Герасименко В.Г., Герасименко М.О., Цвіліховський М.І. та ін. Біотехнологія

Подождите немного. Документ загружается.

У результаті біохімічного аналізу білків, що є продуктами му

тантних генів, було показано, що послідовність чотирьох мономер

них структур (аденіну, гуаніну, тиміну і цитозину) у ДНК і двад

цятьох амінокислотах у білках колінеарна, тобто послідовність

нуклеотидів у ділянці ДНК, що кодує білок, відповідає послі

довності амінокислот у цьому білку. Отже, такий стан справ по

рушив питання, яке стало головним у молекулярній біології,

про механізм такого біохімічно складного перетворення, як пе

реведення послідовності нуклеотидів ДНК у послідовності амі

нокислот білка. Потік інформації від ДНК до білка символічно

можна подати так:

ДНК РНК Білки→Регуляція метаболізму

Подана схема привернула увагу вчених і надалі сприяла

стрімкому розвитку біохімічної генетики. Синтез молекул РНК

називається транскрипцією ДНК; утворена на матриці ДНК на

одному з її ланцюгів, РНКкопія містить у собі увесь обсяг ін

формації цієї ділянки ДНК; РНК зберігає здатність до утворен

ня водневих зв’язків між комплементарними основами, тому що

урацил, присутній у РНК замість тиміну, спарюється з аденіном

так само, як і тимін. Натомість транскрипція відрізняється від

реплікації. РНКкопія після завершення її синтезу звільняється

від ДНКматриці, слідом за чим відбувається відновлення ви

хідної подвійної спіралі ДНК; знову синтезовані молекули РНК

мають одноланцюгову структуру, вона коротше ДНК і відпові

дає довжині тієї ділянки ДНК, якої достатньо для кодування

одного чи декількох білків. Одні ділянки ДНК (гени) викори

стовуються для синтезу РНК тисячі разів, тоді як інші не тран

скрибуються зовсім.

У клітинах еукаріот багато з тих молекул РНК, що утвори

лися під час транскрипції, перш ніж перетворитися на інформа

ційну РНК (іРНК) і потрапити в цитоплазму, піддаються знач

ним хімічним змінам. У свою чергу, у цитоплазмі на кожній

молекулі іРНК можуть синтезуватися тисячі копій відповідного

поліпептидного ланцюга. Якщо при цьому врахувати, що швид

кість, з якою проходить процес білкового синтезу, надзвичайно

висока (поліпептидний ланцюг, що складається зі ста аміноки

ЧастинаI.Заальнабіотехнолоія

Трансрипція Трансляція

слотних залишків, у клітині кишкової палички створюється про

тягом 5 с), то інформація, що міститься у невеликій ділянці

ДНК, здатна реалізуватися у вигляді великої кількості певного

білка. Так, на матриці одного гена, що кодує фіброїн, відбуваєть

ся синтез 10

молекул іРНК, на кожній з яких одержується

молекул фіброїну, що є основним компонентом шовку. У ці

лому за чотири доби одна клітина шовкосинтезуючої залози ви

робляє 10

молекул фіброїну (Албертс Б. і ін., 1986).

Правила переведення послідовності нуклеотидів, що вхо

дять у полінуклеотидну структуру ДНК, в амінокислотну по

слідовність білків (генетичний код) були розшифровані на по

чатку 60х років ХХ ст. Ніренбергом М., Маттеї Г., Ледером Ф.

та іншими дослідниками. У більш ранніх генетичних експери

ментах було показане кодування амінокислот триплетами ну

клеотидів (кодонами). У цьому випадку з чотирьох азотистих

основ (А, Т, G, С) можна скласти 64 (4

) різні триплетні комбі

нації, яких цілком достатньо для кодування 20 амінокислот.

Якщо ж з цього набору скласти сполучення по два нуклеотиди

(дублетний код), то цієї кількості явно бракує для кодування

всього набору амінокислот. Інкубацією у пробірках суміші, що

складається з різних синтетичних полірибонуклеотидів, ек

стракту з кишкової палички, двадцяти амінокислот, з яких тіль

ки одна мала радіоактивну мітку, вдалося установити весь набір

триплетів для кодування усіх амінокислот. Крім того, за допо

могою тринуклеотидів з відомою послідовністю азотистих ос

нов була розшифрована нуклеотидна послідовність у всіх кодо

нах, що обумовлює зв’язування різних аміноацилтРНК.

Варто також відзначити роботи Корани Х.Г., який запропо

нував метод хімічного синтезу полі та олігонуклеотидів, і

Холлі Р.У., що розшифрував структуру тРНК з антикодовою ді

лянкою.

Донедавна наявний фактичний матеріал свідчив про уні

версальність генетичного коду, тобто у всіх організмах — віру

сах, прокаріотах і еукаріотах ті самі нуклеотидні триплети коду

вали однакові амінокислоти. В останні роки при вивченні

процесу біосинтезу білка в мітохондріях були виявлені відхи

лення від універсального коду (табл. 3.3).

Розділ3.Основимолелярноїбіолоії

Для генетичного коду характерна ще його виродженість; у

даному випадку це означає, що амінокислоті відповідає більш

ніж один кодон. Наприклад, аргініну, лейцину і серину відпові

дає по шість; гліцину, проліну, валіну, тирозину й аланіну — по

чотири, а триптофану і метіоніну — по одному кодону. Внаслі

док виродженості генетичного коду помилки, що виникають

при реплікації і транскрипції в деяких випадках не супроводжу

ються перекручуванням генетичної інформації і порушенням

експресії, що має біологічне значення. В усіх випадках дво, три

і чотириразової виродженості зміна відбувається тільки в

третьому нуклеотиді триплету. Так, якби аланін кодувався тіль

ки одним триплетом ГЦУ, то будьяка зміна нуклеотидної по

слідовності в ньому при реплікації або транскрипції неминуче

супроводжувалася б заміною у відповідній поліпептидній

структурі аланіну іншою амінокислотою з усіма наслідками, що

з цього випливають. Однак завдяки чотириразовій вироджено

сті тільки заміни, що стосуються перших двох нуклеотидів

кодона, ведуть до зміни його значення. Специфічність кодонів

визначається головним чином його першими двома нуклеоти

дами. Що стосується третього нуклеотида, який займає поло

ження на 3

′кінці олігонуклеотидної структури, то його специ

фічність виражена слабше (Ленінджер А., 1985; Бохінські Р.,

1987).

Точність синтезу поліпептидного ланцюга досягається за

рахунок комплементарного розпізнавання азотистих основ

′→3′орієнтованої послідовності кодона іРНК, що має 3′→5′

напрямок послідовності азотистих основ антикодону тРНК.

ЧастинаI.Заальнабіотехнолоія

Таблиця 3.3.

Невідповідність генетичного коду мітохондрій універсальному

коду (за Бохінські Р., 1987)

Слід зазначити, що кількість каталізуючих реакцію активу

вання амінокислот аміноацилтРНКсинтетаз відповідає кіль

кості різних видів амінокислот, з яких синтезуються білки; що

стосується тРНК, то їхня кількість як мінімум повинна досяга

ти 32, тому що деякі амінокислоти здатні взаємодіяти з двома, а

то й з трьома різними тРНК, які, у свою чергу, пізнають і зв’язу

ють один, два чи навіть три кодони іРНК. Кодонантикодонове

пізнавання (кодон розташовується на іРНК і має 5

′→3′орієнта

цію, антикодон — на тРНК і орієнтований у напрямку 3

′→5′)

передбачає відхилення від класичної взаємодії й утворення вод

невих зв’язків між парами азотистих основ А — Т, G — С і А —

U у ДНК і РНК. Це відхилення сформульоване Кріком Ф. у гі

потезі коливань, біологічний зміст якої має багато спільного з

явищем виродженості генетичного коду. Гіпотеза коливань зво

диться до здатності третьої азотистої основи, розташованої з бо

ку 5

′кінця антикодону (тРНК), змінювати своє просторове по

ложення, натомість як дві перші основи, що знаходяться в

′кінці антикодону, фіксовані більш жорстко. Зміна просторо

вої орієнтації, що знаходиться на 5

′кінці антикодону азотистої

основи обумовлює його здатність до утворення не відповідних

класичним (А — Т, G — С і А — U) взаємодій між парами основ.

Установлено, що третім від 3

′кінця антикодону може бути U, G

чи І (рибонуклеозид інозин, у якому азотистою основою висту

пає гіпоксантин, що утворюється при відщепленні від аденіну

його 6аміногрупи). В табл. 3.4 подано можливі варіанти поєд

нання пар основ у зв’язку з явищем коливань.

Як видно з табл. 3.4, якщо в антикодоні в положенні коли

вання знаходиться гіпоксантин (у складі інозину), можливе

розпізнавання й утворення водневих зв’язків трьох пар: І — А,

І — С і І — U (але така комплементарна взаємодія виявляється

більш слабкою порівняно з виникаючою взаємодією при утво

ренні звичайних пар G — С i А — U); у випадку перебування у

позиції коливання G чи U кількість можливих сполучень обме

жується двома: G — С, G — U і U — А, U — G. Нові комбінації

пар основ не виникають, якщо такими, що коливаються, є аде

нін і цитозин. У цьому випадку відбувається утворення зв’язків

за класичним принципом: А — U; С — G (рис. 3.7).

Розділ3.Основимолелярноїбіолоії

нових тРНК, антикодон якої (5′) І — С — G (3′) здатний взаємо

діяти з трьома різними аргініновими кодонами:

Кодон (5

′)С — G — А(3′) (5′)С — G — U(3′) (5′)С — G — С(3’)

__ __ __ __ __ __ __ __ __

__ __ __ __ __ __

Антикодон (3

′)G C I(5′) (3′)G C I(5′) (3′)G C I(5′)

Дві перших основи кодонів (С — G) утворюють міцні (поз

начені трьома рисками) уотсонкріковські пари з відповідними

азотистими основами антикодону. Азотисті основи, що знахо

дяться у третьому положенні, (А, U, С) аргінінових кодонів

утворюють слабкі водневі зв’язки (дві риски) із залишком іно

зину (І) в антикодоні. На підставі цього й інших прикладів ко

донантикодонових взаємодій Крік Ф. дійшов висновку, що ос

нови більшості кодонів, які знаходяться у третьому положенні,

мають деякий ступінь свободи при утворенні пари з відповід

ною азотистою основою антикодонів, тобто, за термінологією

Кріка Ф., основи, що коливаються. Біологічний зміст явища по

лягає в тому, що воно дозволяє звести до мінімуму виникаючі

помилки. Завдяки неміцності зв’язку, що утвориться між осно

вою, яка коливається, відповідною основою антикодону, тРНК

легше звільняється з комплексу іРНК у процесі білкового син

тезу. У випадку залучення в сильну уотсонкріковську кодон

антикодонову взаємодію усіх трьох пар основ міцність зв’язку

стала б моментом, що лімітує швидкість білкового синтезу че

рез уповільнення процесу вивільнення тРНК із комплексу з

іРНК (Ленинджер А., 1985; Бохинськи Р., 1987).

3.2.2. Етапи біосинтезу білка

У синтезі білка беруть участь близько трьохсот різних мак

ромолекул, представлених у клітинах еукаріот більш ніж 70ма

рибосомними білками, 20ма ферментами активації аміноки

слот і більш ніж десятьма допоміжними ферментами, майже 100

ферментами, що беруть участь у процесі дозрівання білків (про

цесингу), а також транспортними і рибосомними РНК у кілько

сті, що перевищує сім десятків. Сьогоднішнім знанням про ме

ханізм синтезу білка передували відкриття, зроблені на початку

Розділ3.Основимолелярноїбіолоії

нілату (аміноацилАМФ) переноситься на молекулу відповід

ної тРНК з утворенням аміноацилтРНК — активованої про

міжної сполуки, що бере участь у синтезі білка. Процес актива

ції амінокислот і їхнє наступне приєднання до тРНК

каталізуються специфічними аміноацилтРНКсинтетазами,

що називаються ще активуючими ферментами. Кожний з фер

ментів строго специфічний як стосовно тРНК, так і щодо відпо

відної їй амінокислоти. Двостадійний процес активації аміноки

слот здійснюється в каталітичному центрі ферменту:

АміноацилтРНК

1. Амінокислота + АТФ АміноацилАМФ + ФФн;

синтетаза (Mg

)

АміноацилтРНК

2. АміноацилАМФ + тРНК АміноацилтРНК + АМФ

синтетаза (Mg

)

В усіх випадках на другій стадії активована амінокислота

приєднується до залишку аденілової кислоти або аденінового

нуклеотиду (А) у триплеті ССА на 3

′кінці молекули тРНК.

Розділ3.Основимолелярноїбіолоії

Перенесення аміноацильної групи на 2′ чи 3′ОНгрупу

рибозного залишку аденінового нуклеотиду ССАпослідовності

на 3

′кінці тРНК залежить від амінокислоти й аміноацил

тРНКсинтетази, що каталізує утворення аміноацилтРНК. Ак

тивована амінокислота може дуже швидко переміщатися з 2

′ у

′положення і назад. Стадія активації і перенесення певної амі

нокислоти каталізується однією і тією самою аміноацилтРНК

синтетазою. На активацію кожної амінокислоти витрачається

енергія двох високоенергетичних фосфатних зв’язків, що ро

бить сумарну реакцію активації амінокислот практично незво

ротною. У ході перетворення амінокислот в аміноацилтРНК

комплекси підвищується реакційна здатність мономерних

компонентів, що використовуються у реакції полімеризації; при

взаємодії амінокислоти зі специфічною тРНК здійснюється

добір необхідних для синтезу поліпептидного ланцюга відпо

відних амінокислот. Позбавлені спроможності впізнавати кодо

ни в іРНК, амінокислоти набувають цієї функції у складі аміно

ацилтРНК; одночасно активовані карбоксильні групи

амінокислот стають реакційно здатними й утворюють пептидні

зв’язки (—С — NH — ) з аміногрупами сусідніх амінокислот.

Молекули тРНК відіграють роль кінцевих адапторів, що пе

реводять інформацію, укладену в нуклеотидній послідовності

іРНК, на мову білка. Не менше значення у процесі декодування

має і другий набір адапторів — молекул аміноацилтРНКсин

тетаз.

Таким чином, генетичний код розшифровується за допомо

гою двох взаємозалежних наборів адапторів, що здійснюють ви

сокоспецифічну функцію, у результаті чого кожна амінокислота

може зайняти місце, яке визначене її триплетною нуклеотидною

послідовністю у молекулі іРНК, тобто своїм кодоном.

На етапах ініціації поліпептидного ланцюга, елонгації і тер

мінації для здійснення реакцій білкового синтезу необхідні ри

босоми.

Рибосома. Найкраще вивчені рибосоми Е.соlі. Їхня кіль

кість у прокаріотичній клітині перевищує 1,5·10

, діаметр —

ЧастинаI.Заальнабіотехнолоія

18–20 нм, маса коливається у межах 2500–2800 кДа, коефіцієнт

седиментації — 70S. У рибосомах прокаріот міститься 65 %

рРНК і 35 % білка. Рибосоми становлять майже чверть сухої

маси клітини. Рибосоми еукаріотичних клітин значно більші

бактеріальних (діаметр — приблизно 21 нм, маса — майже

4000 кДа, коефіцієнт седиментації — 80S, співвідношення між

білком і рРНК дорівнює приблизно 1:1, а їхня кількість у еука

ріотичній клітині — ~10

). Синтез білків, що входять до складу

рибосомної структури, відбувається в цитоплазмі, самозборка

рибосомних субодиниць — у ядерці за рахунок взаємодії моле

кул білків і рРНК за участю іонів магнію. Рибосоми прокаріот і

еукаріот складаються з двох субчастин неоднакового розміру. У

рибосом прокаріот коефіцієнт седиментації більшої субчастини

50S, а меншої — 30S, їхня маса — відповідно 1800 і 1000 кДа; у

рибосом еукаріот коефіцієнт седиментації більшої субчастини

знаходиться на рівні 60S, меншої — 40S.

Велика субчастина (50S) прокаріотичної рибосоми містить

одну молекулу 23SрРНК (~3200 нуклеотидів), одну молекулу

5SрРНК (~120 нуклеотидів) і 34 білка; менша субчастина

(30S) — 21 білок і одну молекулу 16SрРНК.

Подібно до бактеріальної рибосоми, рибосома еукаріотич

ної клітини дисоціює на велику (60S) і малу (40S) субчастини,

що, у свою чергу, можуть дисоціювати на складові їхніх білків і

РНК. До складу більшої субчастини входять три молекули

РНК (28S, 7S і 5S) і понад 40 різних рибосомних білків; мала

субчастина містить одну молекулу 18SрРНК і приблизно 33

різних рибосомних білків.

Білки великої і малої субчастин рибосоми прокаріот мають

нумерацію. У 50Sсубчастині — від L1 до L34 (від англ. Large —

велика), у 30Sсубчастині — від S1 до S21 (від англ. Small — ма

ла). Усі білки, що входять до складу рибосом E. coli, індивідуа

лізовані, у більшості з них встановлені амінокислотна послідов

ність, первинна структура, молекулярна маса, що коливається в

межах 6,5–75 тис., визначені також нуклеотидні послідовності

рРНК E.соlі.

Усі рРНК і більшість білків еукаріотичних рибосом також

виділені в чистому вигляді і вивчені. Рибосомні 30S і 50Sсуб

частини при відповідних умовах можуть бути реконструйовані

Розділ3.Основимолелярноїбіолоії