Герасименко В.Г., Герасименко М.О., Цвіліховський М.І. та ін. Біотехнологія

Подождите немного. Документ загружается.

Властивості цитопластів і каріопластів. Устано

влено здатність цитопластів синтезувати білки, підтримувати ре

плікацію вірусу везикулярного стоматиту і поліовіруса, синтез

РНК і білка, контрольований вірусом сказу, звільняти вірус SV40

із трансформованих клітин. Цитопласти містять усі види органел,

властиві нормальній клітині, зберігають характерну для цілих клі

тин здатність прикріплюватися до субстрату й утворювати склад

часту мембрану, пересуватися і здійснювати піноцитоз.

Навколо каріопластів знаходиться шар, на частку якого

припадає близько 10 % клітинної цитоплазми, що містить ком

поненти ендоплазматичного ретикулума, деяка кількість міто

хондрій і рибосом; центріолі в каріопластів, на відміну від цито

пластів, відсутні.

Близько 10 % каріопластів деяких клітинних ліній здатні

відновлювати весь обсяг утраченої при енуклеації цитоплазми і

знову перетворюватися на життєздатні клітини.

Здатність каріопластів регенерувати втрачену в процесі

енуклеації цитоплазму і формувати життєздатні колонії клітин

залежить від кількості цитоплазми, що оточує ядро. У фракції

каріопластів, біля ядер яких зосереджено 2–4 % тієї кількості

цитоплазми, що міститься в інтактній клітині (дрібні каріопла

сти), тільки один з 10

очищених елементів може сформувати

життєздатну колонію клітин.

Трансплантація ядер і реконструювання клітин.

Після енуклеації клітин моношар цитопластів у пластикових

чашках діаметром 60 мм чи скляних дисках діаметром

14 мм інкубують у поживному середовищі при 37

С протягом

1–2 годин, а потім — 20 хв і охолоджують до 4

С. При цій тем

пературі моношар двічі відмивають розчином Ерла (рН 8,0), по

тім 20 хв. обробляють 0,5 мл охолодженого розчину Ерла з віру

сом Сендай, інактивованим опроміненням протягом 5 хв

(ультрафіолетовою лампою на відстані 15 см), після чого шар

цитопластів знову двічі промивають тим же розчином, який по

тім видаляють.

Каріопласти, суспендовані в сольовому розчині на фосфат

ному буфері, додають до моношарової культури цитопластів з

таким розрахунком, щоб на один цитопласт припадало 100 ка

ріопластів. Для адсорбування каріопластів на цитопластах, по

ЧастинаI.Заальнабіотехнолоія

100

критих вірусними частками, інкубують при 4

С протягом 45 хв;

через кожні 3–5 хв чашки злегка погойдують. Для злиття каріо

пластів і цитопластів чашки чи скляні диски переносять у тер

мостат і витримують там при 37

С протягом 45 хв. Після закін

чення цього часу моношар на чашках кілька разів інтенсивно

відмивають розчином Ерла чи поживним середовищем без

сироватки, щоб видалити каріопласти, які не злилися. Потім у

чашки наливають поживне середовище, придатне для культиву

вання того типу клітин, що були використані як донори каріо

пластів. Цитопласти, що не злилися з ядрами, гинуть і приблиз

но через 2 дні відокремлються від поверхні чашки.

Для одержання незабруднених цитопластами культур реко

мендується центрифугування гібридних клітин у градієнті

щільності ренографіну.

Використання поліетиленгліколю для стимулювання про

цесу злиття каріопластів і цитопластів при конструюванні клі

тинних гібридів обмежене через його токсичність, що значно пе

ревищує токсичність вірусу Сендай.

Для ідентифікації гібридних клітин, визначення ефектив

ності трансплантації ядер і наявності батьківських клітин у гі

бридній популяції використовують мутантні клітинні лінії.

Ефективність реконструювання клітин за рахунок злиття

каріопластів і цитопластів залежить від багатьох факторів. Так,

тільки близько 10 % цитопластів, отриманих шляхом енуклеації

клітин пацюка лінії НТС, зливалися з каріопластами, виділени

ми з клітин миші лінії А9. Коли гібридизації піддавали цитопла

сти, отримані з фібробластів курячих ембріонів, і каріопласти,

що являли собою перебуваючі у спокої ядра еритроцитів, ефек

тивність реконструювання перевищувала 90 %. Висока ефек

тивність злиття ізольованих перебуваючих у спокої ядер ери

троцитів птахів з енуклейованими цитопластами, а також досвід

щодо активування ядер еритроцитів птахів, зокрема курей,

шляхом злиття цих еритроцитів із клітинами HeLa чи з іншими

клітинами, що мають активний метаболізм, дозволили дослі

джувати роль ядерноцитоплазматичних взаємодій в експресії

генів гібридних еукаріотичних клітин. Виявилося, що не всі гі

бриди, що утворилися, були життєздатними. Приблизно 9 % ре

конструйованих клітин можуть рости і ділитися (Хайтауер М.,

Розділ4.Клітиннаінженерія

101

Льюкас Дж., 1985). У гібридних клітинах відразу після злиття

починаються морфологічні зміни. Через кілька днів реконстру

йовані гібридні клітини майже не відрізняються від вихідних

батьківських, які було використано як донори ядер.

Трансплантація ізольованих інтерфазних ядер,

укладених у ліпідну оболонку, у соматичні клітини.

У літературі є дані про введення молекул, у тому числі ДНК,

у клітини за допомогою «тіней» еритроцитів (Рекстейнер М.,

1985) і ліпосом (Штраубингер Р., Папахаджопулос Д., 1985).

Так, Сєровим О.Л. (1985) у лабораторії генетичних основ онто

генезу Інституту цитології і генетики СО АН СРСР була вико

нана експериментальна робота щодо включення в штучні мем

брани ізольованих інтерфазних ядер з метою забезпечення

збереження генетичного матеріалу від деградації та індукуван

ня процесу трансформації ізольованих ядер у реципієнтні клі

тини. За даними Сєрова О.Л., інтерфазні ядра, виділені з куль

тури фібробластів норки, суспендували в багатокомпонентному

буферному розчині, що включає різні концентрації KCl, NaCl,

трисHCl, ЕДТА, сахарози і спермідину.

Для створення штучної мембрани навколо ядер використо

вували фосфатидилетаноламін у концентрації 10–20 мг/мл і

фосфатидилхолін, отриманий із жовтків курячих яєць, у кон

центрації 150–200 мг/мл органічного розчинника. Запропоно

ваний Сєровим О.Л. метод заснований на утворенні фосфолі

підної мембрани при проходженні ізольованих ядер через

тришарову систему, що знаходиться в центрифуговій пробірці з

розчином 1М сахарози, яка міститься на дні центрифугової про

бірки, водним розчином 0,25 М сахарози, що формує верхній

шар, і шаром органічного розчинника, що складається з хлоро

форму, діоксану і етилацетату в співвідношенні 0,25:0,23:0,51 і

фосфатидилхоліну в концентрації 150–200 мг/мл зазначеного

органічного розчинника, що займає в центрифуговій пробірці

положення між верхнім і нижнім шарами сахарози.

На межі трикомпонентного органічного розчинника з верх

нім сахарозним шаром молекули фосфатидилхоліну орієнтова

ні своїми гідрофільними кінцями убік водного шару; на межі

органічного розчинника з нижнім сахарозним шаром молекули

фосфоліпіду також будуть орієнтовані своїми полярними голів

ЧастинаI.Заальнабіотехнолоія

102

ками до водяної фази більш щільного нижнього сахарозного

шару. Під час центрифугування ядра при переході з водного

(0,25 М сахарози) у шар органічного розчинника на межі поділу

фаз зустрічаються з полярними гідрофільними голівками моле

кул фосфатидилхоліну, який формує одношарову ліпідну мем

брану на поверхні інтерфазних ізольованих ядер. На межі орга

нічного шару з більш щільним шаром 1М сахарози ядра, що вже

мають на своїй поверхні одношарову ліпідну мембрану, орієн

товану гідрофобними кінцями назовні, зустрічаються із шаром

молекул фосфатидилхоліну, гідрофобні кінці яких спрямовані

убік органічної фази і взаємодіють з гідрофобними кінцями лі

підного моношару ядер, утворюючи при цьому другий шар мем

брани на поверхні інтерфазних ядер.

Сформований ліпідний бішар міцно утримується на поверх

ні інтерфазних ядер і не змивається при багаторазових пере

осадженнях шляхом центрифугування через розчин 1М сахаро

зи. За допомогою радіоавтографії і флуоресцентної мікроскопії

було показано, що ліпідний бішар рівномірно розподіляється на

поверхні ядра, формуючи додаткову мембрану чи мембрани

(при зазначених умовах центрифугування вільні ліпосоми в

ядерну фракцію потрапити не можуть).

У результаті додаткових експериментів було показано, що

штучно створена мембрана не є досконалою (Сєров О.Л.). Такий

висновок, зроблений на підставі виявлення виходу з ядер, ото

чених фосфатидилхоліновою мембраною, АТФ і проникнення в

ці ядра екзогенної ДНКази. Одночасно було встановлено, що в

обох випадках утворена мембрана блокувала транслокацію як

макромолекул (ДНКаза), так і звичайних молекул порівняно

невеликих розмірів (АТФ). Тим часом відомо, що природні

ядерні мембрани проникливі навіть для полімерних молекул;

штучна мембрана, створена з фосфатидилхоліну, зовсім непро

никлива як для великих полярних молекул, так і для макромо

лекулярних структур.

У результаті проведених експериментів була висловлена

думка, що фосфатидилхолін екзогенного походження формує

мембранну структуру навколо ядра, у зв’язку з чим воно

виявляється заключеним у ліпосому, яка, будучи додатковою

мембраною, накладає певні обмеження на перенесення деяких

Розділ4.Клітиннаінженерія

103

молекул у ядро і назад, але цілком ці процеси не припиняються.

При введенні інтерфазних ядер норки, що оточені штучною

мембраною, в культуру LMTK — клітин миші, які характеризу

ються дефіцитом ферменту тимідинкінази (ТК), установлене

перенесення у реципієнтні мишачі клітини порівняно великих

фрагментів ДНК із ядер норки, а більшість досліджених тран

сформаторів характеризувалися стабільним ТК

фенотипом.

Пропонований метод перенесення генетичного матеріалу за

допомогою інтерфазних ядер, що знаходяться у ліпосомі, завдя

ки високій частоті трансформації в порівнянні з методом пере

несення генів у складі сумарної клітинної ДНК свідчить про

можливу захисну функцію ядерних білків донора, що захища

ють ДНК від деградації, а також про участь цих білків в інтегра

ції донорського хроматину і хроматину реципієнтних клітин.

Біотехнологія одержання цибридів. Цибридами

називаються продукти, що утворюються при злитті цілих клі

тин однієї мутантної лінії з цитоплазмою енуклейованих клітин

іншої клітинної лінії. Для одержання цибридів проводили ену

клеацію клітин, попередньо маркірованих флуоресціюючими

гранулами зеленого кольору, що додаються в поживне середо

вище за допомогою цитохалазину В, концентрацію якого дово

дили до 5 мкг/мл середовища.

Іонгкинд І. та Веркерк А. (1985) позначили фібробласти лю

дини флуоресцентними барвниками, інкубуючи проліферуючі

клітинні культури протягом 2 днів у середовищі F10 Хема, що

містить у 1 мл 2–10

гранул барвника, 100 мкг стрептоміцину і

100 одиниць пеніциліну, з додаванням 10 % сироватки плода ко

рови. Під час інкубації клітини, що знаходяться у культурі, фа

гоцитували гранули; гранули прикріплені до зовнішньої по

верхні клітинної мембрани, змивали сольовим розчином. Як

показали результати проведених досліджень, маркірування

флуоресціюючими гранулами сповільнює ріст клітин.

Енуклейовану суспензію клітин (цитопластів) забарвлю

ють також флуоресцентними бісимідазоловими барвниками

фірми Hoechst; флуоресціюючі цитопласти виділяють методом

сортування у потоці за допомогою клітинного сортера. Чистота

фракції цитопластів досягала 99,7 %, а 90 % отриманих після сор

тування цитопластів мають здатність до включення

Нлейцина.

ЧастинаI.Заальнабіотехнолоія

104

Маркіровані тим чи іншим способом цитопласти зливають

ся з цілими клітинами, також попередньо позначеними флуо

ресціюючим барвником, що відрізняється за кольором від бар

вника, який був використаний для позначення енуклейованих

клітин (цитопластів); співвідношення цитопластів і цілих клі

тин при одержанні цибридів — 3:1. Як агент, індукуючий процес

злиття цитопластів і цілих клітин, використовують поліетилен

гліколь (ПЕГ 1000), диметилсульфоксид чи інактивований ві

рус Сендай. Продукти злиття (цибриди) мають двоколірну

флуоресценцію. Їх виділяють за допомогою потокового клітин

ного сортера FACS ІІ, оснащеного аргоновим лазером, при

довжині хвилі 488 нм і постійному виході 100 мВт. Шланги сор

тера, через які здійснюється подача зразка, стерилізуються

70 %ним етанолом, а несуча рідина для стерилізації пропуска

ється через бактеріальні фільтри (Millipore, пори 0,22 мкм).

Якщо в клітинній суспензії після злиття цитопластів і цілих

клітин було багато грудок, їх диспергують, пропускаючи через

наконечник (діаметр 70 мкм) клітинного сортера.

Вихід фракції цибридів після проведеного сортування виз

начають, зливаючи контрольні цитопласти, що є носіями гіпо

ксантифосфорибозилтрасферазної (ГФРТ

) активності, з фі

бробластами, отриманими від хворих на синдром Леша —

Ніхана (ГФРТ

–

). Через 20 годин після злиття клітини з двоко

лірною флуоресценцією (цибриди) при сортуванні зміщують на

покривні скельця, інкубують 20 годин із

Нгіпоксантином, фік

сують і досліджують радіоавтографічним методом. Включення

гіпоксантину в цибридну фракцію показує, що за допомогою ві

русу Сендай не менш 90 % клітин, які пройшли сортування,

можна віднести до справжніх цибридів (ГФРТ

Для визначення активності ферментів і концентрації суб

стратів у надто малому об’ємі матеріалу (5–10 тис. цибридів) бу

ли розроблені мікрометоди, засновані на застосуванні флуори

метрії, що дозволяють виявити мікрограмові кількості речовин у

незначних кількостях ліофілізованих клітин. Ультрамікроме

тод, заснований на проведенні мікрофлуориметрії, дає можли

вість вимірювати активність ферментів навіть в поодиноких клі

тинах. За допомогою цих методів з’явилася можливість вивчати

комплементацію ферментів у цибридів чи інших клітин, а також

з’ясувати роль ядра і цитоплазми в механізмі комплементації.

Розділ4.Клітиннаінженерія

105

4.4. БІОТЕХНОЛОГІЯ ПЕРЕНЕСЕННЯ ГЕНІВ

У СОМАТИЧНІ КЛІТИНИ ЗА ДОПОМОГОЮ

МЕТАФАЗНИХ ХРОМОСОМ

Можливість перенесення чужорідної генетичної інформації

в соматичні клітини тварин за допомогою метафазних хромо

сом була доведена МакБрайдом О.У. та Озером Х.Л. (1973).

Отримані результати перенесення генів, що кодують тимідинкі

назу і гіпоксантинфосфорибозилтрансферазу, у соматичні клі

тини за допомогою метафазних хромосом були підтверджені

дослідами in vitro іншими дослідниками (рис. 4.2).

ЧастинаI.Заальнабіотехнолоія

106

Рис. 4.2. Схема перенесення генів у соматичні клітини з допомо<

гою метафазних хромосом

(за Серовим О.Л., 1985)

З генетичного матеріалу, носіями якого є окремі ізольовані

хромосоми, можливе створення «бібліотек» рекомбінантних

ДНК. Цей прийом може бути використаний як для картування

генів, так і для їхнього виділення. Спроможність методу ізольо

ваних хромосом, який використовують для проведення карту

вання, перевершує метод гібридизації соматичних клітин, але

поступається за обсягом і глибиною інформації, що одержують

за допомогою прийомів конструювання рекомбінантних ДНК.

Ізольовані хромосоми були використані для картування гена

α−глобіну людини. Отримані цим методом результати узгоджу

ються з раніше установленим фактом локалізації гена αглобіну

в хромосомі 16. Щоб широко використовувати метод ізольова

них хромосом у вирішенні різноманітних проблем біології і

пов’язаних з її досягненнями прикладних наукових напрямів

(від вивчення механізмів генної регуляції до проблем медицини

і галузей сільського господарства), необхідно мати достатній

набір селективних середовищ. Для кожної хромосоми потрібні

селектовані маркери такої специфічності і доступності, як для

виділення трансформантів (трансформанти — це клітини чи

клітинні клони, у яких міститься перенесений за допомогою ме

тафазних хромосом генетичний матеріал). Чужорідний гене

тичний матеріал, перенесений у реципієнтні клітини, нази

вається трансгеном. Якщо обсяг цього матеріалу такий, що його

присутність у реципієнтній клітині визначається цитогене

тичним шляхом, говорять про макротрансгеном. Мікротрансге

ном — це та кількість перенесеного за допомогою метафазних

хромосом генетичного матеріалу, що цитогенетичним шляхом

установити неможливо. При цьому варто мати на увазі, що така

хромосома людини, як 16, містить ген, який кодує аденінфосфо

рибозилтрансферазу, 17ген, що кодує тимідинкіназу, і Ххро

мосома — ген, що кодує гіпоксантинфосфорибозилтрансферазу.

Перенесення генетичного матеріалу в реципієнтні клітини є

багатоступінчастим процесом. Для одержання великої кількості

мітотичних клітин їх затримують у стадії мітозу (синхронізація

клітин), а потім виділяють метафазні хромосоми, суспензією

яких обробляють реципієнтні клітини. Наступна стадія — виді

лення, розмноження й аналіз трансформантів (ідентифікація

ознаки донорського геному в трансформантах). Джерелом мета

Розділ4.Клітиннаінженерія

107

фазних хромосом (донорські клітини) найчастіше є фібробла

сти первинних культур чи фібробластоподібні клітини первин

них ліній клітин жаби, китайського хом’ячка, миші, пацюка, лю

дини, генотип яких відноситься до дикого типу. Еукаріотичні

клітини, у яких з донорських клітин за допомогою метафазних

хромосом переноситься генетичний матеріал (реципієнтні клі

тини), є мутантними лініями. У їхніх клітинах не реалізується

гіпоксантинфосфорибозилтрансферазна, тимідинкіназна, аде

нозинфосфорибозилтрансферазна, аргінінсукцинатсинтетазна

активність. Про перенесення, що відбулося, макро чи

мікротрансгенома з донорської в реципієнтну клітину свідчить

встановлення в останній раніше відсутньої ферментативної ак

тивності і здатності цих клітин рости на відповідних селектив

них поживних середовищах. Перенесений з донорських клітин,

що є носіями таких кодуючих генами властивостей, як рези

стентність до високих концентрацій метатрексата, що виступає

як інгібітор дегідрофолатредуктази, а також таких ознак злоя

кісності, як здатність рости на агаровому середовищі або при

низьких концентраціях сироватки, генетичний матеріал у нор

мальних за цими ознаками реципієнтних клітинах обумовлює

індукування властивостей, притаманних донорським клітинам.

Це, з одного боку, підтверджує факт перенесення, що відбулося,

а з іншого — є прийомом вивчення морфології і біохімії хромо

сом.

Щоб досягти успіху в перенесенні генів за допомогою мета

фазних хромосом, насамперед необхідно одержати в моношаро

вій культурі велику кількість мітотичних клітин. Для цього ви

користовується прийом, що полягає в синхронізації клітин за

допомогою введення в середовище колхіцину чи колцеміду

(0,06 мкг/мл). Завдяки цьому прийому клітини затримуються

на стадії мітозу і в клітинній популяції кількість їх досягає

94–97 %. Зупинені на стадії метафази клітини моношарової

культури бувають слабко прикріплені до субстрату і при стру

шуванні легко відокремлюються від нього і спливають. Клітини

ссавців культивуються в культурі при температурі 37

С, а для

вирощування курячих клітин температуру доводять до 41

С.

Для виконання наступної операції (руйнування клітинної

мембрани) метафазні клітини поміщають у гіпотонічний роз

ЧастинаI.Заальнабіотехнолоія

108

чин. Висока ефективність руйнування клітинних мембран і

звільнення метафазних хромосом досягається при використан

ні гомогенізаторів типу Даунса чи шприців (5 мл) з тонкою гол

кою (№ 22), через яку пропускають клітинну суспензію. При

виконанні цих операцій використовується нейтральний буфер

ний розчин (pH 7), що складається з трисHCl (0,02 моль/л),

гексиленгліколю чи детергентів (тритон Х100, твін80), а для

стабілізації хромосом уводять іони Са

; Mg

. Усі операції ви

конуються в стерильних умовах.

Процедура руйнування клітин контролюється фазовокон

трастним мікроскопом. Перевага надається обережному руйну

ванню клітинних мембран, тому що при грубій процедурі виді

лення ушкоджуються не тільки клітинні мембрани, але й

хромосоми, структура яких надалі не відновлюється.

Контрольованим параметром при виділенні метафазних

хромосом є температурний режим. Відокремлені тим чи іншим

способом синхронізовані мітотичні клітини інкубуються у сві

жому середовищі при 4

С, що приводить до інактивації трипси

ну, розчинення можливих залишків колцеміду і спонтанного

руйнування тих мікротрубочок, що збереглися після обробки

колцемідом. Це знижує здатність хромосом до агрегації і змен

шує їхнє забруднення. Наступне центрифугування клітинної

суспензії, видалення надосадової рідини пастерівською піпет

кою і відмивання осаду нейтральним буферним розчином про

водяться при 4

С. Утворений після чергового центрифугуван

ня осад ресуспендують в охолодженому буферному розчині й

інкубують 10–15 хв на водяній бані при 37

С. Операції з руйну

вання клітин і звільнення метафазних хромосом здійснюються

при температурі 37

С і проводяться якнайшвидше. Для наступ

них етапів перенесення хромосом необхідна низька температу

ра (4

С). Кислі буферні системи при одержанні метафазних

хромосом використовують рідше, тому що висока концентрація

іонів водню в поєднанні з двовалентними катіонами сприяє

агрегації залишків цитоплазми, що заважає одержанню чистих

препаратів хромосом.

Щоб уникнути забруднення ізольованих метафазних хромо

сом інтерфазними ядрами і незруйнованими клітинами, прово

дять цитологічний аналіз отриманих препаратів. У препаратах

Розділ4.Клітиннаінженерія

109