Герасименко В.Г., Герасименко М.О., Цвіліховський М.І. та ін. Біотехнологія

Подождите немного. Документ загружается.

ізольованих хромосом, вільних від забруднюючих компонентів,

відношення білок : ДНК дорівнює 2,2, а РНК : ДНК — менше 0,1;

ізольовані метафазні хромосоми при температурі 5

С витриму

ють тривале зберігання без будьяких помітних змін морфоло

гічних властивостей, хоча молекулярна маса хромосомної ДНК

неухильно зменшується, що, очевидно, є наслідком забруднення

препаратів хромосом ендонуклеазами. Тому для перенесення

генів, як правило, використовують метафазні хромосоми, що

містять високополімерну ДНК з молекулярною масою не менше

100 млн., відразу після їхнього виділення.

Клітиниреципієнти на стадії логарифмічного росту обро

бляють концентрованою суспензією очищених метафазних хро

мосом. Відношення кількості донорських хромосом, що дода

ються, до кількості хромосом, що містяться в геномі

реципієнтних клітин, складає 1:1. В експериментах за звичай

використовується 5–10 млн реципієнтних клітин.

Частота перенесення селектованого генамаркера ГФРТ ки

тайського хом’яка в клітини миші складає 10

7

–10

6

у перерахунку

на одну реципієнтну клітину. Для збільшення частоти перене

сення генів до суспензії метафазних хромосом у нейтральному

фосфатному буфері додають таку кількість хлористого кальцію,

щоб його кінцева концентрація досягла 0,125–0,250 М. Відбу

вається спільне осадження фосфату кальцію і метафазних хро

мосом. При додаванні їх до моношару реципієнтних клітин пі

двищується ефективність перенесенню функціонального гена в

10 разів, а сполучення описаного методу з наступною інкуба

цією моношару реципієнтних клітин у середовищі з 7–10 %

кінцевою концентрацією диметилсульфоксиду підвищує ефек

тивність перенесення генів у 100 разів. Використання інактиво

ваного вірусу Сендай при інкубуванні реципієнтних клітин, що

знаходяться на стадії метафази, із суспензією донорських хро

мосом, підвищує ефективність перенесення приблизно в 10 ра

зів, а укладення ізольованих метафазних хромосом у штучну лі

підну мембрану дозволяє довести ефективність перенесення до

5

з розрахунку на одну реципієнтну клітину.

Як уже було зазначено, реалізація потенційних можливо

стей методу перенесення метафазних хромосом у реципієнтні

клітини значною мірою гальмується через труднощі, що вини

ЧастинаI.Заальнабіотехнолоія

110

кають при їхній ідентифікації. В останні роки запропоновані ме

тоди, що дозволили значно підвищити об’єктивність ідентифі

кації хромосом. Серед цих методів варто назвати послідовне ди

ференціальне фарбування хромосом за Гімза й акрихіном на

G/Qсмуги; поділ ізольованих метафазних хромосом на групи

за їх розмірами при центрифугуванні в градієнті сахарози. Для

масового виділення однотипних хромосом пропонується вико

ристання методу фракціонування в градієнті щільності з на

ступним сортуванням отриманої фракції методом проточної ци

тометрії. Отриманий таким шляхом хромосомний матеріал

призначений для подальшого використання в біологічних екс

периментах. Фракція, збагачена після центрифугування в граді

єнті сахарози однотипними хромосомами, потім сортується ме

тодом проточної цитометрії, що значно підвищує ефективність

цього прийому сортування.

У каріотипі більшість хромосом незначно розрізняються за

кількістю ДНК, а використовувані для проточного цитометрич

ного сортування стандартні прилади не можуть ідентифікувати

хромосоми, що розрізняються за вмістом ДНК менш ніж на

3–5 %. У зв’язку з цим можна виділити не індивідуальні хромо

соми, а їхні основні групи. Так, каріотип людини цим шляхом

розділяється на хромосомні групи А, B, C, D, E, F, і G. Збільшен

ня можливості методу проточної цитометрії до 1 % рівня роз

ходжень, що виявляються у хромосомах у вмісті ДНК, дозволяє

при аналізі 24 хромосом людини одержати вже не 7, а 18 окре

мих піків.

Донорські хромосоми проникають у реципієнтні клітини

завдяки фагоцитозу. Є дані, які свідчать про те, що метафазні

хромосоми потрапляють у ядро реципієнтних клітин у недегра

дованому стані і що ці хромосоми в геномі реципієнтної кліти

ни можуть зберігатися тривалий час і мають здатність до авто

номної реплікації. Однак у лізосомах цитоплазми реципієнтних

клітин значна частина донорського хромосомного матеріалу де

градує на стадії проникнення.

Результати біохімічного і цитогенетичного аналізів тран

сформантів дозволяють говорити про два види трансформова

ного фенотипу. У випадку стабільного фенотипу перенесена оз

нака при рості трансформантів на неселективному середовищі

Розділ4.Клітиннаінженерія

111

зберігається протягом декількох тижнів чи місяців; нестабіль

ний фенотип при вирощуванні трансформованих клітин на не

селективному середовищі втрачається. В останньому випадку

незважаючи на те, що перенесений у рецепієнтну клітину гене

тичний матеріал метафазних хромосом знаходиться у ядрі і ек

спресується, фізичний зв’язок його з ядром відсутній. Крім то

го, нестабільний фенотип у популяції трансформованих клітин

губиться зі швидкістю 0,1–10 % і більше за клітинний поділ, що

також свідчить про незавершеність процесу трансформації.

При більшменш тривалому культивуванні клітини з неста

більним трансформованим фенотипом поступово переходять у

стабільні трансформанти. Дані про можливість переходу сфор

мованого стабільного фенотипу в нестабільний у літературі не

наводяться. Що стосується процесу формування стабільного

трансформованого фенотипу, то є підстави говорити про вклю

чення донорського генетичного матеріалу в хромосоми реципі

єнтних клітин з одночасним зменшенням обсягу перенесеного в

реципієнтні клітини генетичного матеріалу (обсяг цього матері

алу коливається від 1 % (макротрансгеном) до 0,07–0,8 % (мік

ротрансгеном) і залежить від багатьох факторів).

Один із провідних спеціалістів щодо перенесення генів за

допомогою метафазних хромосом Сєров О.Л. (1985) вважає, що

вивчення таких питань, як механізм включення донорського ге

нетичного матеріалу в геном реципієнтної клітини і механізм

клітинної компетенції до трансформації, дозволить за допомо

гою спрямованого введення генетичного матеріалу здійснювати

значні зміни фенотипу реципієнтних клітин.

4.5. БІОТЕХНОЛОГІЯ ПЕРЕНЕСЕННЯ ГЕНІВ

У ЕУКАРІОТИЧНІ КЛІТИНИ ЗА ДОПОМОГОЮ ДНК

(ДНК<ТЕХНОЛОГІЯ)

Для перенесення генів у соматичні клітини використову

ють як тотальну ДНК, отриману шляхом очищення препаратів

ДНК зі сперми лосося, або ДНК з клітинних ліній найчастіше

миші, китайського хом’ячка і людини, так і клоновані гени. При

трансформації соматичних клітин, що ростуть у культурі, і му

ЧастинаI.Заальнабіотехнолоія

112

тантних ліній, створених на основі клітинних культур, препара

тами сумарної ДНК і клонованими генами в більшості випадків

як донорські маркерні гени використовуються ТК, НРRT,

APRT і DFR, що кодують відповідно ферменти ТК (тимідинкі

назу), ГФРТ (гіпоксантинфосфорибозилтрансферазу), АФРТ

(аденінфосфорибозилтрансферазу) і ДФР (дегідрофолатредук

тазу). Таким чином, для трансформації клітин ссавців у культу

рі необхідне джерело донорської ДНК, середовище з придатним

буфером і маркіровані реципієнтні клітини і (чи) придатне се

лективне середовище для рідких трансформантів.

При обробці клітинної культури препаратами екзогенної

ДНК трансформується приблизно одна з мільйона чи одна з

100 мільйонів (10

6

–10

8

) реципієнтних клітин. Одночасно вар

то нагадати, що частота трансформації соматичних реципієнт

них клітин при використанні як вектора метафазних хромосом

була, як правило, на одиндва порядки вищою. Вирішальне зна

чення для досягнення високої частоти трансформації соматич

них клітин екзогенної ДНК мають джерело високомолекуляр

ної ДНКносія, належним чином забуферене середовище і стан

свіжовисіяних реципієнтних клітин.

В експериментах з трансформації як донорську зазвичай

використовують отриману із соматичних клітин ДНК, розміри

якої перевищують 100 кb, а оптимальною вважається концен

трація 500 мкг/мл.

Для підвищення ефективності трансформації Сєров О.Л.

(1985) пропонує обробляти DЕАЕдекстраном препарати очи

щеної вірусної ДНК, що підвищує стійкість останньої до темпе

ратурної денатурації, гідролітичної дії ДНКази, що міститься в

реципієнтній клітині. Це в остаточному підсумку обумовлює пі

двищення ефективності трансформації. В останні роки сторазо

вого підвищення ефективності трансформації удалося досягти

за рахунок обробки культури соматичних реципієнтних клітин

ДНКкальційфосфатним комплексом (преципітатом). Успіх

трансформації залежить від реакції середовища, при якій відбу

вається осадження екзогенної ДНКкальційфосфатним преци

пітатом, від концентрації ДНК, узятої для утворення комплексу,

від обробки реципієнтних клітин диметилсульфоксидом, трива

лості інкубації в культурі соматичних реципієнтних клітин з

Розділ4.Клітиннаінженерія

113

кальційфосфатним преципітатом ДНК. Деякі з перерахованих

параметрів не мають універсального трансформуючого ефекту,

а збільшують число трансформованих реципієнтних клітин

тільки стосовно конкретних клітинних ліній.

Схеми добору для рецесивних і домінантних генів різні.

ДНКкальційфосфатний преципітат проникає в реципієнтну

клітину в результаті адсорбції комплексу на поверхні клітинної

мембрани і активного фагоцитозу, що відбувається в перші го

дини інкубації кальційфосфатного преципітату ДНК реципі

єнтними клітинами. При цьому встановлено, що адсорбція та

фагоцитоз є енергозалежними процесами і при інгібуванні клі

тинного дихання вони пригнічуються. На першу годину інкуба

ції кальційфосфатний преципітат ДНК виявляється на цито

плазматичній мембрані, потім у вакуолях цитоплазми, а через

8 год після початку інкубації невелика частина екзогенної до

норської ДНК досягає ядра реципієнтних клітин, що знаходять

ся у культурі. На всіх етапах проникнення в клітину екзогенна

ДНК залишається зв’язаною з кальційфосфатним преципіта

том, а розміри і структура донорської ДНК у клітиніреципієн

ті зберігаються протягом 24 год з моменту початку інкубації.

Перенесення генів у складі сумарної ДНК у реципієнтні со

матичні клітини можливе за допомогою таких переносників, як

ліпосоми (фосфоліпідні пухирці) чи тіні еритроцитів, у які по

передньо поміщають тим чи іншим способом виділений препа

рат нуклеїнової кислоти. Цим способом можна одержати біль

шу кількість трансформованих соматичних клітин, ніж при

перенесенні ДНК іншими методами. Крім того, трансформація

реципієнтних клітин препаратами сумарної ДНК, попередньо

укладеної в ліпосоми, відрізняється порівняною простотою.

Ліпосоми мають слабку токсичність, вони здатні захищати

нуклеїнові кислоти, що знаходяться всередині й інші макромоле

кули від деградації. Немає істотних обмежень на виготовлення

ліпосом таких розмірів, що дозволили б укласти в них біополіме

ри з молекулярною масою, що коливається в широких межах (від

очищених генів до хромосом). Для забезпечення вибіркової спо

рідненості до певних реципієнтних клітин і збільшення здатності

приєднувати до мембран певних клітинних популяцій поверхні

ліпосом можна модифікувати за допомогою гліколіпідів, лекти

114

ЧастинаI.Заальнабіотехнолоія

Розділ4.Клітиннаінженерія

115

нів або ковалентно зв’язаних антитіл. Висловлюється думка, що

використання ліпосом для введення ДНК підвищує ефектив

ність трансформації соматичних клітин і дозволяє проводити

дослідження з трансформацією тих клітин, для яких інші спосо

би перенесення ДНК неприйнятні.

З відомих методів виготовлення ліпосом найбільш придат

ним для перенесення сумарної ДНК у реципієнтні соматичні

клітини є метод випарювання з оберненням фаз, коли в ліпосо

ми може включатися ДНК масою 10

дальтон. З метою підви

щення ефективності перенесення ДНК ліпосомами в соматичні

клітини використовують диметилсульфоксид, етиленгліколь,

гліцерол, поліетиленгліколь. Остання з названих речовин пі

двищує здатність ДНК, що знаходиться в ліпосомах, трансфор

мувати реципієнтні клітини в 10 разів, однак ще більш ефектив

ними є помірні концентрації гліцеролу, у якому витримуються

клітини після їхнього контакту з ліпосомами. Є дані про те, що

екзогенна ДНК вірусу SV40, поміщена в негативно заряджені

ліпосоми, виявляється на три порядки інфекційнішою, ніж у

випадку її включення в нейтральні ліпосоми. Що стосується ди

наміки процесу, то найбільш ефективна трансформація сома

тичних клітин ДНК, укладеної в ліпосоми, відбувається в перші

30 хв інкубації. Є також приклади, що свідчать про високу ефек

тивність трансформації рослинних протопластів препаратами

очищеної ДНК Тіплазміди, укладеної в ліпосоми.

В останні роки успішно розробляється питання про компе

тенцію до трансформації препаратами екзогенної ДНК реципі

єнтних соматичних клітин, що знаходяться у культурі. Перекон

ливі приклади свідчать, з одного боку, про генетичну природу

високої компетенції клітин до трансформації, з іншого — показу

ють, що ефективність перенесення екзогенної ДНК залежить

від фізіологічного стану реципієнтних клітин, їхньої тканинної

природи і диференціації.

Перенесення клонованих і очищених генів у сома<

тичні клітини. При вивченні процесу трансформації сома

тичних і статевих клітин Сєров О.Л. найчастіше використову

вав клонований ген ТК вірусу герпеса (Herpes simplex), для чого

обробляв геномну ДНК вірусу рестрикційними ендонуклеаза

ми Hpal і BamHI. Отримані в результаті ферментативного

гідролізу фрагменти ДНК, які містять 8,3 тис. і 3,4 тис. пар ну

клеотидних послідовностей, включають ген ТК; іРНК, що утво

рюється при транскрипції інтактного гена ТК вірусу герпеса,

являє собою послідовність, що складається майже з 1,3 тис. за

лишків нуклеотидів. Крім того, було встановлено, що при біо

синтезі ферменту тимідинкінази 107нуклеотидна ділянка, по

чинаючи від 5

кінця, іРНК не транслюється. Фрагменти

геномної ДНК вірусу герпеса, що включають ген ТК, клонують,

використовуючи як вектор плазміди і фаги.

Трансформацію соматичних і статевих клітин геном ТК

здійснюють за допомогою рекомбінантних ДНК, сконструйова

них шляхом вбудовування фрагментів ДНК вірусу герпеса, що

містять ген, який кодує тимідинкіназу. Щоб збільшити ефек

тивність трансформації, соматичні чи статеві клітини обробля

ють очищеними чи клонованими генами шляхом осадження до

норської ДНК кальційфосфатним методом. У цьому випадку

вдається домогтися введення очищеного або клонованого гена в

одну з кожних 10

–10

оброблених реципієнтних клітин.

Більш ефективним у порівнянні з описаним методом пере

несення генів є введення мікроголкою ДНК, що знаходиться в

розчині, у ядра реципієнтних клітин. У цьому випадку тран

сформується 50–100 % оброблених клітин. Така ж частота тран

сформації досягається й у тому випадку, коли ядро тільки про

колюється мікроголкою. ДНК, що представляє очищений чи

клонований ген, у цьому випадку не вводиться безпосередньо в

ядро, а використовується для обробки клітин ссавців, що знахо

дяться в культурі. З інших методів, за допомогою яких перено

сяться клоновані чи очищені гени в соматичні реципієнтні

клітини ссавців, варто вказати на можливість обробки реципі

єнтних клітин включеними в ліпосоми препаратами ДНК чи

високими концентраціями поліетиленгліколю; в останньому

випадку вдається домогтися частоти трансформації, порівняної

з показником, досягнутим при застосуванні методу мікроін’єк

ції розчину ДНК у ядро реципієнтної клітини.

Варто також звернути увагу на метод котрансформації,

який набуває широкого розповсюдження при введенні в реципі

єнтні клітини чужорідних неселектованих генів чи фрагментів

ДНК. Розробляється також спосіб трансформації реципієнтних

ЧастинаI.Заальнабіотехнолоія

116

клітин за допомогою електричного розряду в полі високої на

пруги.

Якщо при трансформації як донорський використовується

очищений або клонований ген, що кодує тимідинкіназу, то реци

пієнтними є мутантні клітини, які знаходяться в культурі, у гено

мі котрих відсутній ген ТК, а для поділу трансформованих і

нетрансформованих клітин використовують селективне середо

вище ГАТ (рис. 4.3). Трансформовані геном ТК реципієнтні клі

тини здатні рости на середовищі ГАТ, нетрансформовані — ги

нуть. Істотний вплив на частоту перенесення клонованого гена

ТК вірусу герпеса в еукаріотичні реципієнтні клітини робить

наявність чи відсутність ДНКносія. Трансформація клонова

ним геном ТК вірусу герпеса реципієнтних клітин китайського

хом’ячка без ДНКносія виявилася більш ніж у 200 разів ниж

чою порівняно з дослідами, у яких клонований ген ТК вірусу

герпеса в реципієнтні клітини переносили за участю ДНКно

сія. Роль ДНКносія, на думку дослідників, полягає в захисті

Розділ4.Клітиннаінженерія

117

Рис.4.3. Схема експериментів по трансформації соматичних

клітин з допомогою ДНК

(за Шибальською Є. та Шибальським В., 1982)

клонованого чи очищеного гена, що переноситься, від деградую

чого впливу гідролітичних ферментів реципієнтних клітин. Ус

піх введення очищених чи клонованих генів у соматичні клітини

за допомогою кальційфосфатного методу значною мірою зал

ежить від концентрації донорської ДНК. Хоча чимало механіз

мів участі ДНКносія в забезпеченні успіху трансформації реци

пієнтних клітин очищеним чи клонованим генетичним

матеріалом, а також роль ДНКносія у формуванні трансгенома

залишаються нез’ясованими, факт зміни структури очищених чи

клонованих генів, введених у реципієнтні клітини в присутності

ДНКносія, вважається установленим. Установленим, мабуть,

варто вважати також те, що структурні зміни екзогенного клоно

ваного генетичного матеріалу при формуванні трансгенома спо

стерігаються лише в тому випадку, якщо одночасно в реципієнт

ну клітину надходить ДНКносій. Роль останньої полягає в

тому, що структурні зміни, яким піддаються селектовані гени від

подальшої деградації захищаються ДНКносієм шляхом вклю

чення селектованого генетичного матеріалу в структуру ДНК

носія і створення трансгенома, що має нові властивості. За від

сутності ДНКносія селектовані гени, в яких під впливом в

основному ферментативної дії клітинреципієнтів відбулися

структурні зміни, елімінують, а в реципієнтній клітині залиша

ються введені інтактні очищені чи клоновані гени.

У зв’язку з цим у трансформованих клітинах одночасно мо

жуть знаходитися інтактні молекули екзогенної ДНК і молеку

ли ДНК, в яких відбулися структурні зміни. Трансформовані за

допомогою сумарної ДНК реципієнтні клітини характеризують

ся фенотипом, що може мати стабільний чи нестабільний прояв.

Є дані, які свідчать про те, що стабілізація трансформованого

фенотипу є наслідком ампліфікації донорського гена чи вклю

чення цього гена в геном реципієнтної клітини, хоча поряд з цим

є можливість функціонування механізмів, що перешкоджають

включенню екзогенної ДНК у геном клітиниреципієнта.

Появу стабільних трансформантів спостерігали при інте

грації донорського генетичного матеріалу, у тому числі ДНК

клонованих генів, у хромосоми реципієнтних клітин, що приво

дило до дестабілізації останніх і виникнення у зв’язку з цим ве

ликої кількості хромосомних перебудов. В утворених у резуль

ЧастинаI.Заальнабіотехнолоія

118

Розділ4.Клітиннаінженерія

119

таті інтеграції донорських генів, введених у геномний матеріал

реципієнтних клітин як за допомогою тотальної ДНК, так і очи

щених чи клонованих генів, у стабільних трансформантах через

їхню нестійкість настає процес дестабілізації. Цей процес не

завжди є наслідком втрати інтегрованого донорського гена, іно

ді змінюється експресія донорського гена, у зв’язку з чим тран

сформований фенотип не реалізується.

Взаємозв’язок між станом трансгеному (стабільне — неста

більне), частотою інтеграції донорського генетичного матеріалу

в геном реципієнтної клітини і частотою порушення стабільно

сті трансгеному в стабільних трансформантах, з одного боку, та

ступенем диференціації і станом каріотипу реципієнтних кліти

ни — з іншого, прослідковується досить чітко. Так, лінії реципі

єнтних клітин, що мають змінені гетероплоїдні каріотипи

(фібробластоподібні клітини), здатні зберігати у своїх геномах

донорський генетичний матеріал, що автономно реплікується, з

нестабільним трансформованим фенотипом і дестабілізувати

трансформований фенотип у стабільних клонах. Навпаки, у ре

ципієнтних клітинах із близьким до нормального чи нормаль

ним каріотипом (статеві клітини) немає умов, що сприяють пе

ребуванню трансгеному в нестабільному автономному стані.

Тому при трансформації реципієнтних статевих клітин екзоген

ною ДНК спостерігається велика кількість стабільних тран

сформантів.

4.6. ВВЕДЕННЯ ГЕНІВ. БІОТЕХНОЛОГІЯ

ТРАНСФОРМАЦІЇ СТАТЕВИХ ЕМБРІОНАЛЬНИХ

КЛІТИН ЧУЖОРІДНИМИ ГЕНАМИ

Успіхи молекулярної біології, генетичної і клітинної інже

нерії дозволили вже сьогодні вирішувати питання спрямованої

трансформації еукаріотичних організмів, у тому числі ссавців.

Стратегічна мета спрямованої трансформації: конструювання

геномів вищих організмів (рослин і тварин). Одним із прийомів

генетичної і клітинної інженерії є введення генів у статеві клі

тини. Внаслідок трансформації статевих клітин відбуваються

фенотипічні зміни трансформанта на рівні усього організму, а