибосоми і зв’язується

з цією ділянкою. Правильність положення аміноацилтРНК

контролюється двічі (рис. 3.9). З одного боку, це комплементар

на кодонантикодонова взаємодія, з іншого — специфічний

ЧастинаI.Заальнабіотехнолоія

Рис. 3.9. Схема першої стадії елонгації

(за Ленінджером А., 1985)

зв’язок між ділянками молекул тРНК і рРНК. Тільки при дот

риманні цієї умови процес елонгації може продовжитися.

Наступна реакція — гідроліз ГТФ і елімінація з 70Sрибосо

ми Тu — ГДФкомплексу. Залишок ГДФ з останнього витіс

няється іншим фактором елонгації Тs. Новий комплекс ТuТs

розпадається під впливом ГТФ, а ГТФТu, що утворюється,

знову доставляє комплементарну аміноацилтРНК в Аділянку,

що звільнилася, 70Sрибосоми. ГТФTu не вступає в реакцію з

фМеттРНК

fMet

, у зв’язку з чим вона не потрапляє в Аділянку і

внутрішні кодони АUG не зчитуються з ініціюючої тРНК. До

моменту початку другої стадії циклу елонгації Рділянка вия

вляється зайнята фМеттРНК

fMet

, а в Аділянці розташовується

відповідна аміноацилтРНК. Усе підготовлено для вступу за

лишків амінокислот у реакцію й утворення пептидного зв’язку

(рис. 3.10).

Цю реакцію каталізує пептидилтрансфераза, що є одним з

білків 50Sсубодиниць, активність якої реалізується в присут

ності К

. Активований залишок формілметіоніну, що знахо

диться у складі фМеттРНК

fMet

і розташований у Рділянці,

Розділ3.Основимолелярноїбіолоії

Рис. 3.10. Схема утворення пептидного зв'язку

(за Ленінджером А., 1985)

переноситься на аміногрупу аміноацилтРНК, що займає Аді

лянку. Нова сполука, що виникла внаслідок цієї реакції (діпеп

тидилтРНК), включає залишки двох амінокислот, з’єднаних

пептидним зв’язком, і розташовується в Аділянці 70Sрибосо

ми; у Рділянці залишається звільнена від активованого аміно

кислотного залишку ініціююча тРНК

fMet

Третя стадія елонгації — транслокація — пов’язана з трьома

переміщеннями (рис. 3.11). У зв’язку з переміщенням 70Sрибо

соми на відстань в один кодон уздовж іРНК у напрямку її

′кінця; діпептидилтРНК, що знаходиться в Аділянці, пере

міщується в Рділянку, завдяки чому вільна тРНК відокремлю

ється від Рділянки й надходить до цитоплазми. Таким чином, у

пептидильній ділянці виявляється діпептидилтРНК, а аміно

ацильна ділянка знову підготовлена для зв’язування чергової

аміноацилтРНК, антикодон якої комплементарний наступно

му кодону іРНК, що знаходиться в зоні аміноацильної ділянки

70Sрибосоми.

Починається новий тристадійний цикл елонгації, у резуль

таті завершення якого буде утворена трипептидилтРНК. Пере

міщення рибосоми уздовж іРНК на один кодон називається

ЧастинаI.Заальнабіотехнолоія

Рис. 3.11. Схема транслокації

(за Ленінджером А., 1985)

транслокацією. Пересування здійснюється за участю третього

фактора елонгації G, чи транслокази, і енергії, що утвориться

при гідролізі ще однієї молекули ГТФ. На утворення однопеп

тидного зв’язку (приєднання однієї амінокислоти) витрачаєть

ся енергія гідролізу двох молекул ГТФ.

Термінація. У синтезі поліпептидного ланцюга настає

момент, коли Аділянка рибосоми зайнята одним з кодонів

UАА, UGА чи UАG. У цьому випадку кодонантикодонової

взаємодії не відбувається, тому що нормальні клітини не

містять тРНК з антикодонами, комплементарними сигналам

термінації. Термінуючі триплети не кодують амінокислот і на

зиваються в зв’язку з цим безглуздими кодонами.

З високою специфічністю термінуючі триплетні послідовно

сті іРНК вступають у взаємодію з білковими факторами звіль

нення R

, R

i S (рилізингфакторами); перший з них розпізнає

кодон UАА чи UAG, другий — UАА чи UGА. Взаємодія одного

з рилізингфакторів з термінуючим кодоном в місці розташуван

ня аміноацильної ділянки 70Sрибосоми активує пептидилтран

сферазу і змінює її специфічність, у результаті чого настає гідро

літичне відщеплення поліпептиду від поліпептидилтРНК,

акцепція активованим пептидильним залишком Н

О і вивіль

нення знову синтезованої білкової молекули, відділення від

Рділянки, що звільнилася, тРНК, дисоціація 70Sрибосоми на

30S і 50Sсубодиниці і їхня підготовка до синтезу нової білко

вої молекули (Ленинджер А, 1985; Страйер Л., 1985).

На одній молекулі іРНК одночасно можуть знаходитися де

кілька функціонально активних рибосом; при цьому одна рибо

сома на іРНК займає місце, еквівалентне 80 нуклеотидам. Зав

дяки такій можливості ефективність використання іРНК

значно збільшується. Кілька рибосом, що одночасно знаходять

ся на одній і тій самій іРНК, формують полірибосомну структу

ру чи полісому, у складі якої кожна з рибосом функціонує авто

номно і синтезує свій поліпептидний ланцюг.

Упаковка і процесинг поліпептидного ланцюга.

Первинна структура (послідовність амінокислот) є визначаль

ним моментом у формуванні тривимірної структури, завдяки

якій білок стає функціонально активним. Однак нерідко білко

ва молекула набуває біологічно активної конформації тільки в

Розділ3.Основимолелярноїбіолоії

ЧастинаI.Заальнабіотехнолоія

результаті процесингу чи ковалентної (посттрансляційної)

модифікації, що проходить у різних білків порізному і включає

реакції видалення чи приєднання атомних груп. Так, формільна

група, що входить до складу Nкінцевого Nформілметіоніну, у

білків бактеріального походження в ході процесингу деформі

люється. Під дією особливих амінопептидаз відбувається гідро

літичне відщеплення одного чи декількох Nкінцевих аміноки

слотних залишків, у зв’язку з чим у багатьох остаточно

сформованих білках їх не вдається знайти. У процесі посттран

сляційного дозрівання відщеплюються поліпептидні Nкінцеві

лідерні послідовності, що виконують роль специфічних сигна

лів, за допомогою яких білок досягає місця свого призначення.

Дуже часто Nкінець поліпептидного ланцюга піддається моди

фікаційним змінам ще тоді, коли синтез решти поліпептидного

ланцюга продовжується.

З інших найбільш розповсюджених реакцій, за участю яких

відбувається модифікація поліпептидної структури і тим самим

здійснюється вплив на формування її остаточної конформації,

варто назвати ацетилювання аміногрупи Nкінцевої аміноки

слоти, фосфорилювання НОгруп залишків оксіамінокислот

(серину, треоніну, тирозину), що призводить до збільшення не

гативного заряду відповідних білків, карбоксилювання залиш

ків аспарагінової і глутамінової кислот, метилювання залишків

лізину і карбоксильних груп деяких залишків глутамінової

кислоти, приєднання бічних вуглеводних ланцюгів, додавання

простетичних груп, а також утворення дисульфідних містків.

3.2.3. Регуляція синтезу білка

Здатність бактерій швидко пристосовуватися до умов, що

змінюються, і ощадливо використовувати різноманітні поживні

речовини досягається контролем білкового синтезу на рівні

транскрипції за рахунок зміни швидкості утворення іРНК.

Інший шлях регуляції швидкості протеїносинтезу здійснюється

на рівні трансляції. Механізм його вивчений недостатньо і для

бактерій він має другорядне значення.

У клітинах еукаріот провідну роль відіграє контроль біо

синтезу білка на рівні трансляції. За рахунок регуляції швидко

сті синтезу ферментів у клітині створюється таке співвідношен

ня їхніх концентрацій, яке забезпечує оптимальний рівень мета

болізму, адекватний умовам навколишнього середовища. При

цьому варто враховувати ту обставину, що деякі ферменти не

залежно від напруги метаболізму містяться в клітинах бактерій

у постійній концентрації (конститутивні ферменти); кількість

інших, залежно від умов, змінюється в тисячу і більше разів (ін

дуковані ферменти).

У першому випадку як приклад можна назвати ферменти

гліколізу, у другому — βгалактозидазу, що здійснює гідролі

тичне розщеплення лактози на глюкозу і галактозу.

Молекулярні і генетичні механізми регуляції швидкості

білкового синтезу в прокаріот були розроблені Жакобом Ф. та

Моно Ж. (1961–1964) і сформульовані в гіпотезі оперона, що

одержала повне підтвердження в результаті прямих біохімічних

досліджень. Було виявлено, що клітини E.соlі у середовищі, що

містить замість глюкози лактозу, починають синтезувати у ве

ликих кількостях, які перевищують первинний вміст більш ніж

у 10

разів, βгалактозидазу і два інших зв’язаних з нею функ

ціонально ферменти — βгалактозидпермеазу і білок А. Лактоза

в даному процесі виступає як індуктор, а сам процес має назву

координованої індукції.

Для пояснення механізму дії індуктора Жакоб Ф. Та

Моно Ж. запропонували схему (рис. 3.12). На ній три структур

них гени (lacгени) z, у і a та ланцюг ДНК, що їм передує, вклю

чає дві регуляторні ділянки — промотор (р) і оператор (о), а та

кож регуляторний ген і, який кодує білокрепресор, розташовані

поруч. Ці гени були названі опероном. Крім lасоперона у бакте

рій ідентифіковані й інші, переважаючі за складністю лактозний.

Так, hisоперон кодує дев’ять ферментів, необхідних для біосин

тезу амінокислоти гістидину.

Транскрипція lacоперона може індукуватися лактозою. Ін

дуктор взаємодіє з другим специфічним центром білкарепресо

ра (першим центром білокрепресор зв’язується з опероном).

Утворення індукторрепресорного комплексу призводить до

зниження спорідненості репресора до оператора і відділення

комплексу від оператора. Звільнена від білкової репресії ділян

ка ДНК (оперон) стає доступною для РНКполімерази, за допо

могою якої здійснюється транскрипція z, у і агенів, потім

Розділ3.Основимолелярноїбіолоії