Герасименко В.Г., Герасименко М.О., Цвіліховський М.І. та ін. Біотехнологія

Подождите немного. Документ загружается.

антипаралельних ланцюгів шляхом утворення між ними водне

вих зв’язків, що можуть виникнути тільки за умови, що по ходу

біспіральної структури ДНК аденін утворить пару з тиміном, а

гуанін — з цитозином. З’єднані за допомогою водневих зв’язків

азотисті основи називають комплементарними, а процес вибор

чої взаємодії аденіну з тиміном, гуаніну з цитозином — компле

ментарністю. Схему спарювання азотистих основ вже можна

вважати експериментально доведеною. Послідовність нуклео

тидів у ланцюгах біспіральної структури ДНК комплементарна,

але не ідентична. Стійкість біспіральної структури ДНК забез

печується за рахунок двох водневих зв’язків між тиміном і

аденіном і трьох водневих зв’язків між цитозином і гуаніном

(рис. 3.2). Комплементарність окремих азотистих основ приво

дить до того, що комплементарними виявляються дезоксирибо

нуклеотидні ланцюги ДНК у цілому. Зі схеми випливає, що в

одному ланцюзі зв’язок між нуклеотидами йде в напрямку

′→3′, а в іншому — у протилежному напрямку — 3′–5′. Антипа

ралельна спрямованість комплементарних ланцюгів має біоло

гічну основу при реплікації і транскрипції ДНК.

Крім водневих зв’язків між атомами водню, азоту і кисню в

комплементарних азотистих основах у стабілізації біспіральної

структури ДНК важливу роль відіграють так звані стекинг

взаємодії, що виникають між азотистими основами в зв’язку з

гідрофобними силами, що діють на відстані вандерваальсово

го радіуса.

Рентгеноструктурний аналіз волокон і кристалів показав,

що існує три типи подвійної спіралі ДНК (А, В і Zформа) і

один тип подвійної спіралі РНК. А і ВДНК є правозакручени

ми спіралями, а ZДНК — лівозакручена форма. Вформа ДНК

стійка при відносній вологості, що перевищує 92 %; якщо ж во

логість зменшується нижче 75 %, більшість дезоксирибонуклео

тидних послідовностей приймає Аформу. Обидві форми нага

дують гнучкі сходи, спірально закручені навколо центральної

осі. Залишки дезоксирибози і фосфатні групи, що чергуються,

слугують поручнями «драбини», а сходинками є комплементар

ні пуринпіримідинові пари основ.

Місця приєднання азотистих основ до залишків дезоксири

бози в комплементарних ланцюгах ДНК розташовані не чітко

ЧастинаI.Заальнабіотехнолоія

Розділ3.Основимолелярноїбіолоії

Рис. 3.2. Антипаралельні комплементарні ланцюги фрагмента

ДНК

(за Березовим Т.Т. та Коровкіним Б.Ф., 1983)

один проти одного стосовно осі спіралі. Це позначається на всій

конформації ДНК. З того боку від осі спіралі, де кут між дезок

сирибозними кільцями менше 180°, міститься жолоб, іменова

ний малою чи глікозидною борозною (у її бік спрямовані гліко

зидні зв’язки, що з’єднують дезоксирибозні залишки з

азотистими основами); з протилежного боку знаходиться вели

ка борозна, або неглікозидний жолоб. У біспіральній структурі

ДНК фосфатні групи складають ніби стінки великого і малого

жолобів, а «краї» пуринових і пірамідинових основ утворюють

дно. На дні великої борозни знаходяться атоми азоту і кисню,

що можуть з’єднуватися водневими зв’язками з бічними ланцю

гами амінокислотних залишків білка і відігравати важливу роль

у процесі розпізнавання.

У пуринових і піримідинових основах, що утворюють ком

плементарні пари, розташування груп, здатних до утворення

водневих зв’язків, різне. У парі АТ у напрямку від аденіну до

тиміну спочатку розташовується атом азоту — акцептор водню,

далі — NH

група — донор водню і, нарешті, атом кисню — зно

ву акцептор. У комплементарній парі G—С спочатку йде атом

азоту — акцептор, далі кисень — знову акцептор і потім

група — донор водню. У зв’язку з тим, що кожну компле

ментарну пару можна розглядати у протилежному напрямку

ТА і СG, то можливі чотири варіанти сполучень донорських і

акцепторних угруповань у ланцюзі ДНК, що можуть розпізна

ватися репресором чи іншими регуляторними білками. Отже,

інформація, закодована в ДНК у вигляді послідовності азоти

стих основ, з боку великої борозни може бути розшифрована

будьякою іншою великою молекулою. Мала борозна менш ін

формативна й у Вформі ДНК вона відіграє іншу роль.

А і Вформи ДНК відрізняються між собою в основному

розташуванням і кутом нахилу пари основ стосовно осі спіралі.

У Вформі площини основ майже перпендикулярні осі спіралі,

що проходить через центри пар основ. Мала борозна вужча за

велику через несиметричність місць приєднання азотистих ос

нов до залишків дезоксирибози, а глибина обох борозен при

близно однакова. В Аформі ДНК площина пари основ відхи

ляється від перпендикуляра до осі спіралі на 13–19°; пари основ

зміщені до зовнішньої поверхні, внаслідок чого вісь спіралі ле

ЧастинаI.Заальнабіотехнолоія

жить у великій борозні, не проходячи через пари основ. Така

конфігурація Аформи ДНК зумовила значні розбіжності в гли

бині борозен: мала борозна виявляється неглибокою, а велика

навпаки — глибокою. У ВДНК на один виток спіралі припадає

у середньому 10 пар основ, відстань по осі між сусідніми пара

ми — 0,34 нм; в Аформі ДНК до складу витка входить близько

11 пар основ, а відстань у зв’язку з цим зменшено до 0,29 нм; від

стань між витками (крок спіралі) дорівнює 3,4 нм (для моделі

КрікаУотсона і Вформи) і 2,8 нм — для Аформи. Zформа

містить близько 12 залишків у одному витку. Діаметр подвійної

спіралі — 1,8 нм (2 нм між атомами фосфору) для моделі Кріка

Уотсона й Аформи; для Вформи — 1,7 нм. Названі параметри,

отримані при вивченні волокон ДНК, є усередненими.

Дані, отримані при дослідженні кристалів ДНК і оброблені

математичним шляхом, свідчать про наявність значних відхи

лень від середніх значень. Порівняння моделі КрікаУотсона з

характеристиками В і Аформ ДНК показує, що за кількістю

пар основ, які входять в один виток, за розташуванням площи

ни пар основ щодо осі спіралі Вформа збігається з моделлю

КрікаУотсона; зрушення пар основ щодо осі і наявний у зв’яз

ку з цим центральний канал, розташування дезоксирибозних

залишків більше відповідають їхній конформації в Аспіралі

ДНК. Такі параметри, як кут спірального обертання (кут пово

роту між двома сусідніми парами основ), кількість пар азоти

стих основ, що містяться в одному витку, відстань між сусідні

ми парами основ по осі спіралі і деякі інші, визначені при

рентгеноструктурному аналізі і передбачені на підставі дослі

джень волокон ДНК, добре узгоджуються.

Викликають інтерес і вимагають пояснення значні відхи

лення від середніх показників локальних значень кута спіраль

ного обертання, кута «пропелера» (кут «пропелера» вимірює

поворот двох основ пари в протилежних напрямках навколо

з’єднуючої їхньої подовжньої осі), кута «відкриття» (в Аформі

спіраль ДНК обгинає центральну вісь, внаслідок чого між пара

ми основ існують щілини, що відкриваються в малу борозну на

зразок міхів акордеона) та інших параметрів. Локальні значен

ня кута спірального обертання для ВДНК коливаються від 28

до 42°, а для Аформи ДНК — від 16 до 44°. На підставі цих

Розділ3.Основимолелярноїбіолоії

даних висловлюється думка, що такі варіації в конформації спі

ралі розпізнає репресор чи інший регуляторний білок. Крім то

го, передбачається, що послідовність залишків нуклеотидів

впливає не тільки на генетичну інформацію, але й на регуляцію

її експресії, а локальний перехід визначених регуляторних діля

нок, скажімо, з правоспіральної Вконформації в лівоспіральну

Zформу зможе істотно впливати на доступність генетичної ін

формації і на процес її зчитування (наприклад, зміною ступеня

суперспіралізації ковалентно замкнутих кільцевих ДНК). ДНК

у Вформі знаходиться в процесі реплікації (синтез ДНК на мо

лекулі ДНК), а гібрид ДНК–РНК, що утвориться на певний

час, у процесі транскрипції, імовірно, має структуру Аспіралі.

Вторинна структура РНК поки що вивчена недостатньо. На

явність гідроксилу у другого вуглецевого атома рибози призво

дить до того, що РНК, очевидно, не може утворювати подвійну

спіраль Втипу. У гіпотетичній подвійній спіралі Втипу від

стань між атомом кисню 2

′гідроксильної групи рибози і деяки

ми з навколишніх її атомів стає настільки малим, що Вформа

РНК стереохімічно неможлива; в Аформі 2

′ОНгрупа рибози

розташовується на поверхні спіралі й у зв’язку з цим віддалена

від сусідніх атомів. Отже, самокомплементарні двонитчасті ді

лянки в тРНК повинні бути варіантами Аспіралі. Короткі само

комплементарні двонитчасті ділянки в РНК (так звані шпиль

ки), швидше за все, також мають бути виражені Аформою. Поки

що є один приклад Вформи РНК: це синтетичний гібрид, що

складається з ланцюга аденілових рибонуклеотидів у ланцюзі

тимідилових дезоксирибонуклеотидів. Даних про Zформу

РНК поки що немає. Найбільш ймовірно вторинною структу

рою всієї молекули тРНК є модель, запропонована Холлі, пло

ске зображення якої за формою схоже на листок конюшини

(рис. 3.3).

Третинна структура. Для вивчення третинної струк

тури ДНК необхідно мати її в інтактному (неушкодженому) ви

гляді. На сьогодні таким чином виділені деякі ДНК вірусів, мі

тохондрій і хлоропластів. Довжина двоспіральної молекули в

хромосомі людини у витягнутому стані могла б досягти 8 см;

насправді її довжина 5 нм. Таке надзвичайно ощадливе упаку

вання досягається за рахунок суперспіралізації вторинної

ЧастинаI.Заальнабіотехнолоія

Розділ3.Основимолелярноїбіолоії

Рис. 3.3. Схема молекули фенілаланінової ТРНК

(за Мецлером Д., 1980)

структури. Ступінь суперспіралізації (наявність додаткових су

первитків чи суперспіралей) встановлюється за зміною кон

станти седиментації. Суперспіралі часто зустрічаються в кіль

цевих молекулах ДНК. Так, хромосома Е.соlі — це єдине

замкнуте кільце. Кільцеві молекули ДНК часто виявляються в

мітохондріях, деяких вірусах, ядрі еукаріот. Кільцеві молекули,

як правило, закручуються самі на себе, утворюючи суперспі

ральні молекули із супервитками. Скручування подвійної спі

ралі самої на себе призводить до утворення суперскрученої пра

возакрученої структури. Це явище називається негативною

суперспіралізацією. У результаті суперспіралізації на кожен су

первиток припадає 20–25витків подвійної спіралі. Завдяки су

перспіралізації дуже довга молекула ДНК (1360 мкм в Е.соlі і

990 тис. мкм у людини) упаковується в малому об’ємі бакте

ріальної клітини чи ядрі клітини еукаріот. Виділено ферменти

ДНКтопоізомерази, що каталізують процес суперспіралізації

(ДНКгірази), а також переводять суперспіралізовані структу

ри в релаксований стан (ДНКрозплітази); факт перебування

ДНК у стані суперспіралізації підтверджений за допомогою ме

тоду електронної мікроскопії. Процес суперспіралізації ДНК у

еукаріот проходить за участю гістонових білків, серед яких за

лежно від вмісту лізину й аргініну розрізняють п’ять основних

класів (табл. 3.2).

Полікатіонна природа гістонів забезпечує їхню взаємодію з

поліаніонним пентозофосфатним каркасом і поряд з водневими

зв’язками стабілізує структуру ДНК еукаріот. У ДНК мітохон

дрій, хлоропластів і прокаріотичних клітин фактором, що стабі

лізує структуру цих поліаніонних макромолекул, є неорганічні

ЧастинаI.Заальнабіотехнолоія

Таблиця 3.2.

Вміст лізину і аргініну в гістонах, %

катіони, а не білок. Значний внесок у стабілізацію структури

ДНК вносять гідрофобні взаємодії в щільно упакованих азоти

стих основах, укладених у серцевині спіралі. Взаємодія ДНК із

гістонами приводить до формування нуклеосом — структурних

одиниць хроматину (рис. 3.4). У кожній нуклеосомній часточці

Розділ3.Основимолелярноїбіолоії

Рис. 3.4. Схема будови нуклеосоми

(за Албертсом Б. та ін., 1986)

фрагмент ДНК довжиною 100–200 нуклеотидних пар закруче

ний навколо гістонового кора, що являє собою октамерну

структуру, до складу якої входить по дві молекули кожного з

гістонів Н2а, Н2b, Н3 і Н4. Сусідні нуклеосоми зв’язані між со

бою ділянками лінкерної ДНК (спейсерні ділянки) довжиною

близько 50 пар основ; спейсерні ділянки включають по одній

молекулі гістона Н1, а також негістонові білки. Висловлюється

думка про можливу участь гістонів у регулюванні генної актив

ності. Структурна гетерогенність хроматину і зв’язана з його

структурою функціональна активність значною мірою обумо

влені ковалентними модифікаціями (ацетилювання, фосфори

лювання, метилювання й ін.) амінокислот гістонових білків.

Суперспіралізовану молекулу ДНК можна перевести у відкри

ту (релаксовану) кільцеву форму, розірвавши один чи обидва

ланцюги подвійної спіралі за допомогою короткочасної обробки

її ферментом. Релаксована форма молекули, що утворюється,

седиментує повільніше. Суперспіральність впливає на в’язкість

розчинів ДНК і на електрофоретичну рухливість макромоле

кул. У деяких випадках наявність супервитків можна спостері

гати за допомогою електронного мікроскопа. ДНК являє собою

динамічну структуру, що легко модифікується. Перехід супер

спіральної ДНК у відкриту кільцеву молекулу є необхідним

етапом процесу реплікації.

Суперспіральна структура ДНК може бути також виявлена

розривом спіралі (одного чи обох ланцюгів) під впливом інтер

каліруючих з’єднань (інтеркаляція — це вбудовування плоских

ароматичних кілець між парами основ ДНК). До реагентів, які

викликають інтеркаляцію, належать деякі лікарські препарати,

барвники й інші речовини. Застосування таких речовин пов’яза

не з певним ризиком, тому що інтеркалюючі сполуки мають му

тагенну дію. В міру зростання ступеня інтеркаляції відбувається

розкручування витків вторинної структури ДНК: кожне інтерка

лююче кільце викликає розкручування спіралі на 26°. В інтакт

них клітинах інтеркалюючими агентами можуть бути ароматич

ні кільця бічних ланцюгів амінокислот при взаємодії білків з

ДНК. Зміна в щільності супервитків, викликана інтеркаляцією

чи зміною іонного оточення, може мати біологічне значення що

до генетичної регуляції і насамперед у дотриманні послідовності

ЧастинаI.Заальнабіотехнолоія

у взаємодії ДНК із внутрішньоклітинними ферментними систе

мами. Можливі й інші способи укладання ДНК у просторі.

Одноланцюгові рибонуклеїнові кислоти (інформаційна, ри

босомна і транспортна) при фізіологічних значеннях рН, іонної

сили і температури мають велику кількість комплементарних ді

лянок (так званих шпильок), що визначають стійкість їхньої тре

тинної структури. Плоска структура нативних молекул тРНК,

що нагадує за формою листок конюшини, за рахунок укладання

різних частин перетворюється в компактну структуру.

У деяких фагів молекула ДНК побудована з однієї спіралі;

у той же час є віруси, у яких РНК складається з двох ланцюгів і

за структурою нагадує ДНК.

Таким чином, варто наголосити, що спіраль ДНК містить

інформацію двох типів, що кодується і зчитується порізному:

власне генетична інформація, що визначає структуру білка, та

інформація, що є свого роду «інструкцією» для вибіркового чи

тання того чи іншого фрагмента запису. В основі збереження і

реалізації інформації обох типів лежать фізикохімічні процеси,

багато в чому обумовлені функціональними групами, що вхо

дять до складу нуклеїнових кислот. Іонізовані фосфатні групи,

що входять до складу нуклеїнових кислот, обумовлюють їхній

негативний заряд, завдяки чому ДНК в організмі знаходиться у

вигляді комплексів з білками, які несуть позитивний заряд (гі

стони і протаміни), поліамінами і металами. Наявність вільних

ОНгруп біля другого вуглецевого атома рибозного залишку

РНК значною мірою визначає конформацію полімерних макро

молекул. Полярні групи і азотистих основ

нуклеїнових кислот здатні утворювати водневі зв’язки з білка

ми, а також між комплементарними азотистими основами в біс

піральній структурі ДНК. У зв’язку з цим ДНК і РНК є реакцій

но здатними сполуками. Порівняно легко проходять реакції

метилювання азотистих основ, завдяки чому уявлення про ДНК

як про ланцюг, що містить тільки чотири види нуклеотидів, вар

то вважати спрощеним. Метильовані азотисті основи гідрокси

люються і виникають їх оксиметильні похідні. Метилювання

відбувається після синтезу полінуклеотида. Метилювання і гид

роксилювання метильних похідних мають біологічний сенс.

Розділ3.Основимолелярноїбіолоії